Summary
Injeções intratraqueais solutos entregar diretamente para os pulmões. Este procedimento visa a entrega do instillate nas regiões distais do pulmão, e é, portanto, muitas vezes incorporadas em estudos que visam estudar alvéolos. Nós fornecemos um protocolo de sobrevivência detalhadas para a realização de injeções intratraqueais em camundongos.
Abstract
Injeções intratraqueais solutos entregar diretamente para os pulmões. Este procedimento visa a entrega do instillate nas regiões distais do pulmão, e é, portanto, muitas vezes incorporadas em estudos que visam estudar alvéolos. Nós fornecemos um protocolo de sobrevivência detalhadas para a realização de injeções intratraqueais em camundongos. Usando essa abordagem, pode-se planejar a distribuição de solutos teste ou sólidos (como terapêutica de pulmão, surfactantes, vírus e oligonucleotides pequeno) para o pulmão distal. Instilações traqueal pode ser a metodologia preferida, através de protocolos que podem inalação alvo principalmente o trato respiratório superior e, possivelmente, expor o investigador a substâncias potencialmente perigosas. Além disso, ao utilizar o protocolo instilação traqueal, os animais podem se recuperar totalmente do procedimento não-invasivo. Isto permite fazer medições fisiológicas subseqüentes em animais de teste, ou reinstalação usando o mesmo animal. A quantidade de instillate introduzido no pulmão deve ser cuidadosamente determinada e osmoticamente balanceada para garantir a recuperação de animais. Tipicamente, 30-75 mL de volume instillate pode ser introduzida no pulmão do rato.
Protocol
1. Anestesia
- Anestesiar ratos com isoflurano pode facilitar o manuseio e contenção de animais antes de administrar anestesia intraperitaneally. Utilizando um anestésico inalado pode ou não ser adequado para um estudo particular: primeiro determinar o impacto do uso de isoflurano, ou qualquer outro anestésico, no estudo do pulmão proposto.
- Anestesiar animais com isoflurano. O vídeo mostra o uso de uma câmara de vaporizador isoflurano fixado em 2% de isoflurano misturado com oxigênio. Se você não tem uma câmara de isoflurano, pode, alternativamente, usando técnicas abrir-drop exposição. Coloque ratos em uma redoma de vidro (ou outro recipiente não-porosas apropriadas) com uma malha de aço montados para o fundo. A uma compressa de gaze colocado sob o fio de malha, aplicar uma mistura de 30% v / v isoflurano em propilenoglicol. O uso da malha garante que o animal não entrar em contacto com a almofada de isoflurano encharcado, o que pode causar irritação na pele e uma overdose potencial. Após a exposição curta para o isoflurano, o animal deve ser anestesiado e não responderá com um reflexo de endireitamento quando o frasco é derrubado e não responderá após pitada dedo do pé.
- Camundongos mais tranqüilo com uma injeção intra-peritoneal de uma mistura de xilazina e quetamina. (É uma boa prática ao realizar injeções intraperitoneais de chamar de volta para garantir que porções do intestino ou outros órgãos vitais não foram penetrados). Mix 150 Xilazina mL (100 mg / mL) com 1000 mL ketamina (100 mg / mL) em 8850 mL de 0,9% de fosfato estéril salina tamponada (PBS). Para ratos, a dose será de aproximadamente 80 mL por 10 g de peso corporal. A concentração final será de 10 Xilazina mg / Kg e 100 Ketamina mg / kg. Os animais devem ser mantidos secos e isolados para evitar a perda excessiva de calor corporal. Pomada oftálmica pode ser aplicada para os olhos para evitar a secagem das córneas.
2. Preparação da Área Cirúrgica
- Raspar a área onde a incisão cirúrgica será feita evita a contaminação de áreas não-preparado. Um barbeador elétrico pode intimamente raspar o pêlo fora do animal. A área depilada deve ser maior do que o local da incisão.
- Posterior aplicação de creme de depilação, como Nair, irá remover todos os pêlos restantes. Aplicar uma espessa camada de creme de depilação para a área cirúrgica e deixe por 3 minutos. Limpe a pele e creme de depilação com uma toalha úmida. Não deixe o creme de depilação em mais de 10 minutos.
- Uso de álcool 70%, ou esfregue uma solução alternativa, para assepticamente preparar a área cirúrgica.
3. Procedimento Cirúrgico
- A posição do animal anestesiado em uma placa inclinada cirúrgico, ou ficar de restrição angular.
