Summary
Intratracheale Instillationen liefern Solute direkt in die Lunge. Dieses Verfahren zielt auf die Lieferung der instillate in den distalen Regionen der Lunge, und wird daher oft in Studien am Studium Alveolen gerichtet eingebaut. Wir bieten Ihnen eine detaillierte Überleben Protokoll für die Durchführung intratracheale Instillationen in Mäusen.
Abstract
Intratracheale Instillationen liefern Solute direkt in die Lunge. Dieses Verfahren zielt auf die Lieferung der instillate in den distalen Regionen der Lunge, und wird daher oft in Studien am Studium Alveolen gerichtet eingebaut. Wir bieten Ihnen eine detaillierte Überleben Protokoll für die Durchführung intratracheale Instillationen in Mäusen. Mit diesem Ansatz kann eine Lieferung von Test-Solute oder festen Stoffen (wie Lungen-Therapeutika, Tenside, Viren und kleine Oligonukleotide) in den distalen Lunge Ziel. Tracheal Instillationen kann die bevorzugte Methode sein, über Inhalation Protokolle, die in erster Linie an der oberen Atemwege und möglicherweise aussetzen Ermittler potentiell gefährlicher Stoffe. Zusätzlich bei der Verwendung der Instillation Protokoll, können Tiere in vollem Umfang aus dem nicht-invasive Verfahren zu erholen. Dies ermöglicht für die Herstellung anschließenden physiologischen Messungen an Versuchstieren oder Neuinstallation mit dem gleichen Tier. Die Höhe der instillate in die Lunge eingeführt sorgfältig bestimmt werden und osmotisch ausbalanciert, um Tier-Erholung zu gewährleisten. In der Regel können 30-75 ul instillate Volumen in Mauslunge eingeführt werden.
Protocol
1. Anästhesie
- Betäubende Mäuse mit Isofluran kann die Behandlung der Tiere und Zurückhaltung vor Erleichterung auf die Verwaltung Anästhesie intraperitaneally. Mit einem inhalativen Narkosemittel kann oder auch nicht geeignet für eine bestimmte Studie: bestimmen zunächst die Auswirkungen der Verwendung von Isofluran oder andere Betäubungsmittel, über die vorgeschlagenen Lunge zu studieren.
- Anesthetize Tiere mit Isofluran. Das Video zeigt den Einsatz eines Isofluran Verdampferkammer bei 2% Isofluran-Set mit Sauerstoff gemischt. Wenn Sie noch kein Isofluran Kammer, können Sie alternativ mit Standard-Open-drop Exposition Techniken. Legen Ratten in einer Glasglocke (oder einem anderen geeigneten nicht-porösen Behälter) mit einem Drahtgeflecht versehen auf den Boden. Um eine Gaze unter dem Drahtgeflecht gelegt, gelten eine Mischung aus 30% v / v Isofluran in Propylenglykol. Die Nutzung des Netzes sorgt dafür, dass das Tier nicht in Kontakt mit der Isofluran-getränkten Pad, die Hautreizungen und mögliche Überdosierung führen kann kommen. Nach einer kurzen Exposition gegenüber Isofluran, sollte das Tier betäubt werden und nicht mit einem aufrichtenden Reflex reagieren, wenn das Glas gekippt und werden nicht nach toe Prise reagieren.
- Weitere sedate Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung von Xylazin und Ketamin. (Es ist gute Praxis bei der Durchführung intraperitoneale Injektionen zurück zu ziehen, um sicherzustellen, dass Teile des Darms oder andere lebenswichtige Organe wurden nicht vorgedrungen). Mix 150 ul Xylazin (100 mg / ml) mit 1000 ul Ketamin (100 mg / mL) in 8850 ul von 0,9% steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Bei Mäusen, die Dosierung ca. 80 mL pro 10 g Körpergewicht werden. Die Endkonzentrationen werden 10 mg / Kg Xylazin und 100 mg / kg Ketamin werden. Die Tiere sollten trocken gehalten werden und isoliert, um dem übermäßigen Verlust von Körperwärme zu verhindern. Augensalbe kann die Augen aufgetragen werden, um zu verhindern Austrocknen der Hornhaut.
2. Vorbereitung der OP-Bereich
- Rasieren der Gegend, wo die chirurgische Einschnitt gemacht werden verhindert die Kontamination von nicht-prepped Bereichen. Ein elektrischer Rasierer kann eng rasiert das Fell vom Tier. Die rasierten Bereich sollte größer sein als der Schnitt vor Ort.
- Nachfolgende Anwendung von Enthaarungscreme, wie Nair, entfernt alle übrigen Fell. Tragen Sie eine dicke Schicht von Enthaarungscreme, die OP-Bereich und lassen Sie für 3 Minuten. Wischen Sie das Fell und Enthaarungscreme mit einem feuchten Handtuch. Lassen Sie die Enthaarungscreme auf mehr als 10 Minuten.
- Verwenden Sie 70% Alkohol, oder eine alternative Lösung schrubben, aseptisch vorbereiten OP-Bereich.
