Summary
यह लेख एक प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस परख है कि मानव कैंसर कोशिका लाइनों के metastatic क्षमता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है की प्रक्रिया का वर्णन करता है.
Abstract
मेटास्टेसिस कैंसर रोगियों में मौत का प्रमुख कारण है. मेटास्टेसिस के तंत्र को समझने के लिए, एक प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस परख immunodeficient चूहों का उपयोग कर स्थापित किया गया था. यह आलेख इस परख में शामिल नमूना तैयार करने, अंतःशिरा इंजेक्शन, और फेफड़ों metastases के संवर्धन की कोशिकाओं सहित प्रक्रियाओं, रूपरेखा बनाती है. संक्षेप में, मानव कैंसर की कोशिकाओं के एक पूर्व निर्धारित संख्या के लिए तैयार थे
Protocol
1. नमूना तैयार
- ~ 70% वृद्धि कारक या FBS के साथ उनकी विशिष्ट मीडिया में मिला हुआ है (उदाहरण के लिए, MC-1 कोशिकाओं के लिए 10% FBS के साथ DMEM) कोशिकाओं के विकास. थाली से मीडिया Aspirate और धीरे x 1 पीबीएस (8 ग्राम / एल NaCl, 0.2 छ / KCl के एल, 1.15 छ / एल ना 2 4 HPO के 0.7 एच 2 हे, 0.2 ग्राम / KH पीओ की 2 एल के साथ कई बार धोने 4, 7.3 पीएच).
- Aspirate पीबीएस और versene में 0.05% trypsin (0.014 ग्राम / phenol लाल और 0.2 छ / एल 1 x Pbs, 7.2 पीएच में EDTA ना के एल) के 2 एमएल जोड़ें. धीरे थाली रॉक थाली से सेल टुकड़ी की सुविधा. एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण. यह आमतौर पर अलग कोशिकाओं के लिए 2-5 मिनट लगते हैं.
- मीडिया के एक पर्याप्त मात्रा FBS (या सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला) युक्त trypsin गतिविधि बुझाने के लिए और एक 50ml बाज़ ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा जोड़ें. एक hemacytometer का उपयोग कोशिकाओं को गिन लो. एक साफ hemacytometer पर सेल निलंबन के 10μL लोड. एमएल प्रति कोशिकाओं की संख्या पांच 4 10 से गुणा वर्गों के प्रत्येक में # कोशिकाओं के औसत के बराबर है.
- 1000 में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र आरपीएम (या ~ 200 XG) 3 मिनट के लिए एक benchtop अपकेंद्रित्र में.
- ध्यान से सेल गोली परेशान बिना मीडिया को हटा दें. हैंक्स बैलेंस्ड बफर समाधान (HBSS) का एक उचित मात्रा में कोशिकाओं Resuspend ~ x 10 6 कोशिकाओं / एमएल 5 के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए.
- फाल्कन 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से फ़िल्टर कोशिकाओं बड़े सेल समुच्चय को बाहर करने के लिए. एक लेबल 5ml फाल्कन संस्कृति ट्यूब पर फिल्टर पर सीधे विंदुक के टिप पर रखें. जल्दी फिल्टर के माध्यम से संस्कृति ट्यूब में निलंबन बेदखल करना.
- कोशिकाओं को फिर से गणना एक hemacytometer का उपयोग और उन्हें 2.5 x 10 6 एमएल / के अंतिम एकाग्रता के लिए पतला . बर्फ पर कोशिकाओं रखो.
- कक्षों की व्यवहार्यता का निर्धारण करते हैं. मिक्स trypan नीले रंग के साथ कुछ कोशिकाओं और कुल एक hemacytometer का उपयोग कर कक्षों पर मृत कोशिकाओं (नीला) के प्रतिशत को मापने. कक्षों की व्यवहार्यता ≥ 90% इंजेक्शन के लिए पहले किया जाना चाहिए.
2. अंतःशिरा इंजेक्शन
- दस्ताने बदलें. धीरे एक immunodeficient माउस (नग्न, इशारा SCID, या एनएसजी, जैक्सन प्रयोगशाला) की पूंछ हड़पने और यह माउस restrainer में भट्ठा और इसकी पूंछ के खिलाफ अपनी पीठ restrainer के पीछे छोटे से खोलने के बाहर चिपके के साथ, पुल .
- धीरे धीरे भट्ठा साथ आवक अंगूठी स्लाइड और यह जगह में बंद कर एक बार अंगूठी माउस के मुंह पकड़ता. माउस को आसानी से ले जाने में सक्षम नहीं हो, लेकिन श्वास की सामान्य दर होनी चाहिए चाहिए.
