Summary
탯줄 코드는 여러 가지 방법으로 부드러운 근육 세포를 분리하는 데 사용됩니다. 이 작품에서 우리는 고립 평활근 세포에 효소 처리를 사용합니다.
Abstract
인간의 탯줄 (UC)는 쉽게 바로 출산 후 얻을 수있다 생물 학적 샘플입니다. 이것은 생물 학적 샘플, 대부분의 시간이다 삭제하고 컬렉션은 신생아지나 어머니의 건강에 어떠한 추가 위험을 의미하지는 않습니다. 또한 아무런 윤리적 문제가 제기되지 않습니다. UC 한 정맥 내피 세포와 모두있는 (내장 컴퓨터) 2 동맥에 의해 구성되어있다
Protocol
- 동맥은 3~7cm의 UC 작품에서 얻을 수 있습니다.
- 동맥을 둘러싸는 와튼의 젤리는 신중하게 가위로 절단하여 제거되었습니다.
- 0.6 - 1mm의 외경의 무딘 엔드 바늘은 해부 동맥의 한쪽 끝을에서 7mm에 대해 삽입했다.
- 혈관 내부에 남아있는 혈액을 제거하려면 동맥은 수직으로 개최 약 20-40 ML, 생리 생리 식염수 (PSS)와 perfused, 바늘에 연결된 20 ML 주사기를 사용하고 있습니다. 필요한 경우,이 세척 단계는 여러 번 반복되었다.
- 동일한 절차는 태아 소 혈청 (FBS)의 10 %를 보충 RPMI 1640을 사용하여 반복했다.
- 혈관 중 하나는 말단는 폐쇄되었습니다. 10 ML 주사기는 바늘에 연결되고 collagenase 유형 I (행크의 버퍼 소금 솔루션 (HBSS) 800 단위 / ML) 3 ML과 perfused했다. 그럼 다른 extremityof은 혈관도 폐쇄되었습니다.
- 인산은 37 15 분 ° C 동요와 대한 생리 식염수 (PBS)를 버퍼로 배는 incubated되었습니다.
- 선박의 끝을는 무료 SMCs를 수집하기 위해 상처 나서. 동맥은 5 FBS의 %와 50 ML 튜브에 항생과 보충 DMEM - F12의 약 20-40 ML과 perfuse되었습니다.
- 튜브는 상온 (250g, 8 분)에서 centrifuged되었고, 세포 펠렛은 FBS의 5 %를 보충 DMEM - F12 5 ML에 resuspended되었습니다.
- 세포 현탁액은 T - 플라스크 콜라겐 - 코팅에 전송하고 37 incubated되었습니다 ° C, 5 % CO 2 humidified 분위기에 따라.
- 5 16 H, 비 점착 성의 세포와 세포 drebis이 제거되었습니다 후 37 문화 매체의 5 ML이 추가되었으며 세포 incubated되었습니다 ° C, 5 % CO 2 humidified 분위기에 따라.
- SMCs가 합류에 도착할 때까지 세포 배양 매체는 2 3 일마다 변경되었습니다.
- 세포가 합류를 획득 후 그들은 두 개 또는 세 25cm 2 T - flasks에 씨앗을 품고 있었다.
대청소
- 샵스 컨테이너에서 바늘 폐기.
- 큰 생물 학적 주사기 용기에 배출.
- 작은 생물 학적 가방에 모든 조직을 넣어. -20에서 가방과 동결을 닫고 ° 소각까지 섭씨.
- 적어도 10 분 virucide의 모든 악기를 만끽해보세요.
- 냉장고에 사용되지 않은 미디어를 반환합니다.
- 생물 학적 폐기물의 장갑 폐기.
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Discussion
SMC는 분리, 압축시키는 것 약품과 함께 미래를 assays를위한 모델로 사용 구조적, L - 타입 칼슘 채널을 특징 혈관 기능의 세포 및 분자 측면을 연구하고 조직 공학을 사용하실 수 있습니다. SMCs 및 내장 컴퓨터가 인간에 사용되는 세미 합성 혈관의 생산에 사용될 수있는 새로운 biomaterials의 발전을위한 기본입니다.
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Acknowledgments
병원 아마토 루시타노, 카스텔루 브랑쿠 포르투갈.
병원 수사 마틴스, Guarda 포르투갈.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
