Summary
En este artículo se describen los procedimientos de ensayo de metástasis experimental que se utiliza para determinar el potencial metastásico de líneas celulares de cáncer humano.
Abstract
La metástasis es la causa principal de muerte en pacientes con cáncer. Para entender el mecanismo de la metástasis, un ensayo de metástasis experimental se estableció el uso de ratones inmunodeficientes. Este artículo delinea los procedimientos involucrados en este ensayo, incluyendo la preparación de muestras, la inyección intravenosa, y el cultivo de células de metástasis pulmonares. En pocas palabras, un número determinado de células de cáncer humano se prepararon
Protocol
1. Preparación de la muestra
- Se cultivan las células confluentes a ~ 70% en sus medios de comunicación específicos con factores de crecimiento o FBS (por ejemplo, DMEM con FBS al 10% de MC-1 en las células). Aspirar los medios de comunicación de la placa y lavar suavemente varias veces con 1 x PBS (8 g / l de NaCl, 0,2 g / L de KCl, 1,15 g / L de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 0,2 g / L de KH 2 PO 4, pH 7,3).
- Aspirar PBS y añadir 2 ml de tripsina 0,05% en versene (0,014 g / L de rojo de fenol y 0,2 g / l de EDTA-Na en 1 x PBS, pH 7,2). Agite suavemente la placa para facilitar el desprendimiento de células de la placa. Observar las células bajo un microscopio. Por lo general tarda 2-5 minutos para que las células se despeguen.
- Añadir un amplio volumen de los medios de comunicación que contiene FBS (o un inhibidor de tripsina de soja) para apagar la actividad de la tripsina y recoger las células en un tubo de 50 ml halcón. Recuento de células con un hemocitómetro. Carga 10μL de suspensión celular en un hemocitómetro limpio. El número de células por ml es igual a la media de # de células en cada una de las cinco plazas, multiplicado por 10 4.
- Centrifugar las células a 1000 rpm (o ~ 200 xg) en una centrífuga de mesa durante 3 minutos.
- Retire con cuidado los medios de comunicación sin perturbar el sedimento celular. Resuspender las células en un volumen adecuado de solución de Hanks equilibrada Buffer (HBSS) para llegar a una concentración final de ~ 5 x 10 6 células / ml.
- Las células del filtro a través de un Falcon 70 m de células colador para excluir a los agregados de células grandes. Coloque la punta de la pipeta directamente sobre el filtro en un tubo de 5 ml etiquetados cultura Falcon. Rápida expulsión de la suspensión a través del filtro en el tubo de la cultura.
- Contar las células de nuevo con un hemocitómetro y se diluye a una concentración final de 2,5 x 10 6 / ml. Mantener las células en hielo.
- Determinar la viabilidad de las células. Mezclar un poco de las células con azul tripán y medir el porcentaje de muertos (azul), las células en el total de células con un hemocitómetro. La viabilidad de las células debe ser ≥ 90% antes de la inyección.
2. Inyección intravenosa
- Cambiar los guantes. Suavemente agarrar la cola de un ratón inmunodeficiente (desnudo, NOD-SCID, o sin garantía soberana, de laboratorio de Jackson) y tire de ella en la inmovilización del ratón, con la espalda contra la ranura y la cola que sobresale de la pequeña abertura en la parte posterior de la inmovilización .
- Deslice lentamente el anillo hacia adentro a lo largo de la ranura y bloqueo en su lugar una vez que el anillo de las capturas de la boca del ratón. El ratón no debe ser capaz de moverse libremente, pero debe tener ritmo normal de respiración.
- Encuentra las grandes venas de la cola. Cuatro principales vasos sanguíneos están presentes en una cola de ratón. Los vasos sanguíneos en los lados dorsal y ventral de la cola son las arterias. Las venas están en los lados laterales de la cola.
- Atraer a más de 200 l de las células preparado en una jeringa de 1 ml. Coloque la aguja 30 G1 / 2 pulgadas y empuje las burbujas de aire que puedan existir. El volumen final de células en la jeringa debe ser de 200 l (es decir, 5 x 10 5 células en total).
- Inyectar las células en la vena de la cola.
- Empezar desde el extremo distal de la cola, así que si la primera prueba falla, una región más proximal de la cola podría ser utilizado para un segundo intento.
