Summary
Den här artikeln beskriver förfaranden för en experimentell metastaser analysmetod som används för att bestämma metastaserande potential humana cancercell.
Abstract
Metastaser är den vanligaste dödsorsaken hos cancerpatienter. För att förstå mekanismen av metastaser, var en experimentell metastaser analys fastställts med nedsatt immunförsvar möss. Denna artikel skisserar de förfaranden som ingår i denna analys, inklusive provberedning, intravenös injektion och celler odling av lungmetastaser. Kortfattat var ett förutbestämt antal mänskliga cancerceller förberedda
Protocol
1. Provberedning
- Grow celler till ~ 70% konfluenta i deras specifika media med tillväxtfaktorer eller FBS (t.ex. DMEM med 10% FBS för MC-1 celler). Aspirera media från plattan och försiktigt tvätta flera gånger med 1 x PBS (8 g / L NaCl, 0,2 g / L KCl, 1,15 g / L Na 2 HPO 4 0,7 H 2 O, 0,2 g / L KH 2 PO 4, pH 7,3).
- Aspirera PBS och tillsätt 2 mL 0,05% Trypsin i versene (0,014 g / L av fenol rött och 0,2 g / L EDTA-Na i 1 x PBS, pH 7,2). Skaka plattan för att underlätta celler lossnar från plattan. Observera att cellerna i mikroskop. Det tar oftast 2-5 minuter för att cellerna ska bort.
- Lägg till en riklig mängd av media som innehåller FBS (eller soja trypsininhibitorerna) för att släcka trypsin verksamheten och samla in celler i ett 50mL falk rör. Räkna celler med en hemacytometer. Ladda 10μL cellsuspension på en ren hemacytometer. Antalet celler per ml är lika med den genomsnittliga # av celler i de fem rutor multipliceras med 10 4.
- Centrifugera cellerna vid 1000 rpm (eller ~ 200 xg) i en bänk centrifug i 3 minuter.
- Ta försiktigt bort media utan att störa cellpelleten. Resuspendera cellerna i en lämplig volym av Hanks Balanced buffertlösning (HBSS) för att nå en slutlig koncentration av ca 5 x 10 6 celler / ml.
- Filtrera celler genom en Falcon 70 ìm cell sil att utesluta stora cellaggregat. Placera pipetten direkt på filtret över en märkt 5 ml Falcon kultur röret. Snabbt mata suspensionen genom filtret in i kulturen röret.
- Räkna celler igen med en hemacytometer och späda ut dem till en slutlig koncentration av 2,5 x 10 6 / ml. Håll celler på is.
- Bestäm livskraften i cellerna. Blanda en del celler med trypan blått och mäter andelen döda (blå) celler över den totala cellerna med hjälp av en hemacytometer. Lönsamheten i celler bör vara ≥ 90% före injektion.
2. Intravenös injektion
- Byt handskar. Försiktigt ta tag i svansen av ett nedsatt immunförsvar mus (naken, NOD-SCID, eller NSG, Jacksons Laboratory) och dra den i musen restrainer, med ryggen mot skåran och stjärten sticker ut från den lilla öppningen i baksidan av restrainer .
- Sakta glida ringen inåt längs skåran och lås den på plats när ringen fångar munnen av musen. Musen bör inte kunna röra sig fritt, men bör ha normal andning.
- Hitta den stora svansen ådror. Fyra stora blodkärl finns i en mus svans. Blodkärl på rygg-och ventrala sidan av svansen är artärerna. Vener är på laterala sidorna av svansen.
- Rita mer än 200 mikroliter av det preparerade cellerna i en 1 mL spruta. Anslut 30 G1 / 2 tums nål och pressa ut alla luftbubblor som kan finnas. Den slutliga volymen av celler i sprutan ska 200 mikroliter (dvs 5 x 10 5 celler totalt).
- Injicera celler i svansen ven.
