Summary
В этой статье описываются процедуры анализа экспериментальных метастазов, который используется для определения метастатического потенциала человеческих клеточных линий рака.
Abstract
Метастазы являются основной причиной смерти у онкологических больных. Чтобы понять механизм метастазирования, экспериментальные анализа метастазы был установлен с использованием иммунодефицитных мышей. Данная статья описывает процедуры, связанные в этом анализе, в том числе подготовка проб, внутривенные инъекции, и культивирования клеток от метастазов в легких. Короче говоря, заранее оговоренное число раковых клеток человека были подготовлены
Protocol
1. Подготовка образцов
- Расти клетки ~ 70% сливающийся в их конкретных средств массовой информации с факторами роста или FBS (например, DMEM с 10% FBS для МС-1 клеток). Аспирируйте средств массовой информации из пластины и аккуратно мыть несколько раз с 1 х PBS (8 г / л NaCl, 0,2 г / л KCl, 1,15 г / л Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 0,2 г / л KH 2 PO 4, рН 7,3).
- Аспирируйте PBS и добавьте 2 мл 0,05% трипсина в версена (0,014 г / л фенола красного и 0,2 г / л ЭДТА-Na в 1 х PBS, рН 7,2). Аккуратно каменную плиту, чтобы облегчить ячейки отрыв от пластины. Соблюдайте клетки под микроскопом. Обычно это занимает 2-5 минут для клеток необходимо отсоединить.
- Добавить достаточным объемом сред, содержащих FBS (или ингибитором трипсина сои), чтобы утолить трипсин активности и сбора клеток в 50 мл трубки сокола. Граф клеток с использованием hemacytometer. Нагрузка 10 мкл суспензии клеток на чистую hemacytometer. Число клеток в мл равна средней # клеток в каждом из пяти квадратов умножается на 10 4.
- Центрифуга клетки при 1000 оборотов в минуту (или ~ 200 мкг) в настольных центрифуг в течение 3 минут.
- Осторожно снимите СМИ, не нарушая клеточный осадок. Ресуспендируют клеток в соответствующий объем Хэнкс Сбалансированный буферного раствора (HBSS), чтобы достичь конечной концентрации ~ 5 х 10 6 клеток / мл.
- Фильтры клеток через Сокол 70 мкм сито ячейки, чтобы исключить крупные агрегаты клеток. Место кончика пипетки непосредственно на фильтре более помечены 5 мл трубку культуры Falcon. Быстро извлечь суспензии через фильтр в пробирку.
- Граф еще раз, используя клетки hemacytometer и разбавить их конечной концентрации 2,5 х 10 6 / мл. Держите клетки на льду.
- Определение жизнеспособности клеток. Смешайте несколько клеток с трипанового синего и измерить процентное содержание мертвых (синий) клетки более общий клеток с использованием hemacytometer. Жизнеспособность клеток должна быть ≥ 90% перед инъекцией.
2. Внутривенных инъекций
- Изменение перчатки. Аккуратно захватите хвост иммунодефицитных мышей (ню, NOD-SCID, или ГЯП, Лаборатория Джексона) и потяните ее на мыши фиксатор, с его спиной к щели и хвост, торчащие из маленького отверстия в задней части фиксатор .
- Медленно слайд кольцо внутрь вдоль щели и зафиксировать ее на месте когда-то кольцо бросается в устье мыши. Мышь не должны иметь возможность свободно передвигаться, но должны иметь нормальный темп дыхания.
- Найти основные вены хвоста. Четыре крупных кровеносных сосудов присутствуют в мышь хвоста. Кровеносные сосуды на спинной и брюшной сторонах хвоста артерий. Вены находятся на боковых сторонах хвоста.
- Нарисуйте более 200 мкл подготовленных клеток в 1 мл шприца. Прикрепить 30 G1 / 2 дюйма иглы и вытолкнуть пузырьков воздуха, которые могут существовать. Конечный объем клеток в шприце должно быть 200 мкл (например, 5 х 10 5 клеток в общей сложности).
