Summary
Пуповины используются для изоляции гладкомышечных клеток по-разному. В этой работе мы использовали ферментативный лечения изолированных гладкомышечных клеток.
Abstract
Человеческой пуповины (UC) является биологической пробы, которые могут быть легко получены сразу после рождения. Эта биологическая проба, большую часть времени, отбрасываются и их коллекции не предполагает какого-либо дополнительного риска для здоровья новорожденного или матери с. Кроме того никаких этических проблем подняты. UC состоит одна вена и две артерии, из которых как эндотелиальные клетки (ECS)
Protocol
- Артерии получаются из кусочков UC из 3-7 см.
- Желе Уортон, которая окружает артерий была тщательно удалены резки его ножницами.
- Тупой конец иглы внешним диаметром 0,6-1мм была вставлена около 7 мм от одного конца расчлененный артерий.
- Для удаления крови оставаясь внутри сосудов, артерий являются вертикально состоялся и озарен, примерно от 20 до 40 мл, физиологический раствор (PSS), используя 20-мл шприца, соединенного с иглой. При необходимости эту промывки повторялась несколько раз.
- Такую же процедуру повторяют с использованием RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
- Один оконечности кровеносный сосуд был закрыт. 10-мл шприц был связан с иглой и озарен 3 мл коллагеназы типа I (800 ед / мл в буферном солевом растворе Хэнка (HBSS)). Затем другие extremityof судна был также закрыт.
- Судно инкубировали с фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS), в течение 15 мин при 37 ° С при перемешивании.
- После концах судна были вырезаны, чтобы собрать свободные ГМК. Артерии были заливать примерно с 20 до 40 мл DMEM-F12 с добавлением 5% от FBS и антибиотиков для 50-мл трубки.
- Трубки центрифугировали при комнатной температуре (250 г, 8 мин), а клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл DMEM-F12 с добавлением 5% от FBS.
- Клеточная суспензия была передана коллагена покрытием T-колбы и инкубировали при 37 ° С, при 5% СО 2 влажной атмосфере.
- После 5 16 ч, не соблюдают клеток и клеточных drebis были удалены, 5 мл культуральной среде был добавлен и клетки инкубировали при 37 ° С, при 5% СО 2 влажной атмосфере.
- СМИ клеточной культуры меняли каждые 2 3 дня, пока не достигли слияния ГМК.
- После слияния клетки достигли они были посеяны на две или три 25 см 2 T-колб.
Уборка
- Утилизировать иглы в контейнере острых предметов.
- Утилизация шприцев в большой контейнер для биологически опасных.
- Положите все ткани в небольшой сумке биологической опасности. Закройте пакет и заморозить при -20 ° С до сжигания.
- Замочить всех инструментов в virucide по крайней мере 10 мин.
- Возврат неиспользованных средств массовой информации в холодильник.
- Утилизировать перчатки в биологически опасных отходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SMC может быть использована в качестве модели для будущих анализов с констриктор наркотики, чтобы изолировать и структурно охарактеризовать L-типа кальциевых каналов, изучать клеточные и молекулярные аспекты сосудистую функцию и использовать их в тканевой инженерии. ГМК и этике имеют основополагающее значение для разработки новых биоматериалов, которые могут быть использованы в производстве полусинтетических кровеносных сосудов, которые будут использоваться на людях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Больницы Амато Lusitano, Каштелу-Бранку Португалии.
Больницы Соуза Мартинс, Гуарда Португалии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