- Fazer uma pequena incisão perto da face anterior do pescoço (região da garganta).
- Dissecar afastado o platisma e músculos anterior da traquéia, a fim de visualizar e acessar os anéis traqueais.
- Normalmente, os volumes de injeção intratraqueal são 3 gramas por mL de peso (cerca de 30-75 mL de volume final). Administrar a quantidade adequada de instillate usando um subcutânea 1ml (sub-Q) seringa com uma calibre 30, agulha 5/16-inch. Segure o lado bisel seringa para cima e paralela com a traquéia, e injetar o volume total de instillate na traquéia.
- O animal pode responder por ofegante após a instilação de soluto para os pulmões. Introdução de ar através da seringa e observando se os pulmões expandem também confirmará técnicas de intubação com sucesso.
- Retire a seringa da traquéia.
4. Suturas.
- Segure swage da agulha (parte mais grossa da agulha onde o material de sutura é anexado) com um suporte de agulha.
- Penetram na pele com a ponta da agulha em um ângulo de 90 ° aproximadamente 1-3 milímetros de distância da borda da ferida, dependendo da espessura da pele. Segure a agulha sair após uma passagem através do tecido. Pontos simples, individualmente atado, será eficiente fechar a ferida.
5. Recuperação de Animais
- Os animais devem se recuperar totalmente da anestesia e procedimento cirúrgico após 24/03 horas.
6. Resultados representante
Instilação intratraqueal de composto fluorescente, Cy5.5 conjugado com dextran, mostra a instilação de sucesso de compostos fluorescentes em B6 pulmão mouse (Figura 1). O corante fluorescente é dirigido principalmente para o pulmão e é uniformemente distribuída. Sinal fluorescente no trato gastrointestinal imediatamente após o procedimento indica que o esôfago foi inadvertidamente intubados durante o procedimento (Figura 2). Os investigadores também podem verificar de entrega prevista para compostos no pulmão, e verificar a distribuição dos instillate, seguindo o procedimento por inflar os pulmões e preparar fatias de tecido pulmonar (2, 3) ou fixas histoloamostras tecnológico.
Figura 1. Fluorescente Cy5.5 sinal co-registrada com X-ray imagem no pulmão do rato com sucesso instilado. 1,4 mg Cy5.5 Dextran (a uma concentração de 10 mcg / mL) foi instilado na traquéia de B6 pulmão mouse. Cy5.5 sinal foi detectado através de um filtro de 675 nm de excitação e um filtro de emissão de 695 nm.
Figura 2. Co-registro de sinal fluorescente mostrado com raios-X em sobreposição do mouse mal instilado. Intubação inadequado do esôfago durante a instilação traqueal resultados protocolo em Cy5.5 de entrega para o intestino.
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Discussion
Injeções intratraqueais têm sido utilizados em vários vários estudos para avaliar a toxicidade de compostos de teste (6), induzir a lesão pulmonar alveolar (4, 7), substituir surfactantes (8), bem como alterar a expressão de genes através de entrega de pequenos oligonucleotides diretamente no pulmão (5). Estamos atualmente explorando o uso de instilar 1) material redox-sensíveis fluorescentes para o pulmão, a fim de medir o estresse oxidativo in vivo em condições normais e fisiopatológicas, assim como 2) incutir indicadores fluorescentes com compostos farmacológicos, vetores de DNA, vírus e / ou microRNA para avaliar o efeito de cada instillate sobre transporte de fluidos no pulmão.
Existem várias vantagens da introdução de material estranho no pulmão usando um protocolo de instilação mais de exposição por inalação (revisto em (1)). Os principais benefícios do uso de um protocolo de instilação inclui a limitação da exposição a tóxicos, substâncias carcinogênicas, ou radioativos. Além disso, sólidos, bem como material líquido, pode ser introduzida no pulmão. Sem dúvida, a maior desvantagem de usar a abordagem instilação traqueal é que a introdução do instillate é invasivo e não fisiológicos.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH K99 HL09222601 eo S & R Foundation Award Ryaji Uneo concedido a MNH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
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- Helms, M. N., Jain, L., Self, J. L., Eaton, D. C. Redox regulation of epithelial sodium channels examined in alveolar type 1 and 2 cells patch-clamped in lung slice tissue. J Biol Chem. 283, 22875-22883 (2008).
- Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).
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