Summary
Intratrakeal instillationer leverera lösta ämnen direkt in i lungorna. Detta förfarande mål leverans av instillate i distala delar av lungorna, och är därför ofta ingår i studier som syftar till att studera alveolerna. Vi tillhandahåller en detaljerad överlevnad protokoll för att utföra intratrakeal instillationer hos möss.
Abstract
Intratrakeal instillationer leverera lösta ämnen direkt in i lungorna. Detta förfarande mål leverans av instillate i distala delar av lungorna, och är därför ofta ingår i studier som syftar till att studera alveolerna. Vi tillhandahåller en detaljerad överlevnad protokoll för att utföra intratrakeal instillationer hos möss. Med denna metod kan man rikta leverans av test lösta ämnen eller fasta ämnen (såsom lunga Therapeutics, tensider, virus och små oligonukleotider) i distala lungan. Luftrör instillationer kan vara att föredra metodik, över inandning protokoll som främst kan rikta de övre luftvägarna och eventuellt utsätta utredaren för potentiellt farliga ämnen. Dessutom, att använda luftrör instillation protokollet kan djur tillfrisknar helt från icke-invasiv förfarande. Detta möjliggör för att göra efterföljande fysiologiska mätningar på försöksdjur, eller ominstallation med samma djur. Mängden instillate förs in i lungan måste noggrant bestämmas och osmotiskt balanserad för att säkerställa djurens återhämtning. Normalt kan 30-75 mikroliter instillate volym föras in i musen lunga.
Protocol
1. Anestesi
- Anesthetizing möss med isofluran kan underlätta djurhantering och återhållsamhet före administrering av anestesi intraperitaneally. Använda en inhalerad narkos kan eller inte kan vara lämpliga för en viss studie: först ta reda på effekterna av att använda isofluran eller andra bedövningsmedel, om förslag till lunga studie.
- Bedöva djur med isofluran. Videon visar användningen av en isofluran Vaporizer kammare satt till 2% isofluran blandat med syre. Om du inte har ett isofluran kammare, kan du använda alternativt vanliga öppna-släpp exponering tekniker. Bifoga råttor i en glaskupa (eller annan lämplig icke-porös behållare) med ett metallnät monteras i botten. För att en kompress placeras under mesh tråd, tillämpa en blandning av 30% v / v isofluran i propylenglykol. Användningen av nätet gör att djuret inte kommer i kontakt med isofluran har dränkts pad, vilket kan orsaka hudirritation och risk för överdosering. Efter kort exponering för isofluran, bör djuret bedövas och kommer inte att svara med ett rätande reflex när burken tippas och kommer inte att svara efter tå nypa.
- Ytterligare stillsam möss med en intraperitonealt injektion av en blandning av Xylazine och ketamin. (Det är god praxis när du utför intraperitoneal injektion för att dra tillbaka för att försäkra att delar av tarmen eller andra vitala organ inte har trängt in). Blanda 150 mikroliter Xylazine (100 mg / ml) med 1000 mikroliter Ketamin (100 mg / ml) i 8850 mikroliter 0,9% steril fosfat saltlösning (PBS). För möss, kommer dosen cirka 80 mikroliter per 10 GM kroppsvikt. Den slutliga koncentrationen blir 10 mg / kg Xylazine och 100 mg / kg ketamin. Djuren ska hållas torra och isolerade för att förhindra överdriven förlust av kroppsvärmen. Oftalmologiska salva kan användas på ögonen för att förhindra uttorkning av hornhinnor.
2. Beredning av operationsområdet
- Rakning det område där det kirurgiska ingreppet kommer att göras förhindrar kontamination från icke-preparerade områden. En elektrisk rakapparat kan noga raka pälsen av djuret. Det rakade området bör vara större än snittet webbplats.
- Senare tillämpning av hårborttagning grädde, såsom Nair, tar bort alla återstående päls. Applicera ett tjockt lager av hårborttagning grädde till operationsområdet och låt verka i 3 minuter. Torka bort päls och hårborttagning grädde med en fuktig handduk. Lämna inte hårborttagningskräm på mer än 10 minuter.
- Använd 70% alkohol, eller en alternativ skrubba lösning, aseptiskt förbereda kirurgiska området.
3. Kirurgiskt ingrepp
- Placera sövs djuret på ett sluttande kirurgiskt styrelse, eller vinklad besöksförbud stativ.
- Gör ett litet snitt nära den främre delen av halsen (halsen regionen).
- Dissekera bort platysma och främre luftstrupen muskler för att visualisera och få tillgång till luftstrupen ringar.
- Vanligtvis intratrakeal injektionsvolymer är 3 l per gram i vikt (cirka 30-75 mikroliter slutlig volym). Administrera lämplig mängd instillate med en 1 mL subkutan (sub-Q) spruta med en 30 gauge, 5/16-inch nål. Håll sidan sprutan avfasningen uppåt och parallellt med luftstrupen, och injicera hela volymen instillate ner i luftstrupen.
