גרורה ניסויית Assay

Summary

מאמר זה מתאר את הנהלים של assay גרורות ניסיוני המשמש כדי לקבוע את פוטנציאל גרורתי של שורות תאים סרטניים אנושיים.

Abstract

גרורה היא הגורם המוביל למוות בקרב חולי סרטן. כדי להבין את המנגנון של גרורות, assay גרורות ניסיוני הוקם באמצעות עכברים immunodeficient. מאמר זה מתאר את ההליכים הכרוכים assay זה, כולל הכנת המדגם, הזרקה תוך ורידית, ותאי culturing של גרורות בריאות. בקצרה, מספר שנקבע מראש של תאים סרטניים אנושיים היו מוכנים

Protocol

1. לדוגמא הכנה

1. לגדל תאים ומחוברות ~ 70% בתקשורת הספציפיים שלהם עם גורמי גדילה או FBS (למשל, DMEM עם FBS 10% MC-1 תאים). לשאוב התקשורת מהצלחת בעדינות לשטוף מספר פעמים עם 1 x PBS (8 g / L של NaCl, 0.2 גר '/ L של KCl, 1.15 גר' / L של Na ₂ HPO ₄ 0.7 H ₂ O, 0.2 גר '/ L של KH ₂ PO _4, pH 7.3).
2. לשאוב PBS ומוסיפים 2 מ"ל של טריפסין 0.05% ב versene (0.014 g / L של פנול אדום 0.2 גרם / L של EDTA-Na ב 1 x PBS, pH 7.2). בעדינות רוק צלחת כדי להקל על ניתוק התא מהצלחת. שים את התאים תחת מיקרוסקופ. בדרך כלל לוקח 2-5 דקות עבור התאים לנתק.
3. הוספת נפח נרחב של כלי התקשורת המכיל FBS (או מעכב טריפסין סויה) להרוות את פעילות טריפסין לאסוף תאים במבחנה בז 50 מ"ל. ספירת תאים באמצעות hemacytometer. טען 10μL של השעיה על תא hemacytometer נקי. מספר תאים לכל מ"ל שווה לממוצע # של תאים כל אחד מחמשת ריבועים כפול 10 ^4.
4. צנטריפוגה התאים ב 1000 סל"ד (או ~ 200 XG) בצנטריפוגה benchtop במשך 3 דקות.
5. הסר בזהירות את התקשורת מבלי להפריע לתא גלולה. Resuspend תאים בנפח מתאים הפתרון הצפת הנקס מאוזן (HBSS) להגיע הריכוז הסופי של ~ 5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
6. תאים סינון דרך מסננת 70 תא פלקון מיקרומטר להוציא אגרגטים תא גדול. הניחו את קצה פיפטה ישירות על גבי המסנן מעל צינור שכותרתו פלקון 5 מ"ל תרבות. מהר להוציא את ההשעיה דרך המסנן לתוך הצינור תרבות.
7. ספירת תאים שוב באמצעות hemacytometer ו לדלל אותם לריכוז סופי של 2.5 מ"ל x 10 / ^6. שמור את התאים על הקרח.
8. קבע את יכולת הקיום של התאים. מערבבים כמה תאים עם trypan כחול למדוד את אחוז (כחול) תאים מתים על פני תאים הכולל שימוש hemacytometer. יכולת הקיום של תאים צריך להיות ≥ 90% לפני הזריקה.