- Börja från distala änden av svansen, så om det första försöket misslyckas, en mer proximal region i svansen användas för en andra försök.
- Torka av svansen med 70% etanol. Dra svansen rakt. Håll spetsen av svansen med tummen och stödja punkt för injektion med pekfingret.
- För in nålen i venen och injicera celler. Se till att nålen och sprutan är parallella med venen under injektion, annars nålen kommer att peta igenom kärlväggen och injicera celler i den intilliggande svansen vävnader.
- Dra ut nålen efter injektionen. Blod bör riklig från injektionsstället om injektionen gick framgångsrikt. Tryck på en ren bit hushållspapper eller bomullstuss på injektionsstället för att underlätta koagulering och palpera svansen uppåt för att pressa någon resterande prov i venen i omlopp.
- Släpp musen från restrainer och returnera den till buren. Spela injektionen processen (t.ex., hur många försök det tog att injicera cellerna och hur mycket celler injiceras) i ett labb anteckningsbok.
- Bestäm lönsamheten av celler efter injektion, som beskrivs i avsnitt för provberedning, steg 9. Detta steg ger trygghet att celler hålla sig vid liv under hela injektionen processen. Vid slutet av en injektion experiment, kommer lönsamheten av celler minskar, men bör ligga över 80%.
- (Tillval) Snurra ner överblivna celler och skölj pellets med PBS gång. Frysa pellets vid -80 ° C för framtida analyser (t.ex. Western blotting för att bekräfta genuttryck eller knockdowns).
- Normalt efter en eller två månader kommer mössen skall dissekeras och placeringen av metastaser är grovt bestämmas. Lung är den främsta platsen för metastaser, eftersom den innehåller den första kapillärbädd att cellerna möter när dein i cirkulationen.
- Efter sköljning med PBS, varje lob av lungan (eller andra vävnader som innehåller metastaser) betraktas under en dissekera mikroskop (Figur 1). Antalet detekterbara metastaser på båda sidor av lungan räknas och antalet lungmetastaser på alla fyra loberna summeras som det totala antalet av lungmetastaser. 1 lungmetastaser lättare upptäckas om lungorna är fasta i formalin natten eftersom metastaserna apppear som vitaktiga fläckar i motsats till den intilliggande mörkbruna lungvävnad.
3. Odling Celler från lungmetastaser
- Lungmetastaser är isolerade från injiceras möss. Varje bör odlas separat.
- Varje metastaser är malet i slutet av en nålskyddet (steril) på en 70 ìm cell sil.
- Skölj cellen silen med flera ml av mediet och samlas celler som passerar genom filtret i en kultur maträtt.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i minst fyra dagar utan störningar.
- Tvätta bort blod eller vävnad skräp på skålen med PBS.
- Lägg till nytt medium. I början, både cancerceller och celler fibroblast växer på plattorna, men så småningom kommer fibroblast cellerna dör ut och ersättas av cancerceller. Om cancerceller bära gener läkemedelsresistenta, markerar de celler med motsvarande antibiotika.
- Renheten av den härledda celler bedöms av immunfärgning använda antikroppar mot humant-specifika proteiner. Vi använder ett anti-humant vimentin antikropp (NCL-VIM-V9, Novocastra). Cellerna vi härstammar innehåller normalt mer än 99% av mänskliga celler, även i frånvaro av drog urval. Den nyligen härledda celler kan injiceras igen till immundefekta möss för att testa sina metastaserande förmågor, som beskrivits ovan.
4. Representativa resultat
- I slutet av denna analys, ger en mycket metastaserande cancer cellinje normalt upphov till många lungmetastaser (Figur 1), 1 medan mycket få lungmetastaser kommer från ett dåligt metastaserande cancer cellinje.
