Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verfahren der experimentellen Metastasierung Assay, mit denen die metastatische Potential von humanen Krebszelllinien zu bestimmen.
Abstract
Metastasierung ist die häufigste Todesursache bei Krebspatienten. Um zu verstehen, den Mechanismus der Metastasierung, war eine experimentelle Metastasierung Assay etabliert mit immundefizienten Mäusen. Dieser Artikel umreißt die Verfahren in diesem Test beteiligt, inklusive Probenvorbereitung, intravenöse Injektion, und Kultivieren von Zellen aus der Lunge Metastasen. Kurz gesagt, wurden einer vorher festgelegten Anzahl von menschlichen Krebszellen vorbereitet
Protocol
1. Probenvorbereitung
- Wachsen Zellen auf ~ 70% konfluent in ihren spezifischen Medien mit Wachstumsfaktoren oder FBS (zB DMEM mit 10% FBS für MC-1-Zellen). Saugen Sie Medien aus Platte und vorsichtig waschen mehrmals mit 1 x PBS (8 g / l NaCl, 0,2 g / l KCl, 1,15 g / L Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 0,2 g / l KH 2 PO 4, pH 7,3).
- Absaugen PBS und 2 mL von 0,05% Trypsin in Versen (0,014 g / L von Phenolrot und 0,2 g / L EDTA-Na in 1 x PBS, pH 7,2). Schütteln Platte Zellablösung von Platte zu erleichtern. Beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Es dauert in der Regel 2-5 Minuten für die Zellen zu lösen.
- Fügen Sie ein großes Volumen von Medien mit FBS (oder Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor) auf die Trypsin-Aktivität zu löschen und sammeln Zellen in einem 50 mL Falcon-Röhrchen. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Legen Sie 10 &mgr; l der Zellsuspension auf einen sauberen Hämazytometer. Die Anzahl der Zellen pro ml ist gleich der durchschnittlichen Anzahl der Zellen in jeder der fünf Plätze von 10 4 multipliziert.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 RPM (oder ~ 200 xg) in einer Tischzentrifuge für 3 Minuten.
- Entfernen Sie vorsichtig den Medien, ohne die Zellpellet. Die Zellen in einem geeigneten Volumen Hanks Balanced Buffer Solution (HBSS) auf eine Endkonzentration von ca. 5 x 10 6 Zellen / ml erreichen.
- Filter-Zellen durch eine Falcon 70 um Zellsieb auszuschließen großen Zellverbänden. Setzen Sie die Spitze der Pipette direkt auf die Filter über einen markierten 5mL Falcon Kultur Röhre. Schnell werfen die Suspension durch den Filter in die Kultur Röhre.
- Zählen von Zellen erneut mit einer Hämazytometer und verdünnen, um eine Endkonzentration von 2,5 x 10 6 / ml. Keep Zellen auf Eis.
- Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen. Mix einige Zellen mit Trypanblau und messen Sie den Prozentsatz der toten (blau)-Zellen über den gesamten Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Die Lebensfähigkeit der Zellen sollte ≥ 90% vor der Injektion werden.
2. Intravenöse Injektion
- Wechseln Sie die Handschuhe. Vorsichtig packen den Schwanz eines immundefizienten Maus (nude, NOD-SCID oder NSG, Jackson Laboratory) und ziehen Sie ihn in die Maus restrainer, mit dem Rücken gegen den Schlitz und den Schwanz ragte aus der kleinen Öffnung in der Rückseite des restrainer .
- Langsam schieben Sie den Ring nach innen entlang der Schlitz und verriegeln Sie ihn an Stelle einmal den Ring fängt den Mund der Maus. Die Maus sollte nicht in der Lage sein, sich frei zu bewegen, sollte aber normale Atemfrequenz haben.
- Hier finden Sie die wichtigsten Schwanzvenen. Vier große Blutgefäße vorhanden sind in einem Maus-Schwanz. Blutgefäße auf der dorsalen und ventralen Seiten der Schwanz sind Arterien. Venen sind an den Seiten des Schwanzes.
- Zeichnen Sie mehr als 200 ul der vorbereiteten Zellen in eine 1 ml Spritze. Bringen Sie die 30 G1 / 2 Zoll-Nadel-und Push-out Luftblasen, die eventuell existieren. Das endgültige Volumen der Zellen in der Spritze sollte 200 ul (dh 5 x 10 5 Zellen in insgesamt) werden.
- Inject Zellen in die Schwanzvene.
- Starten Sie vom distalen Ende des Schwanzes, so wenn der erste Versuch fehlschlägt, eine proximalen Bereich des Schwanzes könnte für einen zweiten Versuch verwendet werden.
- Wischen Sie den Schwanz mit 70% Ethanol. Ziehen Sie den Schwanz gerade. Halten Sie die Spitze der Schwanz mit Daumen und unterstützen den Punkt für die Injektion mit dem Zeigefinger.
