Summary
Интратрахеального инстилляции растворов доставить непосредственно в легкие. Эта процедура цели доставку instillate в дистальных отделах легких, и поэтому часто включены в исследования, направленные на изучение альвеол. Мы предоставляем подробный протокол выживания для выполнения интратрахеального инстилляции у мышей.
Abstract
Интратрахеального инстилляции растворов доставить непосредственно в легкие. Эта процедура цели доставку instillate в дистальных отделах легких, и поэтому часто включены в исследования, направленные на изучение альвеол. Мы предоставляем подробный протокол выживания для выполнения интратрахеального инстилляции у мышей. Используя этот подход, можно адресной доставки тест растворенных веществ или твердых веществ (таких, как рак легких терапии, поверхностно-активные вещества, вирусы, и малых олигонуклеотидов) в дистальных легких. Трахеи инстилляций может быть предпочтительным методологии, более ингаляции протоколов, которые могут в первую очередь цель верхних дыхательных путей и, возможно, разоблачить следователя потенциально опасных веществ. Кроме того, при использовании протокола трахеи инстилляции, животные могут полностью восстановиться от неинвазивные процедуры. Это позволяет сделать последующие физиологических измерений на подопытных животных, или переустановки с использованием тех же животных. Количество instillate введен в легких должны быть тщательно определены и осмотически сбалансированным, чтобы обеспечить животным восстановления. Как правило, 30-75 мкл объема instillate может быть введен в мышь легких.
Protocol
1. Анестезия
- Обезболивающий мышей с изофлуран может облегчить обработку животных и сдержанность перед управляющими анестезии intraperitaneally. Использование вдыхании анестезии могут или не могут быть пригодны для конкретного исследования: определить первые последствия использования изофлуран, или любое другое обезболивающее, на предлагаемое исследование легких.
- Анестезию животных с изофлуран. Видео показывает использование изофлуран камере испарителя установлен на уровне 2% изофлуран в смеси с кислородом. Если у вас нет изофлуран камеры, вы можете альтернативно с использованием стандартных открытых падение методы воздействия. Приложите крыс в колпаком (или другого соответствующего непористых контейнер) с проволочной сетки установлены на дно. Для марлевым тампоном помещен под проволочной сеткой, применять смеси 30% об. / изофлуран в пропиленгликоля. Использование сетки гарантирует, что животное не вступают в контакт с изофлуран пропитанной площадку, которая могла бы вызвать раздражение кожи и потенциальных передозировки. После короткого контакта с изофлуран, животное должно быть под наркозом и не будет отвечать рефлекса, когда банку отклоняется и не будет отвечать за палец ущипнуть.
- Далее степенный мышей с внутри-перитонеального инъекции из смеси Ксилазин и кетамин. (Это хорошая практика при выполнении внутрибрюшинного введения отступать, чтобы гарантировать, что части кишечника или других жизненно важных органов не проникли). Смешайте 150 мкл Ксилазин (100 мг / мл) с 1000 мкл Кетамин (100 мг / мл) в 8850 мкл 0,9% стерильный фосфатно-солевым буфером (PBS). Для мышей, дозировка будет примерно 80 мкл на 10 г массы тела. Конечные концентрации будет составлять 10 мг / кг Ксилазин и 100 мг / кг кетамина. Животных следует хранить в сухом месте и изолировать, чтобы предотвратить чрезмерную потерю тепла тела. Офтальмология мази можно применять к глазам, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
2. Подготовка Хирургическая Площадь
- Бритье области, где хирургический разрез будет сделан предотвращает загрязнение от не нацелен областях. Электрическая бритва может тесно бритья мех животного. Бритой области должны быть больше, чем разрез сайта.
- Последующее применение эпиляции кремом, например, Наир, будут удалены все оставшиеся меха. Нанесите толстый слой волос крем удаления в хирургическое области и оставьте на 3 минуты. Вытрите меха и крем удаления волос с влажным полотенцем. Не оставляйте крем удаления волос на более 10 минут.
- Используйте 70% спиртом или альтернативное решение скраб, чтобы асептически подготовить хирургических области.
