Summary
本文介绍的，是用来确定人类癌症细胞系的转移潜能的一个实验性转移检测的程序。
Abstract
转移是导致死亡的癌症患者的原因。要了解转移的机制，一个实验性转移的检测使用免疫缺陷小鼠的建立。本文描绘在这个实验中涉及的程序，包括样品制备，静脉注射，培养细胞和肺转移。简言之，人体的癌细胞数量预先确定的准备
Protocol
1。样品制备
- 种植细胞〜70％在其特定的生长因子或胎牛血清媒体的融合（如MC - 1细胞，含10％胎牛血清的DMEM）。从板吸媒体，轻轻地用1 × PBS（8克/ L的NaCl，0.2 g / L的氯化钾，1.15克/升的Na 2 HPO 4 0.7 H 2 O，0.2 g / L的KH 2 PO几次4，pH值7.3）。
- 吸PBS和添加2毫升versene 0.05％胰蛋白酶（0.014克/ L的酚红和0.2 g / L的EDTA钠在1 × PBS，pH值7.2）。轻轻摇动板的板，以便从细胞脱落。在显微镜下观察细胞。它通常需要2-5分钟细胞分离。
- 添加媒体充裕量，含胎牛血清（或大豆胰蛋白酶抑制剂）淬火胰蛋白酶的活性，并收集在50毫升猎鹰管细胞。使用hemacytometer计数细胞。加载到一个干净的hemacytometer细胞悬液10μL。每毫升细胞数等于平均每五个平方乘以10 4＃细胞。
- 离心机细胞在1000转速（或〜200 XG）在一个3分钟的台式离心机。
- 小心地取出，而不会干扰细胞沉淀的媒体。在适当的音量汉克斯平衡缓冲液（HBSS）重悬细胞终浓度达到〜5 × 10 6细胞/ ml。
- 通过猎鹰70微米的细胞滤网过滤细胞排除大量的细胞聚集。吸管直接放置到过滤器通过一个标记5ML猎鹰文化管的尖端。快速到文化管悬浮液通过过滤弹出。
- 计数细胞，再使用hemacytometer稀释到终浓度为2.5 × 10 6 /毫升。保持细胞在冰上。
- 确定细胞的可行性。台盼蓝混合一些细胞和测量使用hemacytometer总细胞的细胞死亡（蓝色）的百分比。细胞活力，应在注射之前，≥90％。
2。静脉注射
- 更换手套。轻轻地抢一个免疫缺陷小鼠裸照，NOD SCID，或核供应国集团，杰克逊实验室的尾巴和拉成的鼠标限位，其反对的狭缝和它的尾巴坚持小开口，在后面的限位回， 。
- 慢慢地沿着缝隙向内滑动环和锁定到位，一旦环捕获鼠标口。鼠标不应该能够自由移动，但应该有正常的呼吸率。
- 主要尾静脉。四个主要血管在鼠尾。尾部的背，腹两侧的血管动脉。静脉尾部的侧面。
- 绘制成1ml注射器超过200μL的准备细胞。将30 G1 / 2英寸的针头和推任何可能存在的气泡。注射器中的细胞最终体积为200μL（即5 × 10 5细胞总数）。
- 尾静脉注入细胞。
- 从尾部的末端开始，所以，如果第一次试验失败，尾巴更近端的地区可以使用了第二次尝试。
- 用70％的乙醇尾巴。直拉尾巴。按住尾部用拇指尖和支持注射用食指点。
- 针插入静脉注入细胞。确保在注射针头和注射器静脉平行，否则针戳透过血管壁，并注入到相邻的尾巴组织细胞。
- 注射后撤回针。血液应该从注射部位充沛，如果成功注入了。按一块干净的纸巾或注射部位的棉签，促进凝血，触诊尾部向上推入静脉进入流通领域的任何残留的样品。
- 从限位释放鼠标并返回它的笼子。在实验室笔记本记录注射过程中（例如，有多少试验了注入细胞，以及如何被注射多细胞）。
- 确定注射后的细胞的可行性，如样品制备第9步。这一步提供了保证整个注射过程中，细胞停留活着。在注射实验结束，细胞活力下降，但应在80％以上。
- （可选）旋转剩下的细胞，用PBS漂洗一次颗粒。未来的分析（例如，Western印迹，以确认基因表达或击倒）冻结，在-80℃的颗粒。
- 通常一两个月后，老鼠将被解剖和转移的位置是非常确定。龙是为转移的主站点，因为它包含的细胞后，他们遇到的第一个毛细血管床进入流通领域。
- 冲洗后用PBS，每个肺（或含有转移的其他组织）叶（图1）在解剖显微镜下观察。 1肺转移更容易被检测肺部固定在福尔马林一夜之间检测转移的肺癌双方的数量，四叶肺转移的数字相加为肺转移的总数。以来的转移将apppear作为对比相邻的黑褐色肺组织发白点。
3。培养细胞肺转移
- 从小鼠体内分离出肺转移。每个人都应该单独培养。
- 每个转移是由一个70微米的细胞过滤器上的针帽（无菌）剁碎。
- 冲洗细胞过滤器中并收集细胞，在培养皿中通过过滤器通过与几个MLS。
- 在37 ° C孵育至少4天无干扰的细胞。