- Limpiar la cola con un 70% de etanol. Tirar de la cola recta. Sostenga la punta de la cola con el pulgar y apoyar el punto de inyección con el dedo índice.
- Insertar la aguja en la vena y se inyecta las células. Asegúrese de que la aguja y la jeringa son paralelas a la vena durante la inyección, de lo contrario la aguja se asoman a través de la pared del vaso e inyectar las células en los tejidos adyacentes cola.
- Retire la aguja después de la inyección. La sangre debe abundante del lugar de inyección si la inyección se fue con éxito. Pulse una hoja limpia de papel toalla o paño de algodón en el sitio de la inyección para facilitar la coagulación, y palpar la cola hacia arriba para empujar cualquier muestra residual en la vena en circulación.
- Suelte el ratón de la inmovilización y el retorno a la jaula. Registrar el proceso de inyección (por ejemplo, cuántas pruebas se llevaron a inyectar las células y la cantidad de células fueron inyectadas) en un cuaderno de prácticas.
- Determinar la viabilidad de las células después de la inyección, como se describe en la Sección de Preparación de la muestra, el paso 9. Este paso ofrece la seguridad de que las células de mantenerse con vida durante todo el proceso de inyección. Al final de un experimento de inyección, la viabilidad de las células se reducirá, pero debe estar por encima del 80%.
- (Opcional) Decantar las células sobrantes y aclarar las pastillas una vez con PBS. Congelar los pellets a -80 º C para análisis futuros (por ejemplo, transferencias Western para confirmar la expresión de genes o caídas).
- Normalmente, después de uno o dos meses, los ratones se diseca y la ubicación de las metástasis se determinan groseramente. De pulmón es el principal sitio de metástasis, ya que contiene el primer lecho capilar que encuentran las células después de queentrar en la circulación.
- Después de lavar con PBS, cada lóbulo del pulmón (u otros tejidos que contienen metástasis) se observa bajo un microscopio de disección (Figura 1). El número de metástasis detectable en ambos lados de los pulmones se cuenta y el número de metástasis pulmonares en los cuatro lóbulos se suman como el número total de metástasis pulmonares. 1 metástasis pulmonares son más fáciles de detectar si los pulmones están fijadas en formol durante la noche , ya que las metástasis Entonces aparecerá como manchas blancas en contraste con los tejidos adyacentes de pulmón marrón oscuro.
3. El cultivo de células de metástasis pulmonares
- Las metástasis pulmonares son aislados de los ratones inyectados. Cada uno debe cultivar por separado.
- Cada metástasis es picada por el final de una tapa de la aguja (estéril) en un filtro de 70 micras de células.
- Enjuague el filtro celular con varios ml de medio y las células recogidas que pasan por el filtro en una placa de cultivo.
- Se incuban las células a 37 ° C durante al menos cuatro días sin interrupción.
- Lavar la sangre o restos de tejido en el plato con PBS.
- Añadir un nuevo medio. En un principio, tanto las células cancerosas y las células de fibroblastos crecen en las placas, pero poco a poco, las células de fibroblastos se extinguirá y será reemplazado por las células cancerosas. Si las células de cáncer de llevar a cualquier genes resistentes a los medicamentos, seleccione las celdas con los antibióticos correspondientes.
- La pureza de las células derivadas es evaluada por tinción con anticuerpos contra el virus de proteínas específicas. Utilizamos un anticuerpo anti-humano vimentina (VIM-NCL-V9, Novocastra). Las células que contienen por lo general deriva más del 99% de las células humanas, incluso en ausencia de la selección de medicamentos. Las nuevas células derivadas podrían ser inyectados de nuevo en ratones inmunodeficientes para poner a prueba sus habilidades metastásico, como se describió anteriormente.
4. Resultados representante
- Al final de este ensayo, una línea celular de cáncer altamente metastásico normalmente da lugar a metástasis pulmonares muchos (Figura 1), mientras que una metástasis pulmonares muy pocos provienen de una línea de cáncer de células poco metastásicas.
- Las células derivadas usando este método suele dar lugar a metástasis más que la línea de los padres, cuando ellos se ponen a prueba una vez más utilizando este ensayo. 3.1
Figura 1. Imágenes representativas de los pulmones del ratón después de las inyecciones vena de la cola de las células cancerosas. 5 x 10 5 de la metastásico línea celular humana de melanoma, las células de SM, 4 fueron inyectados en la vena de la cola de ratones inmunodeficientes. Dos meses más tarde, los pulmones fueron aislados y las metástasis se encuentran dispersos entre el tejido pulmonar normal.