2. הזרקה תוך ורידי

1. שנה כפפות. בעדינות לתפוס את הזנב של העכבר immunodeficient (עירום, NOD-SCID, או NSG, המעבדה של ג'קסון) ולמשוך אותו עוצר את העכבר, עם הגב שלה נגד החריץ ואת זנבו מבצבץ מתוך פתיחת קטן בחלק האחורי של עוצר .
2. לאט לאט להחליק את הטבעת פנימה לאורך החריץ ולנעול אותו במקום טבעת פעם תופס את הפה של העכבר. העכבר לא אמור להיות מסוגל לנוע בחופשיות, אבל צריך הקצב הרגיל של נשימה.
3. מצא את הוורידים זנב גדול. ארבעה כלי הדם הגדולים נמצאים זנב עכבר. כלי דם בצידי הגב ועל הגחון של הזנב הם העורקים. ורידים הם בצידי לרוחב הזנב.
4. צייר יותר מ 200 μL של תאים מוכן לתוך מזרק 1mL. צרף את המחט 30 G1 / 2 אינץ לדחוף החוצה כל בועות אוויר העלולות להתקיים. נפח סופי של תאים המזרק צריך להיות 200 μL (כלומר, 5 X 10 ⁵ תאים בסך הכל).
5. מזריקים תאים לווריד הזנב.
   1. התחלה מהקצה הדיסטלי של הזנב, כך שאם הניסיון הראשון נכשל, אזור הפרוקסימלי יותר של הזנב יכול לשמש לנסות שנייה.
   2. נגבו את הזנב עם אתנול 70%. משוך את הזנב ישר. החזק את קצה הזנב עם האגודל תמיכה הנקודה להזרקה עם האצבע המורה.
   3. הכנס את המחט אל הווריד מזריקים תאים. ודא מחט מזרק מקבילים הווריד במהלך ההזרקה, אחרת יהיה לתקוע את המחט דרך דופן כלי ולהזריק את התאים לתוך הרקמות הסמוכות הזנב.
   4. משוך את המחט לאחר ההזרקה. דם צריך פזרני מאתר ההזרקה אם הזריקה הלך בהצלחה. לחצו על פיסת נקי של מגבת נייר או צמר גפן על הזריקה כדי להקל על קרישת ו למשש את הזנב כלפי מעלה לדחוף את כל המדגם שיורית בווריד למחזור.
   5. שחרר את העכבר מן עוצר ולהחזירו לכלוב. תעדו את תהליך ההזרקה (למשל, בכמה משפטים זה לקח להזריק את התאים כמה הוזרקו תאים) במחברת המעבדה.
   6. קבע את יכולת הקיום של תאים לאחר ההזרקה, כמתואר בסעיף של הכנת המדגם, שלב 9. צעד זה מספק ביטחון כי תאי להישאר בחיים לאורך כל תהליך ההזרקה. בסוף הניסוי זריקה, את הכדאיות של התאים תהיה ירידה, אבל צריך להיות מעל 80%.
   7. (לא חובה) ספין את שאריות התאים ולשטוף את כדורי עם PBS פעם. להקפיא את כדורי ב -80 מעלות עבור ניתוחים בעתיד (למשל, כתמים המערבי לאשר ביטוי גנים או knockdowns).
6. בדרך כלל אחרי חודש או חודשיים, העכברים יהיה גזור ואת המיקומים של גרורות נקבעים גסה. ריאות הוא האתר העיקרי גרורות, שכן הוא מכיל את המיטה נימי הראשון התאים את המפגש לאחרהזן את זרימת הדם.
7. לאחר שטיפה עם PBS, כל האונה של הריאה (או רקמות אחרות המכילות גרורות) הוא ציין תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 1). מספר לגילוי גרורות בשני צידי הריאות נספר והמספרים של גרורות הריאה על כל ארבע האונות מתווספים יחד המספר הכולל של גרורות בריאות. ¹ גרורות ריאות מזוהים בקלות רבה יותר אם הריאות המתוקנות לילה פורמלין מאז גרורות יהיה apppear כמו כתמי לבנבן בניגוד לרקמות סמוכות חום כהה ריאות.