- 菜用PBS洗去血液或组织碎片。
- 添加新鲜培养基。在开始的时候，癌症细胞和成纤维细胞生长板，但渐渐地，成纤维细胞就会死亡和被癌细胞所取代。如果癌细胞进行任何的耐药基因，选择相应的抗生素的细胞。
- 评估使用对人类特有的蛋白抗体的免疫源性细胞纯度。我们使用抗人波形蛋白抗体（NCL - VIM - V9，Novocastra）。我们推导出的细胞中含有通常超过99％的人类细胞，甚至在选药的情况下。新产生的细胞可以再次被注入到免疫缺陷小鼠，以测试他们的转移能力，如上所述。
4。代表性的成果
- 在这个实验结束时，高度转移性的癌细胞株，通常会引起许多肺转移（图1），1，而很少肺转移，将来自不良的转移性癌细胞株。
- 细胞衍生的使用这种方法通常会引起更多的转移比亲行，当他们再次测试，使用这种检测。 1-3
图1。后尾静脉注射癌细胞的小鼠肺代表的图像。免疫缺陷小鼠的尾静脉注入5 × 10 5转移性人黑色素瘤细胞株，丹参细胞，4 。两个月后，肺部孤立和分散之间的正常肺组织转移被发现。
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Discussion
转移是导致死亡的癌症患者的原因。它包括四个主要步骤：从他们的主要位点，其进入流通领域的项目（血管内），从退出流通（外渗），并在远处器官的生存和成长的癌细胞脱落。在人类的转移被认为是一个缓慢的过程，往往表现经过多年的潜伏期。要研究及其进展及时，在免疫缺陷小鼠建立了相对快速的实验检测上述4自成立以来，已有效地用于隔离不同转移能力的细胞，确定基因的上调或下调在转移1,2,5，和测试在转移过程中这些基因的因果角色 。3
在这个实验中最具挑战性的一步，是尾静脉注入细胞。这需要实践来掌握注射技巧。即使是一位经验丰富的研究员，多次试验才成功实现注射是很常见的的。在小鼠尾静脉极薄，在他们中间插入针头，是不容易的。升温尾部简单地使用一盏灯，轻轻按摩前注射的尾巴，可能诱发的血管扩张，促进注射。大多数研究人员的一个常见的错误是假设在尾部静脉深，因此注入皮肤细胞太深。静脉实际上是非常接近皮肤表面，因此应尽量注入尽可能浅。
如果成功针插入静脉内注射应顺利无阻力。如果没有针插入静脉，但在相邻的组织，注入的样品将建立流体压力迅速，然后防止其余样品交付。这种失败的试验，从而失去了一些样品。为最大限度地减少这种损失，有经验的研究人员试图预测的针是否在静脉或不通过注入少量的样品和评估的阻力，流体压力。如果他觉得阻力，针必须在静脉，然后，他将拉针，然后再试一次。觉得如果没有阻力，针必须在静脉和所有样品将被注射一次。在后一种情况下，人们常常可以看到样品“笋”了静脉，取代的血，因为它使对身体的方式。
当终止检测应凭经验确定每个单元的线，因为它的显着不同细胞的转移潜能。将在不同时间点解剖小鼠注射后，肺转移的程度确定。的时间长度，在显微镜检测的肺转移可数结果是通常的选择，因为它给出了一个定量的结果，也使房间的任何增加或减少造成扰动的候选基因的转移。对于首次执行此实验中，使用一个高转移细胞株（如人类黑色素瘤细胞株，A375，或者其高度转移性的衍生物）作为阳性对照的研究人员强烈建议。此外，小鼠的年龄和性别影响效果显着，因此它应保持一致的年龄和性别不同的细胞系的转移能力比较。由于上述因素引入的变化，至少有五鼠应为每个细胞株注入达成任何统计学意义的结论。
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Acknowledgments
该协议是在实验室博士理查德海恩斯（MIT）的初步测试和优化。提供经费的NYSTEM IDEA奖（LX）和露丝属Kirschstein国家研究服务奖（LX）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
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- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
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- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
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