Summary
गर्भनाल के लिए अलग अलग तरीकों से चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को अलग किया जाता है. इस काम में हम पृथक चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं enzymatic उपचार का इस्तेमाल किया.
Abstract
मानव गर्भनाल (यूसी) के एक नमूना जैविक है कि आसानी से जन्म के बाद ही प्राप्त किया जा सकता है. यह नमूना जैविक है, ज्यादातर समय, त्याग और उनके संग्रह के किसी भी जोड़ा नवजात शिशु या माँ के स्वास्थ्य के लिए जोखिम संकेत नहीं करता है. इसके अलावा कोई नैतिक चिंताओं को उठाया जाता है. UC एक नस और दो धमनियों जिसमें से दोनों endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) से बना है
Protocol
- धमनियां 3-7 सेमी की UC टुकड़े से प्राप्त कर रहे हैं.
- व्हार्टन जेली कि धमनियों के चारों ओर ध्यान से यह कैंची से काटने के द्वारा हटा दिया गया था.
- 0.6-1mm की एक बाहरी व्यास के एक कुंद अंत सुई 7mm बारे में dissected धमनियों के एक छोर से सम्मिलित किया गया था.
- वाहिकाओं के अंदर शेष रक्त निकालने के लिए, धमनियों खड़ी है और आयोजित कर रहे हैं के साथ, लगभग 20 से 40 एमएल, शारीरिक नमकीन घोल (PSS) से perfused, एक 20 - एमएल एक सुई से जुड़ा सिरिंज का उपयोग कर. यदि आवश्यक हो, इस धोने कदम कई बार के लिए दोहराया गया था.
- उसी प्रक्रिया 1640 RPMI भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 10% के साथ पूरक का उपयोग कर दोहराया गया था.
- रक्त वाहिका का एक सिरा बंद कर दिया गया था. 10 एमएल सिरिंज सुई से जुड़ा था और collagenase प्रकार मैं (800 / हांक buffered नमक समाधान (HBSS) में इकाई एमएल) के 3 एमएल के साथ perfused. फिर दूसरे extremityof पोत भी बंद कर दिया गया था.
- पोत के साथ फॉस्फेट खारा (पीबीएस) 15 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस आंदोलन के साथ के लिए समाधान, buffered incubated था.
- बाद पोत के छोर मुक्त SMCs इकट्ठा करने के लिए काट रहे थे. धमनियों DMEM-F12 के लगभग 20 से 40 एमएल FBS के 5% और 50 एमएल ट्यूब के लिए एंटीबायोटिक के साथ पूरक के साथ perfuse थे.
- ट्यूब (250 ग्राम, 8 मिनट) कमरे के तापमान पर centrifuged था, और सेल गोली DMEM-F12 के 5 एमएल FBS के 5% के साथ पूरक में resuspended था.
- सेल निलंबन एक टी फ्लास्क कोलेजन - लेपित को हस्तांतरित किया गया था और 37 में incubated डिग्री सेल्सियस, एक 5% सीओ 2 humidified वातावरण के अंतर्गत.
- बाद 5 16 ज, गैर पक्षपाती कोशिकाओं और सेलुलर drebis हटा दिया गया है, संस्कृति के माध्यम से 5 एमएल जोड़ा था और 37 में कक्षों incubated रहे थे डिग्री सेल्सियस, एक 5% सीओ 2 humidified वातावरण के अंतर्गत.
- सेल संस्कृति मीडिया हर 2 3 दिन बदल गया था, जब तक SMCs संगम पर पहुंच गया.
- बाद कोशिकाओं संगम प्राप्त वे दो या तीन 25 2 टी बोतल सेमी में वरीयता प्राप्त थे .
सफाई
- Sharps कंटेनर में सुई को फेंक.
- बड़ा biohazard कंटेनर में सीरिंज की फेकें.
- एक छोटे से biohazard बैग में सभी ऊतक रखो. पर -20 जब तक जलाए जाने सेल्सियस बैग और स्थिर ° बंद.
- Virucide में कम से कम 10 मिनट के लिए सभी उपकरणों लेना.
- फ्रिज अप्रयुक्त मीडिया लौटें.
- Biohazard बेकार में दस्ताने को फेंक.
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Discussion
एसएमसी कंस्ट्रिकटर दवाओं के साथ भविष्य assays के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, अलग करने के लिए और structurally एल प्रकार कैल्शियम चैनल विशेषताएँ नाड़ी समारोह के सेलुलर और आणविक पहलुओं का अध्ययन करने और उन्हें ऊतक इंजीनियरिंग में उपयोग. SMCs और ईसीएस नए biomaterials कि अर्द्ध सिंथेटिक रक्त मानव में इस्तेमाल किया जा वाहिकाओं के उत्पादन में इस्तेमाल किया जा सकता है के विकास के लिए मौलिक हैं.
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Acknowledgments
अस्पताल Amato Lusitano, Castelo Branco पुर्तगाल.
अस्पताल Sousa मार्टिंस, Guarda पुर्तगाल.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