- Führen Sie die Nadel, um die Vene zu injizieren und Zellen. Achten Sie darauf, die Nadel und Spritze sind parallel zu den Venen während der Injektion, da sonst die Nadel wird durch die Gefäßwand stoßen und injizieren die Zellen in den angrenzenden Geweben Schwanz.
- Ziehen Sie die Nadel nach der Injektion. Blut sollte reichlich aus der Injektionsstelle, wenn die Injektion ging erfolgreich. Drücken Sie ein sauberes Stück Küchenpapier oder einem Wattestäbchen auf die Injektionsstelle zu erleichtern Blutgerinnung, und tasten den Schwanz nach oben, um restliche Probe in die Vene in Umlauf zu schieben.
- Lassen Sie die Maustaste aus dem restrainer und senden es an den Käfig. Notieren Sie sich die Einspritzung (zB wie viele Versuche es brauchte, um die Zellen zu injizieren und wie viel Zellen injiziert wurden) in einem Labor-Notebook.
- Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Injektion, wie im Abschnitt der Probenvorbereitung beschrieben, Schritt 9. Dieser Schritt bietet die Gewissheit, dass Zellen am Leben zu bleiben während der Injektion Prozess. Am Ende der Injektion Experiment wird die Lebensfähigkeit der Zellen zurückgehen, aber sollte über 80% betragen.
- (Optional) Spin down die übrig gebliebenen Zellen und spülen Sie die Pellets mit PBS einmal. Einfrieren des Pellets bei -80 oC für zukünftige Analysen (zB Western Blots, die Genexpression oder Niederschlägen zu bestätigen).
- In der Regel nach ein oder zwei Monaten werden die Mäuse seziert und die Standorte von Metastasen sind grob bestimmt. Lung ist der primäre Ort für die Metastasierung, da es das erste Kapillarbett, dass die Zellen nach denen sie begegnen enthältin den Kreislauf eintreten.
- Nach dem Spülen mit PBS, jeder Lappen der Lunge (oder anderen Geweben mit Metastasen) wird unter einem Binokular (Abbildung 1) beobachtet. Die Zahl der nachweisbaren Metastasen auf beiden Seiten der Lunge wird gezählt und die Anzahl von Lungenmetastasen auf allen vier Lappen sind addiert als die Gesamtzahl von Lungenmetastasen. 1 Lungenmetastasen sind leichter erkannt werden, wenn die Lunge in Formalin fixiert werden über Nacht , da sich die Metastasen werden als weißliche Flecken im Gegensatz zu den benachbarten dunkelbraun Lungengewebe apppear.
3. Kultivierung von Zellen aus Lungenmetastasen
- Lungenmetastasen sind aus injizierten Mäusen isoliert. Jeder sollte getrennt kultiviert werden.
- Jeder Metastasierung wird durch das Ende einer Nadelkappe (steril) auf einem 70 um Zellsieb zerkleinert.
- Spülen Sie die Zelle Sieb mit mehreren ml Medium gesammelt und Zellen, die den Filter passieren in der Kulturschale.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für mindestens 4 Tage ohne Störung.
- Wegspülen Blut oder Gewebereste auf die Schale mit PBS.
- Fügen Sie frisches Medium. Am Anfang, sowohl Krebszellen und Fibroblasten auf den Platten wachsen, aber nach und nach, die Fibroblasten werden aussterben und durch Krebszellen ersetzt werden. Wenn die Krebszellen keine resistenten Gene in sich tragen, markieren Sie die Zellen mit den entsprechenden Antibiotika.
- Die Reinheit des gewonnenen Zellen wird durch Immunfärbung mit Antikörpern gegen human-spezifische Proteine untersucht. Wir benutzen ein Anti-Human-Vimentin-Antikörper (NCL-VIM-V9, Novocastra). Die Zellen haben wir gewonnen werden, enthalten in der Regel über 99% der menschlichen Zellen, auch in Abwesenheit des Medikaments Auswahl. Die neu gewonnenen Zellen könnten wieder in immundefizienten Mäusen injiziert werden, um ihre Fähigkeiten zu testen metastasiertem, wie oben beschrieben.
4. Repräsentative Ergebnisse
- Am Ende dieses Tests, ein hoch metastasiertem Krebs-Zelllinie in der Regel wirft viele Lungenmetastasen (Abbildung 1), 1, während nur sehr wenige Lungenmetastasen aus einem schlecht metastasiertem Krebs-Zelllinie kommen wird.
- Die Zellen stammen mit dieser Methode in der Regel ergeben sich weitere Metastasen als die Stammlinie, wenn sie getestet werden wieder in diesem Test. 1-3
Abbildung 1. Repräsentative Bilder Mauslungen nach Schwanzvene Injektionen von Krebszellen. 5 x 10 5 des metastasierenden Melanoms menschlichen Zelllinie, SM-Zellen, 4 wurden in die Schwanzvene von immundefizienten Mäusen injiziert. Zwei Monate später wurden die Lungen isoliert und Metastasen gefunden wurden zerstreut unter den normalen Lungengewebe.
