Summary
Intratracheal instillations 직접 폐에 solutes을 제공합니다. 이 절차는 폐암의 말초 지역에 instillate의 전달을 대상으로하고, 따라서 종종 폐포를 공부하기위한 연구에 통합됩니다. 우리는 생쥐에서 intratracheal instillations을 수행하기위한 세부적인 생존 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
Intratracheal instillations 직접 폐에 solutes을 제공합니다. 이 절차는 폐암의 말초 지역에 instillate의 전달을 대상으로하고, 따라서 종종 폐포를 공부하기위한 연구에 통합됩니다. 우리는 생쥐에서 intratracheal instillations을 수행하기위한 세부적인 생존 프로토콜을 제공합니다. 이 방법을 사용, 하나는 말초 폐로 테스트 solutes 또는 고체의 제공 (예 : 폐 치료제, 계면 활성제, 바이러스, 작은 oligonucleotides)를 타겟팅할 수 있습니다. Tracheal instillations는 주로 상부 호흡기를 타겟으로하고 가능한 잠재적 유해 물질에 대한 조사에 노출될 수 있습니다 흡입 프로토콜을 통해, 원하는 방법 수 있습니다. 또한, tracheal 떨어뜨림 프로토콜을 사용하여, 동물 완전히 비침습 절차에서 복구할 수 있습니다. 이 같은 동물을 사용하여 시험 동물, 또는 다시 설치에 대한 후속 생리 측정을 만들기위한 수 있습니다. 폐에 소개 instillate의 금액은 신중하게 결정과 동물 복구를 보장하기 위해 osmotically 균형해야합니다. 일반적으로 30-75 μL instillate 볼륨 마우스 폐에 소개하실 수 있습니다.
Protocol
1. 마취
- isoflurane과 쥐를 Anesthetizing하면 intraperitaneally 마취 관리를하기 전에 동물의 처리와 구속을 촉진 수도 있습니다. 흡입 마취제를 사용하면 또는 특정 연구에 적합하지 않을 수 있습니다 수 있습니다 제안한 폐 연구에서 첫 번째 isoflurane 사용의 영향, 또는 다른 마취제를 결정합니다.
- isoflurane과 동물을 마취. 동영상은 산소와 혼합 2퍼센트 isoflurane에서 설정 isoflurane 기화기 챔버의 사용을 보여줍니다. 당신이 isoflurane 챔버가 없다면, 당신은 표준 또는 오픈 드롭 노출 기법을 사용하실 수 있습니다. 하단에 장착되어 와이어 메쉬와 벨 병 속에 쥐 (또는 다른 적절한 비 다공성 컨테이너)를 동봉. 메쉬 와이어 아래에 위치 거즈 패드하려면, 프로필렌 글리콜에 V / V isoflurane 30 % 혼합물을 적용합니다. 메쉬의 사용은 동물이 피부 자극 및 잠재 도달 했나봐을 일으킬 수있는 isoflurane - 절어 패드와 접촉하지 않도록 보장합니다. isoflurane에 짧은 노출 후, 동물은 anesthetized되어야하며 그릇이 스쳐 및 발가락 핀치 후 응답하지 않습니다 때 righting 반사와 응답하지 않습니다.
- Xylazine과 300ml의 혼합의 내부 복막 주사로 마취 더 마우스. (창자 또는 다른 중요한 장기의 일부가 침투되지 않은 것을 막기 위해 다시 그릴 intraperitoneal 주사를 수행할 때 그것은 좋은 연습입니다.) 0.9 % 멸균 인산의 8850 μL 1000 μL 케타민을 (100 MG / ML) 150 μL를 Xylazine (100 MG / ML) 혼합하면 (PBS) 살린 버퍼. 생쥐의 경우 복용량이 체중의 10 GM 당 약 80 μL 것입니다. 최종 농도는 10 밀리그램 / 킬로그램 Xylazine과 100 밀리그램 / 킬로그램 케타민을 것입니다. 동물 건조 유지 및 체온의 과도한 손실을 방지하기 위해 절연해야합니다. 안과 연고는 각막의 건조 방지하기 위해 눈에 적용할 수 있습니다.
2. 외과 영역의 준비
- 수술 절개가 이루어집니다 영역을 면도하지 않은 준비 지역에서 오염을 방지할 수 있습니다. 전기 면도기는 밀접한 동물에서 모피를 면도 있습니다. 면도 지역은 절개 사이트보다 큰해야합니다.
- 같은 나이르로 제모 크림의 후속 응용 프로그램, 모든 남아있는 모피를 제거합니다. 외과 영역에 제모 크림의 두꺼운 레이어를 적용하고 3 분에 둡니다. 젖은 수건으로 모피 및 제모 크림을 닦아. 10 분 초과에서 머리 제거 크림을 두지 마십시오.
