Summary
この記事では、ヒト癌細胞株の転移能を決定するために使用される実験的転移アッセイの手順を説明します。
Abstract
転移は、がん患者における死亡の主要な原因である。転移のメカニズムを理解するために、実験的転移アッセイは、免疫不全マウスを用いて設立されました。この記事では、サンプル調製、静脈内注射、および肺転移から培養細胞を含むこの検定に関わる手順を、群を区別。簡単に言えば、ヒト癌細胞の予め決められた数を調製した
Protocol
1。サンプル準備
- 成長因子やFBS（例えば、MC - 1細胞を10％FBS含有DMEM）で、その特定のメディアで〜70％コンフルエントに細胞を成長させる。プレートから培地を吸引除去し、穏やかに1 × PBS（塩化ナトリウム8gの/ L、塩化カリウム0.2 g / Lの、1.15のNa 2 HPOのG / L 4 · 7H 2 O、KH 2 POを0.2g / Lで数回洗浄4、pHは7.3）。
- 吸引PBSとヴェルセンの0.05％トリプシン（フェノールレッドおよび1 × PBS、pH7.2中EDTA - Naは0.2 g / Lの0.014グラム/ L）2 mLを加える。静かにプレートから細胞の剥離を容易にするためにプレートを揺らし。顕微鏡下で細胞を観察。それは、通常、切断するセル2-5分かかります。
- トリプシン活性をクエンチし、50mLのファルコンチューブに細胞を収集するメディアを含むFBS（または大豆トリプシン阻害剤）の十分なボリュームを追加します。血球計を用いて細胞を数える。きれいな血球計算盤の上に細胞懸濁液の10μLをロード。 mL当たりの細胞数は、10 4を掛けた5つの正方形のそれぞれの＃セルの平均値に等しくなります。
- 3分間ベンチトップ遠心機で1000 RPM（または〜200 × g）で細胞を遠心分離します。
- 慎重に細胞ペレットを乱すことなくメディアを削除します。 〜5 × 10 6細胞/ mlの最終濃度に到達するためのハンクス平衡緩衝液（HBSS）の適切な量で細胞を再懸濁します。
- ファルコン70μmのセルストレーナーを介してフィルタ細胞は大きな細胞凝集体を除外する。ラベル付け5mLのファルコンの培養チューブオーバーフィルター上に直接ピペットの先端を置きます。迅速に培養チューブにフィルターを介してサスペンションを取り出します。
- 血球計を使用して、再度セルをカウントし、2.5 × 10 6 / mlの最終濃度に希釈する。氷上で細胞を維持する。
- 細胞の生存率を決定する。トリパンブルーで一部の細胞を混合し、血球計算盤を用いて全細胞を介してデッド（青）細胞の割合を測定する。細胞の生存率は、注入前≥90％以上にする必要があります。
2。静脈注射
- 手袋を変更します。ゆっくりと免疫不全マウス（ヌード、NOD - SCID、またはNSG、ジャクソンの研究所）の尾をつかんで制止する人の後ろに小さな開口部から突き出てスリットとその尾に対して、その後ろで、マウスの制止する人にそれを引く。
- リングは、マウスの口をキャッチした後、ゆっくりスリットに沿って内側のリングをスライドさせて所定の位置にロックします。マウスは、自由に動くことができないようにする必要がありますが、呼吸の正常な速度を持つ必要があります。
- 主要な尾静脈を見つける。四主要な血管は、マウスの尾部に存在しています。尾の背側と腹側の側面上の血管は動脈です。静脈は尾の側面にあります。
- 1mLの注射器に準備した細胞の200以上μLを描く。 30 G1 / 2インチの針を取り付け、存在する可能性のある気泡を押し出す。シリンジ内の細胞の最終的な容積は200μL（すなわち、合計で5 × 10 5細胞）でなければなりません。
- 尾静脈に細胞を注入する。
- 尾の先端から開始、第一審は失敗した場合、尾部のより近位の領域は、第2のtryを使用することができる。