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Discussion
La metástasis es la causa principal de muerte en pacientes con cáncer. Se trata de cuatro pasos principales: el desprendimiento de las células cancerosas de sus lugares principales, su entrada en circulación (intravasation), su salida de la circulación (extravasación), y la supervivencia y el crecimiento en un órgano distante. Metástasis en humanos se considera un proceso lento y muchas veces se manifiesta después de varios años de latencia. Para el estudio de su progresión en el momento oportuno, el ensayo anterior experimental relativamente rápida se estableció en ratones inmunodeficientes. 4 Desde su creación, se ha utilizado eficazmente para aislar las células con diferentes capacidades metastásicas, identificar los genes que están arriba o hacia abajo-regulado en metástasis 1,2,5 y 3 pruebas del papel causal de estos genes en la metástasis.
El paso más difícil en este ensayo consiste en inyectar las células en la vena de la cola. Se necesita práctica para dominar las habilidades de inyección. Incluso en el caso de un investigador experimentado, varios ensayos antes de alcanzar una inyección de éxito son muy comunes. Las venas en las colas de ratón son agujas muy delgadas e inserta en medio de ellos no es fácil. El calentamiento de la cola brevemente con una lámpara y masajear suavemente la cola antes de las inyecciones puede inducir la dilatación de los vasos sanguíneos y facilitar las inyecciones. Un error muy común para la mayoría de los investigadores consiste en suponer que las venas profundas están en la cola y por lo tanto, se inyectan células muy profundamente en la piel. Las venas son en realidad muy cerca de la superficie de la piel, por lo tanto, uno debe tratar de inyectar superficialmente como sea posible.
Si la aguja se inserta con éxito dentro de la vena, la inyección debe ir sin problemas con ninguna resistencia. Si la aguja no se inserta en la vena, pero en los tejidos adyacentes, muestras inyectadas se acumula la presión del líquido de forma rápida y luego impedir la entrega del resto de las muestras. Cada uno de estos ensayos no lo va a perder algunas muestras. Para minimizar esta pérdida, un investigador experimentado trata de predecir si la aguja está en la vena o no mediante la inyección de una cantidad mínima de muestra y la evaluación de la resistencia de la presión del fluido. Si se siente la resistencia, la aguja no debe estar en la vena y luego se retire la aguja y vuelva a intentarlo. Si no se sienta resistencia, la aguja debe estar en la vena y todos los de la muestra será inyectada a la vez. En este último caso, a menudo se puede ver la muestra "dispara" a la vena, el desplazamiento de la sangre como lo hace su camino hacia el cuerpo.
Al dar por terminado el ensayo debe ser determinada empíricamente para cada línea celular, ya que varía considerablemente en función del potencial metastásico de las células. Los ratones se diseca en diferentes momentos después de las inyecciones y la extensión de la metástasis pulmonar se determina. Una cantidad de tiempo que resulta en un número contable de las metástasis pulmonares detectables microscópicamente suele ser elegido, ya que da un resultado cuantitativo y también deja espacio para el aumento o disminución de las metástasis causadas por la perturbación de genes candidatos. Para los investigadores que llevan a cabo este ensayo por primera vez, utilizando una línea celular altamente metastásica (por ejemplo, la línea de células de melanoma humano, A375, o sus derivados, altamente metastásico) como control positivo es altamente recomendable. Además, las edades y géneros de ratones afectar significativamente los resultados, por lo que se aconseja mantener la edad y el género consistente en la capacidad metastásica de las diferentes líneas celulares se comparan. Debido a las variaciones introducidas por los factores antes mencionados, por lo menos cinco ratones debe ser inyectada para cada línea celular para llegar a una conclusión estadísticamente significativa.
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Acknowledgments
Este protocolo fue inicialmente probado y optimizado en el laboratorio del Dr. Richard Hynes (MIT). El financiamiento es provisto por el premio IDEA NYSTEM (a LX) y Ruth L. Kirschstein Premio Nacional de Servicio de Investigación (para LX).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
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- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