- 무균 수술 영역을 준비, 70 % 알코올, 또는 대체 스크럽 솔루션을 사용합니다.
3. 수술
- sloped 수술 보드, 또는 직각 접근 금지 서에 anesthetized 동물을 놓습니다.
- 목 앞쪽에 (목 지역) 근처에 작은 절개를합니다.
- tracheal 반지를 시각화하고 액세스하기 위해 platysma과 앞쪽에 tracheal 근육을 멀리 해부하다.
- 일반적으로, intratracheal 사출 볼륨 무게 3 μl 당 그램 (약 30-75 μL 최종 볼륨)입니다. 1mL 피하 (하위 Q) 30 게이지, 5/16-inch 바늘로 주사기를 사용 instillate의 해당 금액을 관리할 수 있습니다. 주사기 베벨 측면을 잡고 병렬 기관과 함께, 그리고기도에 instillate의 전체 볼륨을 주입.
- 동물가 폐 속에 용질의 기지를 따라 온다하여 응답할 수 있습니다. 주사기를 통해 공기를 도입하고 폐가 확장 여부를 관찰하면 성공 삽관법 기법을 확인합니다.
- 기관에서 주사기를 제거합니다.
4. 봉합.
- 바늘 홀더와 바늘의 스웨이지 (봉합 재료가 연결되어있는 바늘의 두꺼운 부분)을 파악.
- 피부의 두께에 따라 떨어진 상처의 가장자리에서 90 ° 각도로 약 1~3mm에서 바늘의 끝에와 피부에 침투. 조직 하나를 통해 통과 후 종료 바늘을 파악. 개별적으로 매듭 간단한 바늘, 효율적으로 상처를 닫습니다.
5. 동물 복구
- 동물 완전히 3-24시간 후 마취 및 수술에서 회복한다.
6. 대표 결과
형광 화합물 Intratracheal 떨어뜨림, dextran을 복합 Cy5.5는 B6 마우스 폐에 형광 화합물 (그림 1) 성공적으로 기지를 보여줍니다. 형광 염료는 주로 폐를 타겟으로하고 균일하게 분포돼있다. 즉시 절차 다음과 같은 위장관의 형광 신호가 식도가 실수 절차 (그림 2) 중 intubated 것을 나타냅니다. 수사 당국은 또한 폐로 화합물의 타겟 배달을 확인하고 instillate의 분포를 확인 폐가 팽창하고 폐 조직 조각 (2, 3) 준비하여 절차를 수행하거나 고정 histolo을gical 샘플.
그림 1. 형광등 Cy5.5 신호가 성공적으로 얻은 마우스 폐에서 X - 레이 이미지와 함께 공동 등록. 1.4 MG Cy5.5 Dextran은 (10 μg / μL의 농도에서) B6 마우스 폐의기도로 얻은되었습니다. Cy5.5 신호는 675 나노미터 여기 필터와 695 nm의 방출 필터를 사용하여 검색했습니다.
그림 2. 저조한 얻은 마우스 X - 레이 오버레이로 표시 형광 신호의 공동 등록. 내장에 Cy5.5 납품에 tracheal 떨어뜨림 프로토콜 결과 동안 식도의 부적 절한 삽관법.
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Discussion
Intratracheal instillations는 시험 화합물 (6)의 독성을 평가하기 위해 여러 가지 다양한 연구에 사용되었으며, 폐포 폐 상해 (4, 7) 유도, 직접 작은 oligonucleotides의 전달을 통해 계면 활성제 (8)뿐만 아니라, 변경 유전자 발현을 교체 폐 (5). 우리는 현재 폐암에 형광 산화 환원에 민감한 자료는 약리 성분, DNA 벡터, 바이러스, 그리고 함께 형광 표시기를 instilling)뿐만 아니라 2로 평범하고 pathophysiological 조건 생체내에 산화 스트레스를 측정하기 위해 1) instilling의 사용을 탐험 아르 / 또는 폐 유체 수송에있는 각 instillate의 효과를 평가하는 microRNA.
흡입 노출 ((1) 검토)를 통해 기지 프로토콜을 사용하여 폐에 이물질을 소개하는 몇 가지 장점이 있습니다. 떨어뜨림 프로토콜을 사용하여의 주요 장점은 독성, 발암성, 또는 방사성 물질에 노출 제한을 포함합니다. 또한, 고체뿐만 아니라 액체 재료는 폐에 소개하실 수 있습니다. 확실하게, tracheal 기지 접근 방식을 사용하는 가장 큰 단점은 instillate의 도입은 침략과 nonphysiological있다는 것입니다.
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Acknowledgments
이 작품은 NIH K99 HL09222601 및 MNH에게 수여 S & R 재단 Ryaji Uneo 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
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