- Inject клетки в хвостовую вену.
- Начните с дистального конца хвоста, так что если первый процесс не удается, более проксимальной области хвоста могут быть использованы для второй попытки.
- Протрите хвост с 70% этанола. Потяните хвост прямой. Держите кончик хвоста с большим и поддержку точки для инъекций с указательным пальцем.
- Вставьте иглу в вену и ввести клетки. Убедитесь в том, игл и шприцев параллельны вены во время инъекции, иначе игла будет тыкать через стенку сосуда и придать клеток в окружающие ткани хвоста.
- Снять иглу после инъекции. Кровь следует обильно из места инъекции, если инъекции прошел успешно. Пресс чистый кусок бумажной салфеткой или ватным тампоном на месте инъекции для облегчения свертывания крови, и ощупывать хвостом вверх, чтобы подтолкнуть любой остаточной образца в вену в обращение.
- Отпустите кнопку мыши, из фиксатор и вернуть его в клетку. Запись инъекции процесса (например, сколько попыток понадобилось вводить клетки и сколько клетки вводили) в лаборатории ноутбука.
- Определить жизнеспособность клеток после инъекции, как описано в разделе подготовки проб, Шаг 9. Этот шаг дает уверенность в том, что клетки, остаться в живых протяжении процесса впрыска. В конце эксперимента инъекции, жизнеспособность клеток будет снижаться, но должна быть выше 80%.
- (Опционально) спином вниз оставшиеся клетки и промыть гранулы с PBS один раз. Замораживание гранул при температуре -80 ° С для будущего анализа (например, западная пятна, чтобы подтвердить экспрессии генов или нокдаунов).
- Обычно после одного-двух месяцев, мышей будет расчленена и расположения метастазов грубо определена. Легких является основной сайт для метастазирования, так как он содержит первую капиллярного русла, что клетки встреча после того как онивведите обращении.
- После промывки PBS, каждый доли легкого (или других тканей, содержащих метастазов) наблюдается при вскрытии микроскопа (рис. 1). Число обнаруживаемых метастазов по обе стороны легких считается и количество метастазов в легких на все четыре доли складываются как общее количество метастазов в легких. 1 метастазов легкого легче обнаружить, если легкие фиксировали в формалине ночь , так как метастазы будет apppear как белесые пятна, в отличие от соседней темной легкого коричневого тканей.
3. Культивирования клеток от метастазов в легких
- Метастазов в легких изолированы от вводили мышам. Каждый из них должен быть культурным отдельно.
- Каждый метастазы измельчается до конца колпачок с иглы (стерильные) на 70 ячейки фильтра мкм.
- Промойте ячейки фильтра с несколькими мл средних и собранных клеток, которые проходят через фильтр в культуре блюдо.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение по крайней мере, четыре дня без нарушений.
- Смыть крови или тканей мусора на блюдо с PBS.
- Добавить свежую среду. В начале, как раковые клетки и фибробласты клетки растут на пластинках, но постепенно, клеток фибробластов вымрет и будет заменен раковых клеток. Если раковые клетки несут никакой гены лекарственной устойчивостью, выделите ячейки с соответствующими антибиотиками.
- Чистотой клеток, полученных является методом иммуногистохимии с использованием антител против человека-специфических белков. Мы используем анти-человеческий виментин антител (NCL-ВИМ-V9, Novocastra). Клетки мы получили обычно содержат более 99% клеток человека, даже в случае отсутствия наркотика выбора. Вновь клеток, полученных могло быть введен снова в иммунодефицитных мышей, чтобы проверить их метастатической способности, как описано выше.
4. Представитель Результаты
- В конце этого теста, высокой метастатической линии раковых клеток обычно возникает много метастаз легких (рис. 1), 1 в то время как очень немногие метастазы легких будет поступать из плохо метастатическим линии клеток рака.