3. Surgical Procedure
- Positionieren Sie den narkotisierten Tier auf einer geneigten chirurgischen Bord, oder abgewinkelt einstweilige stehen.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Nähe der Vorderseite des Halses (Hals-Region).
- Dissect weg das Platysma und der vorderen Tracheal-Muskeln, um sichtbar zu machen und den Zugang der Trachealringe.
- Typischerweise sind intratracheale Injektionsvolumina 3 ul pro Gramm Gewicht (ca. 30-75 ul Endvolumen). Verwalten der entsprechenden Menge instillate mit einer 1 ml subkutan (sub-Q)-Spritze mit einer 30-Gauge, 5/16-Zoll- Nadel. Halten Sie die Spritze Schräge nach oben und parallel mit der Luftröhre, und injizieren das volle Volumen von instillate in die Luftröhre.
- Das Tier kann durch keuchend nach der Instillation des gelösten Stoffes in die Lunge zu reagieren. Einleiten von Luft durch die Spritze und beobachtet, ob die Lunge zu erweitern wird auch bestätigen den erfolgreichen Intubation Techniken.
- Entfernen Sie die Spritze aus der Luftröhre.
4. Nahtmaterial.
- Fassen Sie die Nadel swage (dickste Teil der Nadel, wo das Nahtmaterial befestigt ist) mit einem Nadelhalter.
- In die Haut eindringen, wobei die Spitze der Nadel in einem Winkel von 90 ° etwa 1-3 mm vom Rand der Wunde, je nach der Dicke der Haut. Fassen Sie das austretende Nadel nach einem Durchgang durch das Gewebe. Einfache Stiche, einzeln geknotet, effizient in der Nähe der Wunde.
5. Tierische Wiederherstellung
- Die Tiere sollten vollständig aus der Narkose und Operation nach 3-24 Stunden zu erholen.
6. Repräsentative Ergebnisse
Intratracheale Instillation von fluoreszierenden Verbindung, Cy5.5 konjugiert Dextran, zeigt erfolgreiche Instillation fluoreszierende Verbindung in B6 Maus Lunge (Abbildung 1). Der fluoreszierende Farbstoff wird in erster Linie die Lunge gezielt und gleichmäßig verteilt wird. Fluoreszenzsignal im Magen-Darm-Trakt unmittelbar nach dem Verfahren zeigt, dass die Speiseröhre unbeabsichtigt war während des Verfahrens (Abbildung 2) intubiert. Die Ermittler können auch überprüfen, gezielte Verabreichung von Verbindungen in die Lunge, und überprüfen Verteilung der instillate nach dem Verfahren durch Aufblasen der Lunge und der Vorbereitung Lungengewebe Scheiben (2, 3) oder feste histologischen Proben.
Abbildung 1. Fluorescent Cy5.5 Signal mit X-ray Bild in erfolgreich eingeflößt Mauslunge co-registriert. 1,4 mg Cy5.5 Dextran (bei einer Konzentration von 10 ug / ul) wurde in die Luftröhre des B6 Mauslunge eingeflößt. Cy5.5 Signal wurde mit einem 675 nm Anregungs-Filter und einem 695 nm-Emission-Filter.
Abbildung 2. Co-Registrierung von Fluoreszenz-Signal mit X-ray-Overlay in schlecht eingeflößt Maus gezeigt. Unangemessene Intubation des Ösophagus während der Instillation Protokoll Ergebnisse in Cy5.5 Lieferung an den Darm.
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Discussion
Intratracheale Instillationen in mehreren verschiedenen Studien wurden verwendet, um die Toxizität von Testsubstanzen (6) zu bewerten, zu induzieren alveolären Lungenschädigung (4, 7), ersetzen Tenside (8), sowie alter Genexpression über Lieferung von kleinen Oligonukleotide direkt in die Lunge (5). Wir prüfen derzeit den Einsatz von Einträufeln 1) fluoreszierenden Redox-sensitive Material in die Lunge, um oxidativen Stress in vivo Messung unter normalen und pathophysiologischen Bedingungen, sowie 2) einzuflößen fluoreszierenden Indikatoren mit pharmakologischen Verbindungen, DNA-Vektoren, Viren und / oder microRNA, um die Wirkung der einzelnen instillate auf Lungenflüssigkeit Transport zu beurteilen.
Es gibt mehrere Vorteile der Einführung von Fremdmaterial in die Lunge mit einer Instillation Protokoll über Inhalation (besprochen in (1)). Die primären Vorteile der Verwendung eines Instillation Protokoll enthält Begrenzung der Exposition gegenüber giftigen, krebserzeugenden, oder radioaktive Verbindungen. Darüber hinaus können Feststoffe sowie flüssige Material in die Lunge eingebracht werden. Wohl ist der größte Nachteil bei der Verwendung der Instillation Ansatz, der die Einführung des instillate invasive und unphysiologische ist.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH K99 HL09222601 und der S & R Foundation Ryaji Uneo Award ausgezeichnet zu MNH unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
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- Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).
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