Summary
Instillations Intratracheal לספק מומסים ישירות לריאות. הליך זה מטרות אספקת instillate לתוך אזורים דיסטלי של הריאה, ולכן שולבו לעתים קרובות במחקרים שמטרתם ללמוד alveoli. אנו מספקים הישרדות פרוטוקול מפורט לביצוע instillations intratracheal בעכברים.
Abstract
Instillations Intratracheal לספק מומסים ישירות לריאות. הליך זה מטרות אספקת instillate לתוך אזורים דיסטלי של הריאה, ולכן שולבו לעתים קרובות במחקרים שמטרתם ללמוד alveoli. אנו מספקים הישרדות פרוטוקול מפורט לביצוע instillations intratracheal בעכברים. שימוש בגישה זו, ניתן למקד את המסירה של מומסים מבחן או מוצקים (כגון ריאות ותרופות, פעילי שטח, וירוסים oligonucleotides קטנים) לתוך הריאות דיסטלי. Instillations קנה הנשימה עשוי להיות מתודולוגיה מועדפת, על פרוטוקולים משאיפת שעשויים בעיקר היעד בדרכי הנשימה העליונות ואולי לחשוף את החוקר לחומרים העלולים להיות מסוכנים. בנוסף, באמצעות פרוטוקול החדרה קנה הנשימה, בעלי חיים יכולים להתאושש באופן מלא בהליך פולשני. זה מאפשר ביצוע מדידות פיזיולוגיות לאחר מכן על חיות הבדיקה, או התקנה מחדש באמצעות בעלי חיים זהה. כמות instillate שהוכנסו הריאה צריכה להיקבע בזהירות מאוזנת אוסמוטי על מנת להבטיח התאוששות של בעלי חיים. בדרך כלל, 30-75 נפח instillate μL יכול להיות מוחדר ריאות העכבר.
Protocol
1. הרדמה
- הרדמה עכברים עם isoflurane עשוי להקל על הטיפול בבעלי חיים באיפוק לפני מתן הרדמה intraperitaneally. באמצעות הרדמה נשאפים עשויה או לא עשויה להיות מתאים מחקר מסוים: לקבוע תחילה את ההשפעה של שימוש isoflurane, או כל חומר הרדמה אחר, על מחקר ריאות המוצע.
- להרדים חיות עם isoflurane. הוידאו מציג את השימוש של החדר מאדה isoflurane להגדיר 2% isoflurane מעורבב עם חמצן. אם אין לך תא isoflurane, אתה יכול לחילופין באמצעות תקן פתוח ושחרר טכניקות חשיפה. הקף חולדות בתוך צנצנת פעמון (או מיכל מתאים אחר שאינו נקבובי) עם רשת תיל מצויד לתחתית. כדי פד גזה ממוקם מתחת לחוטי רשת, להחיל תערובת של 30% v / v isoflurane ב פרופילן גליקול. השימוש הרשת מבטיחה כי החיה לא באה במגע עם כרית isoflurane ספוג, אשר יכול לגרום לגירוי העור ממנת יתר פוטנציאליים. לאחר חשיפה קצרה isoflurane, החיה צריכה להיות מורדמים ולא יגיב עם רפלקס ליישר צנצנת כאשר הוא מוטה ולא יגיב לאחר קמצוץ הבוהן.
- עכברים רגועים נוסף עם הזרקה תוך פריטוניאלית תערובת של Xylazine ו קטמין. (זה תרגול טוב בעת ביצוע זריקות intraperitoneal לסגת על מנת להבטיח כי חלקים במעי או איברים חיוניים אחרים לא היו חדרה). מערבבים 150 Xylazine μL (100 מ"ג / מ"ל) עם קטמין 1000 μL (100 מ"ג / מ"ל) ב μL 8850 של פוספט סטרילי 0.9% בופר סליין (PBS). עבור עכברים, המינון יהיה כ 80 μL לכל 10 גרם של משקל גוף. הריכוזים הסופי יהיה 10 מ"ג / ק"ג Xylazine ו 100 מ"ג / ק"ג קטמין. החיות צריך להישמר יבש מבודדים כדי למנוע איבוד יתר של חום הגוף. משחת עיניים יכול להיות מיושם על העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרניות.
2. הכנת שטח כירורגי
- גילוח האזור שבו חתך ניתוחי ייעשה מונע זיהום בלתי prepped אזורים. מכונת גילוח חשמלית יכול לגלח את הפרווה מקרוב את החיה. האזור המגולח צריך להיות גדול יותר מאשר באתר החתך.
- בעקבות יישום של קרם להסרת שיער, כמו נאיר, תסיר את כל הפרווה הנותרים. למרוח שכבה עבה של קרם להסרת שיער לאזור כירורגית והשאירי למשך 3 דקות. למחות את פרווה קרם להסרת השיער במגבת לחה. אל תשאיר את קרם להסרת שיער על עודף של 10 דקות.
- שימוש באלכוהול 70% או פתרון חלופי לקרצף, בסביבה נקייה מחיידקים, כדי להכין את אזור הניתוח.
