Summary
Intratraqueal instilaciones solutos entregar directamente a los pulmones. Este procedimiento objetivos de la entrega de los instilado en las regiones distales de los pulmones, y por lo tanto incorpora a menudo en los estudios dirigidos a estudiar los alvéolos. Ofrecemos un protocolo detallado para la supervivencia de realizar instilaciones intratraqueal en ratones.
Abstract
Intratraqueal instilaciones solutos entregar directamente a los pulmones. Este procedimiento objetivos de la entrega de los instilado en las regiones distales de los pulmones, y por lo tanto incorpora a menudo en los estudios dirigidos a estudiar los alvéolos. Ofrecemos un protocolo detallado para la supervivencia de realizar instilaciones intratraqueal en ratones. El uso de este enfoque, permite afrontar la entrega de los solutos de prueba o sólidos (como la terapéutica de pulmón, surfactantes, los virus, y los oligonucleótidos pequeños) en el pulmón distal. Instilaciones traqueal puede ser la metodología preferida, la inhalación a través de protocolos que se pueden orientar a todo el tracto respiratorio superior y, posiblemente, el investigador expone a sustancias potencialmente peligrosas. Además, al utilizar el protocolo de la instilación traqueal, los animales se pueden recuperar completamente el procedimiento no invasivo. Esto permite realizar posteriores mediciones fisiológicas de los animales de prueba, o la reinstalación con el mismo animal. La cantidad de instilado introduce en el pulmón debe ser cuidadosamente determinada y osmóticamente equilibrados para asegurar la recuperación de los animales. Por lo general, el volumen instilado 30-75 l pueden introducirse en los pulmones del ratón.
Protocol
1. Anestesia
- Anestesiando los ratones con isoflurano puede facilitar el manejo de los animales y las restricciones previas a la administración de anestesia intraperitaneally. El uso de un anestésico inhalado puede o puede no ser adecuado para un estudio particular: determinar en primer lugar el impacto del uso de isoflurano, o cualquier otro anestésico, en el estudio de pulmón propuesto.
- Anestesiar a los animales con isoflurano. El video muestra el uso de una cámara fija en vaporizador isoflurano isoflurano al 2% mezclado con oxígeno. Si usted no tiene una cámara de isoflurano, también puedes usar estándares abiertos soltar las técnicas de exposición. Incluya las ratas en una campana de cristal (o de otro tipo adecuado de contenedores no porosos), con una malla de alambre instalado en la parte inferior. De una almohadilla de gasa debajo de la malla de alambre, aplicar una mezcla de 30% v / v isoflurano en propilenglicol. El uso de la malla se asegura de que el animal no esté en contacto con la almohadilla empapada de isoflurano, que podría causar irritación de la piel y una posible sobredosis. Después de una corta exposición a isoflurano, el animal debe ser anestesiado y no responderá con un reflejo de enderezamiento cuando el frasco se inclina y no responde después de la pizca del pie.
- Los ratones más tranquilos con una inyección intraperitoneal de una mezcla de xilazina y ketamina. (Es una buena práctica cuando se realizan inyecciones intraperitoneales de retroceder para asegurar que las porciones del intestino u otros órganos vitales no han sido penetradas). Mezclar 150 xilazina l (100 mg / mL) con ketamina 1000 l (100 mg / mL) en 8850 l de 0,9% estéril tamponada con fosfato (PBS). En los ratones, la dosis será de aproximadamente 80 l por cada 10 gramos de peso corporal. La concentración final de 10 mg / kg de xilazina y ketamina 100 mg / Kg. Los animales se deben mantener secos y aislados para evitar la pérdida excesiva de calor corporal. Ungüento oftálmico puede aplicar a los ojos para prevenir la sequedad de la córnea.
2. Preparación del área quirúrgica
- Afeitar el área donde se realizará la incisión quirúrgica evita la contaminación de las áreas no preparado. Una máquina de afeitar eléctrica de cerca puede afeitar el pelo de los animales. El área de afeitado debe ser mayor que el sitio de la incisión.
- La posterior aplicación de crema de depilación, como Nair, se eliminarán todas las pieles restantes. Aplique una capa gruesa de crema depilatoria para el área quirúrgica y dejar actuar durante 3 minutos. Limpie la piel y la crema del retiro del pelo con una toalla húmeda. No deje la crema depilatoria en más de 10 minutos.
- Use alcohol al 70%, o una solución alternativa matorrales, para preparar asépticamente el área quirúrgica.
3. Procedimiento Quirúrgico
- La posición del animal anestesiado sobre una tabla inclinada quirúrgica, o de pie de restricción en ángulo.
- Haga una pequeña incisión cerca de la cara anterior del cuello (región de la garganta).