3. Culturing תאים גרורות ריאות

1. גרורות הריאה מבודדים עכברים שהוזרק. כל אחד צריך להיות תרבותי בנפרד.
2. גרורות כל טחון עד סוף כובע מחט (סטרילית) על מסננת 70 תא מיקרומטר.
3. שוטפים את מסננת תא עם ה-MLS כמה בינוניים תאים שנאספו שעוברים דרך המסנן בצלחת תרבות.
4. דגירה התאים ב 37 מעלות לפחות ארבעה ימים ללא הפרעה.
5. לשטוף דם או רקמות פסולת על צלחת עם PBS.
6. הוסף בינוני טרי. בהתחלה, הן תאים סרטניים ותאים פיברובלסטים לגדול על הצלחות, אבל בהדרגה, תאים פיברובלסטים ימותו החוצה להיות מוחלף על ידי תאים סרטניים. אם התאים הסרטניים לשאת גנים עמידים סמים, בחר את התאים באמצעות אנטיביוטיקה המתאימה.
7. טוהר של תאים שמקורם נבחנת על ידי immunostaining באמצעות נוגדנים נגד אדם ספציפי חלבונים. אנו משתמשים נוגדן אנטי אנושי vimentin (NCL-VIM-V9, Novocastra). התאים לנו נגזרת בדרך כלל מכילים מעל 99% של תאים אנושיים, אפילו בהיעדר בחירה סמים. התאים שמקורם החדש יכול להיות מוזרק שוב לעכברים immunodeficient לבחון את היכולות שלהם גרורתי, כפי שתואר לעיל.

4. נציג תוצאות

1. בסוף assay זה, תא גרורתי מאוד לקו בסרטן בדרך כלל מעורר גרורות הריאה רבים (איור 1), ¹ בעוד גרורות הריאה מעט מאוד יבוא קו גרורתי גרוע תאים סרטניים.
2. התאים שמקורם בשיטה זו בדרך כלל להצמיח גרורות יותר לקו ההורים, כאשר הם נבדקים שוב באמצעות assay. ^1-3

באיור 1. נציג תמונות של הריאות העכבר לאחר וריד זריקות זנב של תאים סרטניים. 5 x 10 ⁵ של קו מלנומה גרורתית האדם תאים, התאים SM, ⁴ היו מוזרק לווריד הזנב של עכברים immunodeficient. חודשיים לאחר מכן, הריאות היו מבודדים וגרורות נמצאו מפוזרים בין רקמת הריאה נורמלי.

Discussion

גרורה היא הגורם המוביל למוות בקרב חולי סרטן. היא כוללת ארבעה צעדים מרכזיים: ניתוק של תאים סרטניים מ לוקוסים העיקרי שלהם, כניסתם למחזור (intravasation), יציאתם מן המחזור (extravasation), הישרדות וצמיחה באיבר מרוחק. גרורות האדם נחשב תהליך איטי לידי ביטוי לעתים קרובות, לאחר שנים של חביון. כדי ללמוד ההתקדמות שלה מבעוד מועד, assay לעיל ניסיוני מהיר יחסית הוקמה בשנת עכברים immunodeficient. ⁴ מאז הקמתה, נעשה בו שימוש יעיל לבודד תאים שונים עם יכולות גרורתי, לזהות גנים למעלה או למטה מוסדר במהלך גרורות ^1,2,5, ולבדוק את התפקידים הסיבתית של הגנים הללו במהלך גרורות ^3.

השלב המאתגר ביותר assay זה להזריק תאים לווריד הזנב. זה לוקח שיטות להשתלט על מיומנויות הזרקה. אפילו חוקר מנוסה, משפטים ספורים לפני השגת זריקה מוצלחת נפוצים מאוד. הוורידים הם זנבות עכבר מחטים דקות מאוד להכניס ממש באמצע מהם לא קל. חימום הזנב בקצרה באמצעות מנורה בעדינות מעסה את הזנב לפני זריקות יכול לגרום להתרחבות של כלי הדם ולהקל על זריקות. טעות נפוצה של רוב החוקרים היא להניח כי בוורידים עמוקים בזנב, ולכן מזריקים תאים מדי עמוק לתוך העור. דליות הם למעשה קרוב מאוד לפני השטח של העור, ולכן יש לנסות להזריק כמו שטחית ככל האפשר.