- प्रमुख पूंछ नसों का पता लगाएं. चार प्रमुख रक्त वाहिकाओं के एक माउस पूंछ में मौजूद हैं. पूंछ के पृष्ठीय और ventral तरफ रक्त वाहिकाओं धमनियों हैं. नसों पूंछ के पार्श्व पक्षों पर हैं.
- एक 1ml सिरिंज में तैयार की कोशिकाओं के 200 से अधिक μL ड्रा. 2 / 30 G1 इंच सुई संलग्न है और बाहर है कि मौजूद हो सकता है किसी भी हवाई बुलबुले धक्का. सिरिंज में कोशिकाओं के अंतिम मात्रा μL 200 (यानी, 5 x 10 कुल 5 कोशिकाओं) होना चाहिए.
- पूंछ नस में कोशिकाओं इंजेक्षन.
- पूंछ के बाहर का अंत से शुरू करें, तो अगर पहला परीक्षण विफल रहता है, पूंछ का एक अधिक समीपस्थ क्षेत्र एक दूसरी कोशिश के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- 70% इथेनॉल के साथ पूंछ पोछो. सीधे पूंछ खींचो. अंगूठे के साथ पूंछ की नोक पकड़ो और तर्जनी के साथ इंजेक्शन के लिए बिंदु समर्थन.
- नस सुई डालें और कोशिकाओं इंजेक्षन. सुनिश्चित करें कि सुई और सिरिंज इंजेक्शन के दौरान नस के समानांतर हैं, अन्यथा सुई पोत दीवार के माध्यम से प्रहार और आसन्न पूंछ ऊतकों में कोशिकाओं इंजेक्षन जाएगा.
- सुई इंजेक्शन के बाद वापस ले लें. रक्त इंजेक्शन साइट से विपुल अगर इंजेक्शन सफलतापूर्वक चला गया होना चाहिए. कागज तौलिया या इंजेक्शन साइट पर कपास झाड़ू के एक स्वच्छ टुकड़ा प्रेस थक्के को सुविधाजनक बनाने, और संचलन में नस में किसी भी अवशिष्ट नमूना धक्का पूंछ ऊपर टटोलना.
- Restrainer से माउस रिलीज और उसे पिंजरे में वापस. इंजेक्शन प्रक्रिया (उदाहरण के लिए, कितने परीक्षण यह करने के लिए कोशिकाओं इंजेक्षन लिया और कितना कोशिकाओं थे इंजेक्शन) एक प्रयोगशाला नोटबुक में रिकार्ड है.
- इंजेक्शन के बाद कक्षों की व्यवहार्यता, नमूना तैयार की धारा में वर्णित के रूप में निर्धारित करने के लिए, चरण 9. यह कदम आश्वासन है कि कोशिकाओं को इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान जिंदा रहने के लिए प्रदान करता है. एक इंजेक्शन के प्रयोग के अंत में, कक्षों की व्यवहार्यता गिरावट आई, लेकिन 80% से ऊपर होना चाहिए.
- (वैकल्पिक) नीचे बचे हुए कोशिकाओं स्पिन और पीबीएस के साथ छर्रों एक बार कुल्ला. भविष्य के विश्लेषण (जैसे, पश्चिमी blots जीन अभिव्यक्ति या knockdowns पुष्टि) के लिए -80 oC में छर्रों रुक.
- आमतौर पर एक या दो महीने के बाद, चूहों और dissected किया जाएगा metastases के स्थानों निहायत निर्धारित कर रहे हैं. फेफड़ों मेटास्टेसिस के लिए प्राथमिक साइट है, के बाद से यह पहली केशिका बिस्तर हैं कि कोशिकाओं के बाद वे मुठभेड़संचलन में प्रवेश.
- Pbs, फेफड़ों (या अन्य ऊतकों युक्त मेटास्टेसिस) में से प्रत्येक के पालि के साथ rinsing के बाद एक विदारक माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) के तहत मनाया जाता है. फेफड़ों के दोनों पक्षों पर detectable metastases के संख्या में गिना है और फेफड़ों metastases के कुल संख्या के रूप में सभी चार lobes पर फेफड़ों metastases के नंबरों को एक साथ जोड़ रहे हैं 1 फेफड़े metastases के और अधिक आसानी से अगर फेफड़ों formalin रातोंरात में तय कर रहे हैं पता चला रहे हैं. , के बाद से metastases आसन्न काले भूरे रंग फेफड़ों के ऊतकों के विपरीत में सफेद धब्बे के रूप में apppear जाएगा.