- 70％エタノールで尾を拭きます。まっすぐ尾を引いて。親指と尾の先端を押さえ、人差し指で注入するためのポイントをサポートしています。
- 静脈に針を挿入し、細胞を注入する。針と注射器は注射時の静脈に平行な、そうでなければ針が血管壁を通って突くと、隣接する尾の組織に細胞を注入することを確認してください。
- 注射後に針を撤回。注入が正常に行った場合、血液が注射部位から多量のはずです。凝固促進し、循環に静脈内の任意の残留サンプルをプッシュするように尾を上を触診する注射部位での紙タオルや綿棒のきれいな部分を押してください。
- 制止する人からマウスを解放し、ケージに戻す。実験ノートに（例えば、どのように多くの試験では、細胞を注入するために取り、どの程度の細胞を注入した）注入プロセスを記録します。
- として試料調製のセクションで説明されている注射後の細胞の生存率、、ステップ9を決定します。このステップでは、細胞が注入プロセスを通して生き続けるという安心感を提供します。注入実験の終了時に、細胞の生存率は低下するが、80％以上でなければなりません。
- （省略可能）残りの細胞をスピンダウンし、PBSで1回ペレットを洗う。今後の分析（例えば、遺伝子発現やノックダウンを確認するためにウエスタンブロット）を-80℃でペレットを凍結する。
- 通常、1つまたは2カ月後、マウスを解剖され、転移の場所がひどく決定されます。それは細胞が彼らの後に遭遇する最初の毛細血管床を含んでいるので、肺は、転移のプライマリサイトです。循環を入力してください。
- PBSで洗浄後、肺（または転移を含む他の組織）の各葉は、解剖顕微鏡（図1）で観察される。肺の両側に検出可能な転移の数がカウントされ、すべての4つの葉で肺転移の番号は、肺転移の合計数として加算されます。肺はホルマリン一晩で修正される場合は、1肺転移がより容易に検出されています、転移は隣接する暗褐色の肺組織とは対照的に白っぽい斑点としてapppearなりますので。
3。肺転移からの細胞培養
- 肺転移は、注入されたマウスから分離されています。それぞれが別々に培養する必要があります。
- それぞれの転移は、70μmのセルストレーナーで針のキャップ（無菌）の終わりまでに刻まれている。
- 培地と培養皿でフィルタを通過回収した細胞のいくつかのMLSとセルストレーナーを洗浄します。
- 煩わされることなく、少なくとも4日間、37℃で細胞をインキュベートする。
- PBSでシャーレに血液や組織の破片を洗い流す。
- 新鮮な培地を追加。初めに、癌細胞と線維芽細胞の両方は、プレート上に成長するが、徐々に、線維芽細胞が死に絶えるだろうと癌細胞に置き換えられます。がん細胞は、任意の薬剤耐性遺伝子を運ぶ場合は、対応する抗生物質で細胞を選択する。
- 由来細胞の純度は、ヒト特異的蛋白質に対する抗体を用いた免疫染色によって評価される。我々は、抗ヒトビメンチン抗体（NCL - VIM - V9、Novocastra）を使用します。我々が由来する細胞は、さらに薬剤の選択がない場合には、ヒト細胞の99％以上、典型的に含まれています。新たに由来する細胞は、上述したように、それらの転移能力をテストするための免疫不全マウスに再注入することができます。
4。代表的な結果
- 非常に少数の肺転移が不完全に転移性癌細胞株から来る間、このアッセイの終わりには、高転移性癌細胞株は、通常、多くの肺転移（図1）を生じさせる1。
- このメソッドを使用して派生した細胞は通常、彼らは再びこのアッセイを使用してテストしている親の行、より多くの転移を生じさせる。1-3
がん細胞の尾静脈注射後のマウスの肺の図1。代表画像。転移性ヒトメラノーマ細胞株、SM細胞、4の5 × 10 5は、免疫不全マウスの尾静脈に注射した。 2ヵ月後、肺を単離し、そして転移は通常の肺組織に分散発見された。
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Discussion