אם המחט מוחדרת בהצלחה בתוך הווריד, הזריקה צריך ללכת בצורה חלקה ללא התנגדות. אם המחט לא מוכנס הווריד אבל ברקמות סמוכות, דוגמאות הזריקו יהיה לבנות הלחץ נוזל במהירות ואז למנוע את המסירה של שאר הדגימות. כל אחד הניסויים נכשל כזה ובכך לאבד כמה דוגמאות. כדי למזער את ההפסד, חוקר מנוסה שמנסה לחזות אם המחט היא בווריד או לא על ידי הזרקת כמות מזערית של המדגם בהערכת ההתנגדות מלחץ הנוזלים. אם הוא מרגיש את ההתנגדות, המחט לא חייבת להיות ברוח והוא יהיה ואז למשוך את המחט החוצה ונסה שוב. אם אין התנגדות מורגשת, המחט צריכה להיות וריד וכל המדגם יהיה מוזרק בבת אחת. במקרה האחרון, ניתן לעתים קרובות לראות את "יורה" מדגם את הווריד, והותירו דם כפי שהוא עושה את דרכו לכיוון הגוף.

מתי להפסיק את assay יש לקבוע באופן אמפירי לכל שורה התא, שכן הוא משתנה באופן משמעותי בהתאם הפוטנציאלים גרורתי של התאים. עכברים יהיה גזור בנקודות זמן שונות לאחר זריקות והיקף גרורות הריאה נקבע. משך הזמן כי התוצאות במספר מנייה של גרורות ריאות לגילוי מיקרוסקופית נבחר בדרך כלל, שכן הוא נותן תוצאה כמותית וגם מותיר מקום עלייה או ירידה של גרורות נגרמת על ידי הפרעה של גנים מועמדים. עבור חוקרים לבצע assay בפעם הראשונה, באמצעות קו תא גרורתי ביותר (כגון קו תאים אנושיים מלנומה, A375, או נגזרים גרורתי ביותר שלה) כביקורת חיובית מומלץ מאוד. יתר על כן, הגילאים המינים של העכברים להשפיע על התוצאות באופן משמעותי, ולכן מומלץ לשמור הגילאים ומין עקבי כאשר היכולות גרורתי של שורות תאים שונים מושווים. עקב הווריאציות הציגה ידי הגורמים שהוזכרו לעיל, לפחות חמישה עכברים צריך להיות מוזרק עבור כל קו התא להגיע לכל מסקנה משמעותי מבחינה סטטיסטית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	10313-021
FBS	Hyclone	SH30088.03
HBSS	Invitrogen	14175-095
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
KCl	Mallinckrodt Baker Inc.	6838-04
Na2 HPO4.7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	7896-04
KH2PO4	Mallinckrodt Baker Inc.	7100-12
Phenol red	Sigma-Aldrich	P3532
EDTA-Na	EMD Millipore	4010
Trypan Blue	Invitrogen	15250-061
Trypsin 2.5%	Invitrogen	15090-046
Ethanol	Ultrapure	200-CSGP
50 ml Falcon Tube	VWR international	89039-656
Microcentrifuge Tubes	Axygen Scientific	MCT-175-C
Falcon 70μm Cell Strainer	BD Biosciences	352350
5ml Falcon Culture Tube	VWR international	60818-576
Hemacytometer	Hausser Scientific	15170-208
1 ml syringe	BD Biosciences	329650
30 ½ gauge needle	BD Biosciences	305106
Mouse restrainer	Plas Labs Inc.	551-BSRR
Surgical scissors	Fisher Scientific	08-940
Forceps	Fisher Scientific	08-902
Dissecting Microscope	Nikon Instruments	SMZ1500
Benchtop Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Inc.	75003491