3. फेफड़े Metastases से संवर्धन कक्ष
- फेफड़े metastases चूहों अंतःक्षिप्त से अलग कर रहे हैं. प्रत्येक अलग सभ्य होना चाहिए.
- प्रत्येक मेटास्टेसिस एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी पर एक सुई टोपी (बाँझ) के अंत से कीमा बनाया हुआ है.
- मध्यम और एकत्र की कोशिकाओं है कि एक संस्कृति डिश में फिल्टर के माध्यम से पारित के कई MLS के साथ सेल झरनी कुल्ला.
- 37 ° C पर गड़बड़ी के बिना कम से कम चार दिनों के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- पीबीएस के साथ पकवान पर खून या ऊतक मलबे दूर धो लें.
- ताजा मध्यम जोड़ें. शुरुआत में, दोनों कैंसर की कोशिकाओं और fibroblast कोशिकाओं प्लेटों पर बढ़ती है, लेकिन धीरे - धीरे, fibroblast कोशिकाओं बाहर मरने और कैंसर की कोशिकाओं द्वारा प्रतिस्थापित. यदि कैंसर की कोशिकाओं को किसी भी दवा प्रतिरोधी जीन ले, इसी एंटीबायोटिक दवाओं के साथ कक्षों का चयन करें.
- व्युत्पन्न कोशिकाओं की पवित्रता मानव विशिष्ट प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग immunostaining द्वारा मूल्यांकन है. हम एक विरोधी मानव vimentin एंटीबॉडी (एनसीएल वीआइएम-V9, Novocastra) का उपयोग करें. कोशिकाओं हम व्युत्पन्न मानव कोशिकाओं के 99% से अधिक आम तौर पर दवा के चयन के अभाव में भी होते हैं. नव ली गई कोशिकाओं immunodeficient चूहों में फिर इंजेक्शन सकता है और उनके metastatic क्षमताओं का परीक्षण, के रूप में ऊपर वर्णित है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
- इस परख के अंत में, एक उच्च metastatic कैंसर कोशिका लाइन आमतौर पर कई फेफड़ों मेटास्टेसिस (चित्रा 1), 1 को जन्म देता है, जबकि बहुत कुछ फेफड़ों metastases एक खराब metastatic कैंसर कोशिका लाइन से आ जाएगा .
- निकाली गई कोशिकाओं को इस पद्धति का उपयोग आमतौर पर माता - पिता की लाइन है, जब वे फिर से इस परख का उपयोग कर परीक्षण कर रहे हैं अधिक से अधिक metastases के लिए जन्म दे 1-3.
चित्रा 1. पूंछ की नस कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्शन के बाद माउस फेफड़ों के प्रतिनिधि छवियाँ. 5 10 metastatic मानव मेलेनोमा सेल लाइन, एस.एम. कोशिकाओं, 4 x 5 immunodeficient चूहों की पूंछ नस में इंजेक्शन थे. दो महीने बाद, फेफड़ों अलग थे और मेटास्टेसिस पाए गए सामान्य फेफड़े के ऊतकों के बीच छितरी हुई.
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Discussion
मेटास्टेसिस कैंसर रोगियों में मौत का प्रमुख कारण है. उनके प्राथमिक loci, परिसंचरण में उनके प्रवेश (intravasation), परिसंचरण (extravasation) से उनके बाहर निकलने, और अस्तित्व और एक दूर के अंग में वृद्धि से कैंसर की कोशिकाओं की टुकड़ी: यह चार प्रमुख कदम शामिल है. मानव में मेटास्टेसिस एक धीमी प्रक्रिया माना जाता है और अक्सर विलंबता के वर्षों के बाद प्रकट. इसकी प्रगति में एक समय पर ढंग से अध्ययन करने के लिए, ऊपर अपेक्षाकृत जल्दी प्रयोगात्मक परख immunodeficient चूहों में स्थापित किया गया था अपनी स्थापना के बाद से 4, इसे प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया गया है विभिन्न metastatic क्षमता के साथ कोशिकाओं को अलग, जीन है कि ऊपर या के दौरान नीचे विनियमित हैं की पहचान. मेटास्टेसिस 1,2,5, और 3 परीक्षण मेटास्टेसिस के दौरान इन जीनों के कारण भूमिका .