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Discussion
Metastasierung ist die häufigste Todesursache bei Krebspatienten. Es umfasst vier wesentliche Schritte: Ablösung von Krebszellen aus ihrem primären loci, die Einfahrt in den Verkehr (intravasation), deren Ausfahrt aus dem Verkehr (Extravasation), und das Überleben und Wachstum in einem entfernten Organ. Metastase in der menschlichen gilt als ein langsamer Prozess und oft nach Jahren der Latenz manifestiert. Zur Untersuchung ihrer Progression rechtzeitig wurde die oben relativ schnell Versuchsansatz in immundefizienten Mäusen etabliert. 4 Seit ihrer Gründung ist es tatsächlich auf Zellen mit verschiedenen metastatischen Fähigkeiten isolieren verwendet, identifizieren Gene, die hoch-oder herunter reguliert werden während der Metastasen 1,2,5, und testen Sie die kausale Rolle dieser Gene bei der Metastasierung. 3
Die größte Herausforderung für Schritt in diesem Test ist es, Zellen in die Schwanzvene injiziert. Es dauert Verfahren, um die Injektion von Fähigkeiten zu meistern. Selbst für einen erfahrenen Forscher sind mehrere Versuche, bevor eine erfolgreiche Injektion sehr verbreitet. Venen in Mäuseschwänzen sind extrem dünn und legen Nadeln direkt in der Mitte von ihnen ist nicht einfach. Warming up der Schwanz kurz mit einer Lampe und sanft massiert den Schwanz vor Injektionen veranlassen könnte Dilatation der Blutgefäße und erleichtert Injektionen. Ein häufiger Fehler für die meisten Forscher ist davon auszugehen, dass die Venen tief in den Schwanz sind und deshalb injizieren Zellen zu tief in die Haut. Venen sind eigentlich sehr nahe an der Oberfläche der Haut, deshalb sollte man versuchen, so flach wie möglich zu spritzen.
Wenn die Nadel erfolgreich in die Vene eingeführt, sollte die Injektion reibungslos ohne Widerstand. Wenn die Nadel nicht in die Vene eingeführt, sondern in den benachbarten Geweben, Proben injiziert wird aufgebaut Flüssigkeitsdruck schnell und dann verhindern, dass die Lieferung der restlichen Proben. Jede dieser gescheiterten Versuche verlieren dadurch einige Proben. Zur Minimierung dieser Verlust ist, versucht ein erfahrener Forscher vorhersagen, ob die Nadel in die Vene oder nicht durch die Injektion einer minimalen Menge der Probe und der Beurteilung der Widerstand der Flüssigkeitsdruck ist. Wenn er den Widerstand spürt, darf die Nadel nicht in die Vene, und er wird dann ziehen Sie die Nadel heraus und versuchen Sie es erneut. Wenn kein Widerstand zu spüren ist, darf die Nadel in die Vene und die gesamte Probe wird auf einmal injiziert werden. Im letzteren Fall kann man oft sehen, die Probe "schießt" die Vene, verdrängt das Blut auf seinem Weg in Richtung des Körpers macht.
Wenn zu beenden den Test empirisch sollte für jede Zelllinie bestimmt werden, da es wesentlich abhängig von der metastatischen Potential der Zellen variiert. Mäuse werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion präpariert werden und das Ausmaß von Lungenmetastasen bestimmt. Eine lange Zeit, dass die Ergebnisse in eine abzählbare Anzahl von mikroskopisch erkennbaren Lungenmetastasen in der Regel so gewählt, da es ein quantitatives Ergebnis liefert, und auch Raum für eine Erhöhung oder Verminderung von Metastasen durch Störung der Kandidatengene verursacht. Für Forscher, die diesen Test zum ersten Mal durchführen, mit einem hoch metastatischen Zelllinie (wie die menschliche Melanom-Zelllinie A375 oder seine hoch metastatischen Derivate) als positive Kontrolle wird dringend empfohlen. Darüber hinaus, Altersgruppen und Geschlechter von Mäusen die Ergebnisse beeinflussen wesentlich, so dass es geraten ist, im Alter und Geschlecht konsistent zu halten, wenn die Metastasen Fähigkeiten der verschiedenen Zelllinien verglichen werden. Aufgrund der Variationen, die durch den oben genannten Faktoren eingeführt, sollte mindestens fünf Mäuse für jede Zelllinie injiziert werden, um keine statistisch signifikanten Ergebnis zu gelangen.
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Acknowledgments
Dieses Protokoll wurde getestet und zunächst im Labor von Dr. Richard Hynes (MIT) optimiert. Die Finanzierung erfolgt durch die NYSTEM IDEA Award (für LX) und Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (für LX) zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
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- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