- Djuret kan svara genom att kippar efter instillation av löst ämne i lungorna. Introduktion luft genom sprutan och observera om lungorna expandera kommer också att bekräfta lyckad intubering tekniker.
- Ta sprutan ur luftstrupen.
4. Suturer.
- Ta tag i nålens swage (tjockaste delen av nålen där suturmaterial är fäst) med en nål.
- Penetrera huden med spetsen av nålen i 90 ° vinkel ca 1-3 mm från kanten av såret, beroende på tjockleken på huden. Ta tag i spännande nålen efter en passerar genom vävnaden. Enkla stygn, individuellt knutna, kommer att effektivt stänga såret.
5. Animal Recovery
- Djur bör helt återhämta sig från anestesi och operation efter 3-24 timmar.
6. Representativa resultat
Intratrakeal instillation av fluorescerande förening, Cy5.5 konjugerat med dextran, visar framgångsrika instillation av fluorescerande substansen i B6 mus lunga (Figur 1). Den fluorescerande färg är främst riktad till lunga och är jämnt fördelad. Fluorescerande signalen i mag-tarmkanalen omedelbart efter förfarandet visar att matstrupen misstag var intuberade under förfarandet (figur 2). Utredarna kan också kontrollera målstyrning av föreningar till lungorna, och kontrollera distributionen av instillate, enligt det förfarande genom att blåsa upp lungorna och förbereder skivor lungvävnad (2, 3) eller fast histologiska prover.
Figur 1. Fluorescerande Cy5.5 signal samarbete registrerad röntgenbilden framgångsrikt ingjutit mus lunga. 1,4 mg Cy5.5 Dextran (vid en koncentration av 10 mikrogram / l) var ingjutit i luftstrupen av B6 mus lunga. Cy5.5 signalen upptäcktes med hjälp av ett 675-filter nm excitation och en 695 nm utsläpp filter.
Figur 2. Samtidig registrering av fluorescerande signal visas med röntgen overlay i dåligt ingjutit mus. Olämpligt intubation i matstrupen under trakeal resultat instillation protokollet i Cy5.5 leverans till tarmarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intratrakeal instillationer har använts i flera olika studier för att utvärdera toxiciteten av test föreningar (6), framkalla alveolära lungskada (4, 7), byt tensider (8), samt ändra genuttryck via leverans av små oligonukleotider direkt i lunga (5). Vi är för närvarande undersöka användningen av ingjuta 1) fluorescerande redox-känsliga material i lungorna för att mäta oxidativ stress in vivo under normala och patofysiologiska förhållanden, samt 2) att ingjuta fluorescerande indikatorer med farmakologiska substanser, vektorer DNA, virus och / eller mikroRNA att bedöma effekten av varje instillate på lunga vätska transporter.
Det finns flera fördelar med att införa främmande material in i lungorna med hjälp av en instillation protokoll över inandning (över i (1)). Den främsta fördelarna med att använda en instillation protokoll omfattar begränsning av exponering för giftiga, cancerframkallande, eller radioaktiva ämnen. Dessutom kan fasta ämnen samt flytande material, föras in i lungan. Förmodligen är den största nackdelen med att använda den endotrakeal instillation strategi som införandet av instillate är invasiv och nonphysiological.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH K99 HL09222601 och S & R Stiftelsen Ryaji Uneo Award tilldelas MNH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
- Driscoll, K. E., Costa, D. L., Hatch, G., Henderson, R., Oberdorster, G., Salem, H., Schlesinger, R. B. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue. J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).
- Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).
- Iyer, S. S., Ramirez, A. M., Ritzenthaler, J. D., Torres-Gonzalez, E., Roser-Page, S., Mora, A. L., Brigham, K. L., Jones, D. P., Roman, J., Rojas, M. Oxidation of extracellular cysteine/cystine redox state in bleomycin-induced lung fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L37-L45 (2009).
- Li, T., Folkesson, H. G. RNA interference for alpha-ENaC inhibits rat lung fluid absorption in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 290, L649-L660 (2006).
- Sager, T., Porter, D., Robinson, V., Lindsley, W., Schwegler-Berry, D., Castranova, V. An improved method to disperse nanoparticles for in vitro and in vivo investigation of toxicity. Nanotoxicol. 1, 118-129 (2007).
- Xu, J., Gonzalez, E. T., Iyer, S. S., Mac, V., Mora, A. L., Sutliff, R. L., Reed, A., Brigham, K. L., Kelly, P., Rojas, M. Use of senescence-accelerated mouse model in bleomycin-induced lung injury suggests that bone marrow-derived cells can alter the outcome of lung injury in aged mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64, 731-739 (2009).
- Yeh, T. F., Lin, H. C., Chang, C. H., Wu, T. S., Su, B. H., Li, T. C., Pyati, S., Tsai, C. H. Early intratracheal instillation of budesonide using surfactant as a vehicle to prevent chronic lung disease in preterm infants: a pilot study. Pediatrics. 121, e1310-e1318 (2008).