इस परख में सबसे चुनौतीपूर्ण कदम पूंछ नस में कोशिकाओं इंजेक्षन है. यह प्रथाओं इंजेक्शन कौशल मास्टर लेता है. यहां तक कि एक अनुभवी शोधकर्ता के लिए, एक सफल इंजेक्शन को प्राप्त करने से पहले कई परीक्षण बहुत आम हैं. माउस पूंछ में नसों सही उन के बीच में बेहद पतली और सम्मिलित करने के लिए सुई रहे हैं आसान नहीं है. पूंछ वार्मिंग संक्षेप में एक चिराग का उपयोग करते हुए और धीरे इंजेक्शन से पहले पूंछ मालिश रक्त वाहिकाओं के फैलाव को प्रेरित और इंजेक्शन की सुविधा सकता है. सबसे शोधकर्ताओं के लिए एक आम गलती को लगता है कि नसों पूंछ में गहरी हैं और इसलिए कोशिकाओं त्वचा में भी गहरी इंजेक्षन है. नसों वास्तव में बहुत त्वचा की सतह के करीब हैं, इसलिए संभव के रूप में के रूप में shallowly इंजेक्षन की कोशिश करनी चाहिए.
यदि सुई सफलतापूर्वक शिरा के अंदर डाला जाता है, इंजेक्शन आसानी से कोई प्रतिरोध के साथ जाना चाहिए. यदि सुई नस में नहीं डाला है लेकिन आसन्न ऊतकों में, इंजेक्शन नमूने द्रव दबाव जल्दी का निर्माण होगा और फिर नमूने के बाकी की डिलीवरी को रोकने. ऐसे में विफल रहा परीक्षण के प्रत्येक इस प्रकार कुछ नमूने खो देंगे. इस नुकसान को कम करने के लिए, एक अनुभवी शोधकर्ता भविष्यवाणी करने के लिए कि क्या सुई या नमूना की एक न्यूनतम राशि इंजेक्शन और तरल दबाव से प्रतिरोध का आकलन करके नहीं नस में है की कोशिश करता है. अगर वह प्रतिरोध लगता है, सुई नस में नहीं हो और वह तो सुई को बाहर खींच जाएगा और फिर कोशिश करें. यदि कोई प्रतिरोध महसूस किया है, सुई नस में हो सकता है और नमूने के सभी एक ही बार में अंतःक्षिप्त किया जाएगा. उत्तरार्द्ध मामले में, एक बार नमूना "शूटिंग" देख सकते हैं नस ऊपर, displacing रक्त के रूप में यह शरीर की ओर अपना रास्ता बनाती है.
जब समाप्त करने के लिए परख प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए empirically निर्धारित करना चाहिए, क्योंकि यह काफी कोशिकाओं के metastatic क्षमता पर निर्भर करता है. चूहे अलग समय बिंदुओं पर इंजेक्शन के बाद dissected किया जाएगा और फेफड़ों मेटास्टेसिस की हद तक निर्धारित किया जाता है. समय की लंबाई कि microscopically detectable फेफड़ों metastases के एक गणनीय संख्या में परिणाम आम तौर पर चुना है क्योंकि यह एक मात्रात्मक परिणाम देता है और यह भी किसी भी या metastases के उम्मीदवार जीन की गड़बड़ी की वजह से वृद्धि की कमी के लिए कमरे में छोड़ देता है. शोधकर्ताओं जो पहली बार के लिए इस परख करते हैं, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक उच्च metastatic सेल लाइन (जैसे मानव मेलेनोमा सेल लाइन, A375, या उसके अत्यधिक metastatic डेरिवेटिव के रूप में) का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है. इसके अलावा, चूहों की उम्र और लिंग के परिणाम काफी प्रभावित है, तो यह करने के लिए उम्र और लिंग के अनुरूप रखने के लिए जब विभिन्न सेल लाइनों के metastatic क्षमता की तुलना में कर रहे हैं सलाह दी जाती है. उपरोक्त कारकों द्वारा शुरू की विविधताओं के कारण, प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए कम से कम पांच चूहों इंजेक्शन जा चाहिए के लिए किसी भी सांख्यिकीय महत्वपूर्ण निष्कर्ष तक पहुँचने.
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Acknowledgments
इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया था और डॉ. रिचर्ड Hynes (एमआईटी) की प्रयोगशाला में शुरू अनुकूलित. अनुदान NYSTEM आईडिया पुरस्कार (LX के लिए) और रुथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार (LX के लिए) द्वारा प्रदान की गई है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
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- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
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