3. הליך כירורגי
- מקם את החיה הרדים ללוח כירורגית משופע, או לעמוד בזווית הרחקה.
- לעשות חתך קטן ליד ההיבט הקדמי של הצוואר (אזור הגרון).
- לנתח משם את שרירי קנה הנשימה platysma הקדמי על מנת להמחיש גישה מצלצל קנה הנשימה.
- בדרך כלל, כרכים הזרקת intratracheal הם 3 גרם לכל μl של משקל (כ 30-75 נפח סופי μL). נהל את הכמות המתאימה של instillate באמצעות תת עורית 1mL (תת ש) מזרק עם מד 30, מחט 5/16-inch. הצד החזק שפוע מזרק מעלה במקביל קנה הנשימה, ואת להזריק נפח מלא instillate לתוך קנה הנשימה.
- חיה עלול להגיב על ידי מתנשם לאחר החדרה של המומס לתוך הריאות. הכירו את האוויר דרך המזרק והתבוננות אם לריאות להתרחב גם לאשר טכניקות אינטובציה מוצלחת.
- הסר את המזרק מתוך קנה הנשימה.
4. Sutures.
- אחוז swage של מחט (החלק העבה של המחט שבו חומר תפר מצורפת) עם בעל מחט.
- לחדור את העור עם קצה המחט על מ"מ 90 מעלות כ 1-3 זווית מהקצה של הפצע, בהתאם לעובי העור. תפוס את המחט לאחר היציאה במעבר אחד דרך רקמות. תפרים פשוטים, קשורה בנפרד, יהיה יעיל לסגור את הפצע.
5. בעלי חיים Recovery
- בעלי חיים צריך להחלים לחלוטין מן ההרדמה ועל הליך כירורגי לאחר 3-24 שעות.
6. נציג תוצאות
החדרה Intratracheal של המתחם ניאון, Cy5.5 מצומדות כדי dextran, מראה החדרה מוצלחת של המתחם ניאון ריאות B6 העכבר (איור 1). צבע פלואורסצנטי מיועד בעיקר הריאות, והוא מופץ באופן שווה. אות פלורסנט במערכת העיכול מיד לאחר הניתוח עולה כי הוושט היה מחובר לצינורות בשוגג במהלך ההליך (איור 2). חוקרים יכולים גם לוודא משלוח ממוקד של תרכובות לתוך הריאות, ולבדוק חלוקת instillate, בעקבות הליך ידי ניפוח הריאות והכנת רקמת הריאה פרוסות (2, 3) או histolo קבועדגימות gical.
באיור 1. פלורסנט Cy5.5 אות שיתוף רשום עם תמונת רנטגן של ריאות עכבר החדירו בהצלחה. 1.4 מ"ג Cy5.5 dextran (בריכוז של 10 מיקרוגרם / μL) היה החדירו לתוך קנה הנשימה של הריאות B6 העכבר. Cy5.5 האות זוהה באמצעות עירור 675 ננומטר לסנן 695 פליטת לסנן ננומטר.
איור 2. משותף של אות אחת פלורסנט הראו עם כיסוי רנטגן עכבר החדירו גרוע. אינטובציה הולם של הוושט במהלך קנה הנשימה פרוטוקול תוצאות החדרה במשלוח Cy5.5 למעי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Instillations Intratracheal שימשו מספר מחקרים שונים כדי להעריך את הרעילות של תרכובות מבחן (6), לגרום נזק ריאות מכתשיים (4, 7), להחליף חומרים פעילי שטח (8), כמו גם לשנות ביטוי גנים באמצעות מסירת oligonucleotides קטן ישירות לתוך ריאה (5). כרגע אנחנו בוחנים את השימוש של הקניית 1) חומר זרחני חיזור רגישה לתוך הריאות על מנת למדוד סטרס חמצוני in vivo בתנאים נורמליים pathophysiological, וכן 2) הקניית אינדיקטורים ניאון עם חומרים פרמקולוגיים, וקטורים DNA, וירוסים ו / או microRNA כדי להעריך את ההשפעה של כל instillate בתחבורה נוזל הריאות.
ישנם מספר יתרונות של החדרת חומר זר לתוך הריאות תוך שימוש בפרוטוקול החדרה על החשיפה משאיפת (הנסקרת ב (1)). היתרונות העיקריים של שימוש בפרוטוקול החדרה כולל חשיפה הגבלת, חומרים רעילים ומסרטנים, או רדיואקטיבי. בנוסף, מוצקים, כמו גם חומר נוזלי, ניתן להכניס לתוך הריאה. ניתן לטעון, החיסרון הגדול ביותר באמצעות גישה החדרה לקנה הנשימה היא כי הנהגת instillate הוא פולשני nonphysiological.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH K99 HL09222601 וה-S & R קרן Ryaji פרס Uneo הוענק MNH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
- Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue. J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).
- Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).
- Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).
- Li, T., Folkesson, H. G. RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).
- Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity. Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).
- Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).
- Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study. Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).