転移は、がん患者における死亡の主要な原因である。彼らの主要な遺伝子座、循環への参入（管内）、循環（血管外漏出）から、これらの終了、および遠隔臓器の生存と成長から癌細胞の剥離：これは、4つの主要な手順が含まれます。人間の転移はゆっくりとしたプロセスとみなされ、多くの場合、待ち時間の年後に明示される。タイムリーにその進行を勉強するために、上記の比較的迅速な実験的なアッセイは、免疫不全マウスに設立されました。4設立以来、それは別の転移能力を持つ細胞を分離するために効果的に使用されている、アップまたはダウンレギュレート中にある遺伝子を同定転移1,2,5、および転移の間にこれらの遺伝子の因果役割をテストする3。
このアッセイで最も挑戦的なステップは、尾静脈に細胞を注入することです。それは注入するスキルを習得する実践を取ります。ベテランの研究者のために、成功した注入を達成する前にいくつかの試験は非常に一般的です。マウスの尾の静脈は右それらの中間の非常に薄いと、挿入針です簡単ではありません。簡単にランプを使用して尾をウォームアップし、注射は血管の拡張を誘導し、注入を容易にすることができる前に軽く尾をマッサージ。ほとんどの研究者のためのよくある間違いは、静脈は尾部で深くなるため、皮膚への深すぎる細胞を注入すると仮定することです。静脈は、実際に皮膚の表面に非常に近いもの、したがって1つは、可能な限り浅く注入するようにしてください。
針が正常に静脈内に挿入されている場合は、注射は抵抗なしでスムーズに進むでしょう。針が静脈ではなく、隣接する組織中に挿入されていない場合、注入された試料は、速やかに流体の圧力を構築し、試料の残りの配信を防止します。そのような失敗した各試行は、このようにいくつかのサンプルを失うことになる。この損失を最小限に抑えるために、経験豊富な研究者は、針が試料の最小限の量を注入し、流体圧から抵抗を評価することで静脈にあるかどうかの予測を試みます。彼は抵抗を感じる場合、針が静脈にあってはいけません、彼はその後、針を抜くと再試行します。は抵抗を感じされていない場合は、針が静脈内に存在する必要がありますし、サンプルのすべてを一度に注入されます。後者のケースでは、人はしばしば、それが身体に向かって、その方法を作るように血液を置換し、静脈までのサンプル"芽"を見ることができます。
検定を終了するときに細胞の転移電位に応じて大きく変化するため、各細胞株については経験的に決定されるべきである。マウスは注射後の異なる時点で解剖され、肺転移の範囲が決定されます。それは定量的な結果を与え、また、候補遺伝子の摂動によって引き起こされる転移のあらゆる増大または減少のために部屋を出るので、顕微鏡で検出可能な肺転移の可算数の結果は通常、選択されている時間の長さ。ポジティブコントロールとして高転移性細胞株（例えば、ヒトメラノーマ細胞株、A375、またはその高転移性誘導体など）を使用して、初めてこのアッセイを行う研究者のために強くお勧めします。さらに、マウスの年齢と性別が大幅に結果に影響を与える、それが別の細胞株の転移能を比較したときの年齢と性別の一貫性を保つようにアドバイスされるように。上記の要因によって導入された変動に起因する、少なくとも5つのマウスは、統計的に有意な結論に到達する各セルラインに注入する必要があります。
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Acknowledgments
このプロトコルは、検査の結果、博士リチャードハインズ（MIT）の研究室で最初に最適化されていました。資金調達はNYSTEMアイデア賞（LXへ）とルースL.キルシュシュタイン国立リサーチサービス賞（LXへの）によって提供されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