- Diseccionar los músculos platisma anterior y la tráquea con el fin de visualizar y acceder a los anillos traqueales.
- Por lo general, los volúmenes de inyección intratraqueal de 3 gramos de l por peso (aproximadamente 30-75 l volumen final). Administrar la cantidad adecuada de instilado con una inyección subcutánea de 1 ml (sub-Q) con una jeringa de calibre 30, una aguja 5/16-inch. Sujete el lado cónico jeringa hacia arriba y paralelo a la tráquea, e inyectar el volumen total de instilado en la tráquea.
- El animal puede responder sin aliento después de la instilación de soluto en los pulmones. La introducción de aire a través de la jeringa y observar si los pulmones se expanden también confirmará las técnicas de intubación exitosa.
- Retire la jeringa de la tráquea.
4. Puntos de sutura.
- Sujete estampa de la aguja (la parte más gruesa de la aguja donde se une el material de sutura), con un porta-agujas.
- Penetrar la piel con la punta de la aguja en un ángulo de 90 º aproximadamente 1-3 mm del borde de la herida, dependiendo del grosor de la piel. Sujete la aguja que sale después de una sola pasada a través del tejido. Puntos simples, de forma individual con nudos, de manera eficiente a cerrar la herida.
5. Recuperación de animales
- Los animales deben recuperar por completo de la anestesia y el procedimiento quirúrgico después de 3-24 horas.
6. Resultados representante
Instilación intratraqueal de compuesto fluorescente, conjugado con dextrano Cy5.5, muestra la instilación éxito de compuesto fluorescente en pulmón de ratón B6 (Figura 1). El tinte fluorescente se dirige principalmente a los pulmones y se distribuye de manera uniforme. Señal fluorescente en el tracto gastrointestinal inmediatamente después del procedimiento indica que el esófago fue intubado sin darse cuenta durante el procedimiento (Figura 2). Los investigadores también pueden verificar la ejecución selectiva de los compuestos en los pulmones, y verificar la distribución de la instilado, siguiendo el procedimiento mediante el inflado de los pulmones y la preparación de cortes de tejido pulmonar (2, 3) o fijos histológicasmuestras quirúrgico.
Figura 1. Fluorescente Cy5.5 señal de co-registradas con la imagen de rayos X en los pulmones del ratón inculcado con éxito. 1,4 mg Cy5.5 Dextran (a una concentración de 10 ug / l) fue inculcado en la tráquea de pulmón de ratón B6. Cy5.5 señal fue detectada mediante un filtro de 675 nm de excitación y un filtro de emisión de 695 nm.
Figura 2. Co-registro de la señal fluorescente que se ve con rayos X en la superposición de ratón mal inculcado. Intubación inadecuada del esófago durante la instilación traqueal resultados protocolo en Cy5.5 entrega a los intestinos.
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Discussion
Intratraqueal instilaciones se han utilizado en varios estudios diferentes para evaluar la toxicidad de los compuestos de prueba (6), inducen daño alveolar del pulmón (4, 7), sustituir los tensioactivos (8), así como alterar la expresión génica a través de la entrega de los oligonucleótidos pequeños directamente en el pulmonar (5). Actualmente estamos explorando el uso de inculcar 1) fluorescentes redox material sensible en el pulmón con el fin de medir el estrés oxidativo in vivo en condiciones normales y fisiopatológicas, así como 2) inculcar indicadores fluorescentes con compuestos farmacológicos, los vectores de ADN, los virus y / o microARN para evaluar el efecto de cada uno de instilado en el transporte de fluidos pulmonares.
Hay varias ventajas de la introducción de material extraño en los pulmones mediante un protocolo de la instilación en la exposición por inhalación (revisado en (1)). Los principales beneficios de utilizar un protocolo de instilación comprende limitar la exposición a los compuestos tóxicos, cancerígenos o radiactivos. Además, los sólidos, así como material líquido, se puede introducir en el pulmón. Sin duda, la mayor desventaja de usar el enfoque instilación traqueal es que la introducción de la instilado es invasiva y no fisiológica.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH K99 HL09222601 y el S & R Foundation Ryaji Uneo Premio otorgado a MNH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-220-05 | |
| Xylazine | Lloyd, Inc. | New Animal Drug Application #139-236 | |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-001-10 | |
| Nair | Available at drug stores | ||
| 1mL SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | 26 5/8 G |
| 4-0 Nylon Suture | Ethicon Inc. | 1894G.S30 |
References
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- Helms, M. N., Self, J., Bao, H. F., Job, L. C., Jain, L., Eaton, D. C. Dopamine activates amiloride-sensitive sodium channels in alveolar type I cells in lung slice preparations. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291, L610-L618 (2006).
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