- Клетки, полученные с помощью этого метода обычно приводит к более метастазов, чем родительские линии, когда они проверяются еще раз, используя результаты анализа. 1-3
Рисунок 1. Представителю изображения мышью легких после хвостовую вену инъекции раковых клеток. 5 х 10 5 метастатических линии человеческих клеток меланомы, С. М. клетки, 4 вводили в хвостовую вену иммунодефицитных мышей. Два месяца спустя, легкие были изолированы и метастазы были обнаружены рассеянные среди нормальной ткани легкого.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метастазы являются основной причиной смерти у онкологических больных. Она включает в себя четыре основных этапа: отряд раковые клетки от их основных локусов, их вступление в обращении (intravasation), их выезда из кровообращения (кровоизлияние), а выживание и рост в далеком органа. Метастазы в человеческой считается медленным процессом и часто проявляется после нескольких лет ожидания. Для изучения его прогрессирования своевременно, выше относительно быстро экспериментального анализа была создана в иммунодефицитных мышей. 4 С момента своего создания она была использована эффективно, чтобы изолировать клетки с различным метастатическим способностей, выявление генов, вверх или вниз регулируется во время метастазы 1,2,5, и проверить причинную роль этих генов в процессе метастазирования. 3
Наиболее сложным шагом в этом анализе есть вводить клетки в хвостовую вену. Требуется практика, чтобы мастер инъекционных навыков. Даже для опытного исследователя, несколько испытаний до достижения успешных инъекций очень распространены. Жил в мыши хвосты чрезвычайно тонкий и вставьте иглы прямо в центре их не так просто. Разогрев хвост коротко использованием лампы и мягко массируя хвостом перед инъекциями может вызвать расширение кровеносных сосудов и облегчению инъекций. Распространенной ошибкой для большинства исследователей предположить, что вены глубоко в хвосте, и поэтому вводить клетки слишком глубоко в кожу. Вены на самом деле очень близко к поверхности кожи, поэтому нужно попытаться придать как неглубоко насколько это возможно.
Если игла успешно добавлены в вену, инъекции должны идти гладко, без каких-либо сопротивления. Если игла не вставлен в вену, а в прилегающих тканей, образцы вводили будет наращивать давление жидкости быстро, а затем предотвратить доставку остальных образцов. Каждое из таких исследований не удалось, таким образом, теряют часть образцов. Чтобы свести к минимуму эти потери, опытный исследователь пытается предсказать, будет ли игла в вене или нет, вводя минимальное количество образцов и оценки сопротивления давления жидкости. Если он чувствует сопротивление, иглы не должны быть в вену, и он будет затем выньте иглу и попробовать еще раз. Если не почувствуете сопротивление, игла должна быть в вену и все образцы будут внесены сразу. В последнем случае часто можно увидеть образец «выстреливает» вверх вены, вытесняя кровь, как это делает его путь к телу.
Когда следует прекратить анализ должен быть определен эмпирически для каждой клеточной линии, так как она значительно варьирует в зависимости от метастатического потенциала клеток. Мыши будут расчлененный в различные моменты времени после инъекции, а также степень легких метастазов определяется. Период времени, что приводит к счетное число микроскопически обнаруживаются метастазы в легких, как правило, выбрали, поскольку она дает количественный результат, а также оставляет место для какой-либо увеличение или уменьшение метастазов вызванных возмущением генов-кандидатов. Для научных работников, которые выполняют данного анализа в первый раз, с использованием высокой метастатической клеточной линии (например, линии человеческих клеток меланомы, A375, или ее высокой метастатической производных) в качестве положительного контроля настоятельно рекомендуется. Кроме того, возрастов и полов мышей повлиять на результаты значительно, поэтому рекомендуется держать возраста и пола при последовательной метастатической способности различных клеточных линий сравниваются. В связи с изменениями введено факторов, упомянутых выше, по меньшей мере пять мышей следует вводить для каждой клеточной линии, чтобы достичь какого-либо статистически значимые выводы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Этот протокол был протестирован и оптимизирован первоначально в лаборатории д-р Ричард Хайнс (MIT). Финансирование предоставляется AWARD NYSTEM IDEA (для LX) и Рут Л. Kirschstein Национальный исследовательский Service Award (для LX).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