- Den härledda celler med den här metoden brukar ge upphov till mer metastaser än föräldrarnas linje, när de testas igen med denna analys. 1-3
Figur 1. Representant bilder av musen lungorna efter injektioner svansvenen av cancerceller. 5 x 10 5 av metastaserande mänskliga melanom cellinje, SM celler, 4 var injiceras i svansvenen av nedsatt immunförsvar möss. Två månader senare var lungorna isolerade och metastaser hittades utspridda bland vanliga lungvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metastaser är den vanligaste dödsorsaken hos cancerpatienter. Det handlar om fyra viktiga steg: avskiljandet av cancerceller från deras primära loci, sättas i omlopp (intravasation), deras utträde ur cirkulation (extravasation), och överlevnad och tillväxt i en avlägsen orgel. Metastaser i mänskliga anses vara en långsam process och ofta manifesteras efter år av latens. Att studera dess progression i tid, var det ovanstående relativt snabbt experimentell analys etablerat i immundefekta möss. 4 Sedan etableringen har den använts på ett effektivt sätt att isolera celler med olika metastaserande förmågor, identifiera gener som är upp-eller ned-reglerade under metastaser 1,2,5 och testa kausala roller dessa gener under metastaser. 3
Det mest utmanande steget i denna analys är att injicera cellerna i svansvenen. Det tar praxis att behärska injicera färdigheter. Även för en erfaren forskare, flera försök innan uppnå ett framgångsrikt injektion är mycket vanliga. Vener i mus svans är extremt tunna och sätta nålar mitt av dem är inte lätt. Värmer upp svansen kort med hjälp av en lampa och försiktigt massera svans före injektionerna kan ge upphov till utvidgning av blodkärlen och underlättar injektioner. Ett vanligt misstag för de flesta forskare är att anta att venerna ligger djupt inne i svansen och därför injicera celler för djupt in i huden. Vener är faktiskt mycket nära ytan av huden, därför bör man försöka att injicera så ytligt som möjligt.
Om nålen framgångsrikt monterad i venen, ska injektionen gå smidigt utan motstånd. Om nålen inte sitter i venen men i angränsande vävnader, kommer att injiceras prover bygga upp vätsketryck snabbt och sedan förhindra överlämnande av resten av proverna. Var och en av dessa misslyckade försök kommer därmed att förlora en del prover. För att minimera denna förlust, försöker en erfaren forskare att förutsäga om nålen i venen eller inte genom att injicera en minimal mängd av prov och bedömning av motståndet från vätsketryck. Om han känner motståndet måste nålen inte vara i venen och han kommer att dra sedan ut nålen och försök igen. Om inget motstånd känns, måste nålen i venen och alla av provet kommer att injiceras på en gång. I det senare fallet kan man ofta se provet "skjuter" upp venen, tränger blod som den gör sin väg mot kroppen.
När du ska avsluta analysen bör bestämmas empiriskt för varje cell linje, eftersom det varierar betydligt beroende på metastaserande potential av cellerna. Möss kommer att dissekeras vid olika tidpunkter efter injektioner och omfattningen av lungmetastaser bestäms. En tid som resulterar i en uppräknelig antal mikroskopiskt påvisbara lungmetastaser oftast väljs, eftersom det ger ett kvantitativt resultat och även ger utrymme för någon ökning eller minskning av metastaser orsakas av störning av kandidatgener. För forskare som utför denna analys för första gången, med hjälp av en mycket metastaserande cellinje (såsom mänskliga melanom cellinje, A375, eller dess mycket metastaserande derivat) som positiv kontroll rekommenderas starkt. Dessutom åldrar och kön av möss påverka resultaten betydligt, så det rekommenderas att hålla tiderna och kön konsekvent när metastaserande förmågor av olika cellinjer jämförs. På grund av de ändringar som införts av de faktorer som nämns ovan, bör minst fem möss injiceras för varje cellinje för att nå någon statistiskt signifikant slutsats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta protokoll har testats och optimerats först i laboratoriet av Dr Richard Hynes (MIT). Finansieringen tillhandahålls av NYSTEM IDEA Award (till LX) och Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (till LX).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
