Summary
Os cordões umbilicais são usados para isolar as células do músculo liso por caminhos diferentes. Neste trabalho utilizou-se o tratamento enzimático de células musculares lisas isoladas.
Abstract
O cordão umbilical humano (UC) é uma amostra biológica que pode ser facilmente obtida logo após o nascimento. Esta amostra biológica é, na maioria das vezes, descartada e sua coleção não implica qualquer risco acrescido para a saúde dos recém-nascidos ou a mãe s. Além disso há as questões éticas são levantadas. A UC é composta por uma veia e duas artérias do qual ambas as células endoteliais (CE)
Protocol
- Artérias são obtidos a partir de peças UC de 3-7 cm.
- Geleia de Wharton que envolve as artérias foi cuidadosamente removido, cortando-a com uma tesoura.
- Uma agulha sem corte-extremidade de um diâmetro externo de 0,6-1mm foi inserido cerca de 7 mm de uma extremidade das artérias dissecadas.
- Para remover o sangue restante no interior dos vasos, as artérias são verticalmente realizada e perfundidos com, aproximadamente 20 a 40 mL, solução salina fisiológica (PSS), usando uma seringa de 20 ml conectada a uma agulha. Se necessário, esta etapa de lavagem foi repetida por várias vezes.
- O mesmo procedimento foi repetido utilizando RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).
- Uma extremidade do vaso sangüíneo foi fechado. A seringa de 10 mL foi conectada à agulha e perfundidos com 3 mL de colagenase tipo I (800 unidades / mL em solução de Hank Sal Buffered (HBSS)). Em seguida, o extremityof outros o navio também foi fechado.
- O navio foi incubada com solução salina fosfato (PBS), por 15 min a 37 ° C com agitação.
- Após o término do navio foram cortadas para recolher o SMCs livre. As artérias foram perfundir com aproximadamente 20 a 40 mL de DMEM-F12 suplementado com 5% de SFB e antibióticos a um tubo de 50 mL.
- O tubo foi centrifugado à temperatura ambiente (250 g, 8 min) e pellet celular foi ressuspendido em 5 mL de DMEM-F12 suplementado com 5% de FBS.
- A suspensão celular foi transferida para um colágeno revestido T frasco e incubados a 37 ° C, sob uma atmosfera de 5% CO 2 umidificado.
- Após 5 16 h, as células não-aderentes e drebis celulares foram removidos, 5 mL de meio de cultura foi adicionado e as células foram incubadas a 37 ° C, sob uma atmosfera de 5% CO 2 umidificado.
- Os meios de cultura de células foi trocado a cada dois três dias, até que chegou SMCs confluência.
- Depois que as células atingiram confluência foram semeados em dois ou três 25 cm 2 T-frascos.
Limpeza
- Dispor de agulhas em recipiente adequado.
- Dispor de seringas em recipiente biohazard grande.
- Colocar todo o tecido em um pequeno saco de risco biológico. Feche o saco e congelar a -20 ° Celsius até a incineração.
- Mergulhe todos os instrumentos em virucide por pelo menos 10 min.
- Retorno de mídia não utilizados para geladeira.
- Dispor de luvas em resíduos de risco biológico.
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Discussion
O SMC pode ser usado como modelo para testes futuros com drogas constrictor, para isolar e caracterizar estruturalmente os canais de cálcio tipo L, para estudar os aspectos celulares e moleculares da função vascular e usá-los em engenharia de tecidos. SMCs e ECs são fundamentais para o desenvolvimento de novos biomateriais que podem ser usados na produção de semi vasos sanguíneos sintético para ser usado em humanos.
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Acknowledgments
Hospital Amato Lusitano, Castelo Branco Portugal.
Hospital Sousa Martins, Guarda Portugal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