3. Хирургические процедуры
- Позиция наркозом животного на наклонной хирургических борту, или угловой стенд сдерживать.
- Сделайте небольшой надрез возле передняя часть шеи (горла область).
- Рассеките от подкожная мышца шеи и передних мышц трахеи для того, чтобы визуализировать и доступ кольца трахеи.
- Как правило, интратрахеального объемы инъекций 3 мкл на грамм веса (примерно 30-75 мкл конечного объема). Администрирование соответствующее количество instillate использованием 1 мл подкожно (суб-Q), шприц с 30 калибр, 5/16-inch иглы. Держите шприц стороны скос и параллельно с трахеи, и ввести полный объем instillate в трахею.
- Животное может ответить, задыхаясь следующие инстилляции растворенных веществ в легкие. Введение воздуха через шприц и наблюдая ли легкие расширяться также подтверждают успешные методы интубации.
- Удалите шприц из трахеи.
4. Швы.
- Возьмитесь обжимки иглы (толстую часть иглы, где шовный материал прилагается) с иглодержателя.
- Проникают в кожу с кончика иглы при 90 ° примерно 1-3 мм от края раны, в зависимости от толщины кожи. Возьмитесь выхода иглы после одного прохода через ткань. Простые стежки, индивидуально узлом, будет эффективно закрыть рану.
5. Животное восстановления
- Животные должны полностью восстановиться от анестезии и хирургического вмешательства после 3-24 часов.
6. Представитель Результаты
Интратрахеального инстилляции флуоресцентным соединением, Cy5.5 конъюгированных с декстран, показывает успешный инстилляции флуоресцентные соединения в В6 мыши легких (рис. 1). Флуоресцентного красителя в первую очередь ориентированы на легких и равномерно распределяется. Флуоресцентный сигнал в желудочно-кишечном тракте сразу же после процедуры показывает, что пищевода была случайно интубации во время процедуры (рис. 2). Исследователи могут также проверить адресной доставки веществ в легких, и проверить распределение instillate, в соответствии с процедурой, раздувая легкие и подготовке легочной ткани ломтиками (2, 3) или фиксированная histoloкосмологической образцов.
Рисунок 1. Флуоресцентный сигнал Cy5.5 совместно зарегистрировано рентгеновское изображение в успешно привили мышей легких. 1,4 мг Cy5.5 Декстран (при концентрации 10 мкг / мкл) закапывают в трахею B6 мыши легких. Cy5.5 сигнал регистрируется с помощью 675 нм фильтра возбуждения и 695 нм фильтра выбросов.
Рисунок 2. Сотрудничество регистрации флуоресцентного сигнала показаны рентгеновские наложения в плохо привили мыши. Несоответствующий интубации трахеи пищевод во время закапывания протокол результатов в Cy5.5 доставки кишечника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Интратрахеального инстилляции были использованы в нескольких различных исследований для оценки токсичности тестируемых соединений (6), вызывают альвеолярного повреждения легких (4, 7), замените поверхностно-активные вещества (8), а также изменяют экспрессию генов через доставку небольших олигонуклеотидов непосредственно в легких (5). Мы в настоящее время изучает возможность использования внушения 1) флуоресцентного редокс-чувствительных материалов в легких для того чтобы измерить окислительного стресса в естественных условиях в нормальных и патофизиологических условиях, а также 2) воспитание флуоресцентных индикаторов с фармакологических препаратов, ДНК векторы, вирусов и / или микроРНК оценить влияние каждого instillate на легких транспортных жидкости.
Есть несколько преимуществ внедрения чужеродного материала в легком использовании инстилляции протокол за вдыхания (обзор в (1)). Основные преимущества использования закапывания протокол включает ограничению воздействия токсичных, канцерогенных, или радиоактивных веществ. Кроме того, твердые вещества, а также жидкий материал, могут быть введены в легких. Можно утверждать, что наибольший недостаток использования трахеи подход закапывания в том, что введение instillate является инвазивной и nonphysiological.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH K99 HL09222601 и S & R Фонд Ryaji Uneo премия присуждена MNH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
- Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue. J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).
- Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).
- Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).
- Li, T., Folkesson, H. G. RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).
- Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity. Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).
- Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).
- Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study. Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).
