Summary
이 문서는 인간의 암 세포 라인의 전이성 잠재력을 결정하는 데 사용되는 실험적인 전이 분석의 절차를 설명합니다.
Abstract
전이는 암 환자에서 사망의 주요 원인입니다. 전이의 메커니즘을 이해하기 위해서, 실험적인 전이 분석은 immunodeficient 마우스를 사용하여 설립되었습니다. 이 문서는 샘플 준비, 정맥 주사, 그리고 폐 metastases에서 culturing 세포를 포함하여이 분석에 관련된 절차를 delineates. 간단히, 인간의 암 세포의 미리 정해진 숫자는 준비가되어있다
Protocol
1. 샘플 준비
- 성장 요인 또는 FBS 그들의 특정 미디어에 ~ 70 % 합류 (예 : MC - 1 세포를 10 % FBS와 DMEM)에 세포를 성장. 접시에서 미디어를 대기음 부드럽게 1 X PBS (나 2 HPO 4 NaCl 8 G / L, KCl의 0.2 g / L, 1.15 g / L 0.7 H 2 O, KH 2 PO의 0.2 g / L로 여러 번 씻어 4, 산도 7.3).
- 대기음 PBS가와 versene에서 0.05 %의 트립신 (0.014 g / 페놀 빨간색과 1 X PBS, pH를 7.2에서 0.2의 G / L EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 나의 L) 2 ML를 추가합니다. 부드럽게 접시에서 세포 분리를 촉진하기 위해 플레이트를 바위. 현미경 세포를 관찰합니다. 그것은 일반적으로 분리하는 세포에 대한 2-5분 걸립니다.
- 트립신 활동을 담금질하고 50mL 팔콘 튜브에 세포를 수집하는 FBS (또는 대두 트립신 억제제)가 포함된 미디어의 충분한 볼륨을 추가합니다. hemacytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 깨끗한 hemacytometer에 세포 현탁액의 10μL를로드합니다. ML 당 세포의 숫자는 10 4 곱한 다섯 제곱의 각 # 세포의 평균 같습니다.
- 1000 세포를 원심 RPM (또는 ~ 200 XG) 3 분 benchtop 원심 분리기 인치
- 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 미디어를 제거합니다. ~ 5 × 10 6 세포 / ML의 최종 농도에 도달하는 행크스 밸런스드 버퍼 솔루션 (HBSS)의 적절한 볼륨으로 세포를 Resuspend.
- 팰컨 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 세포는 큰 세포 집계를 제외합니다. 표시 5mL 팰컨 문화 관을 통해 직접 필터에 피펫의 끝에 놓습니다. 신속 문화 튜브에 필터를 통해 중지를 꺼냅니다.
- hemacytometer를 사용하여 다시 셀을 카운트 및 2.5 × 10 6 / ML의 최종 농도로 희석. 얼음 세포 보관하십시오.
- 세포의 생존을 결정합니다. trypan 파랑 몇 가지 세포를 혼합하고 hemacytometer를 사용하여 총 전지를 통해 죽은 (파란색) 세포의 백분율을 측정합니다. 세포의 생존 능력은 주사하기 전에 ≥ 90%되어야합니다.
2. 정맥 주사
- 장갑을 변경합니다. 부드럽게 immunodeficient 마우스 (누드, NOD - SCID, 또는 NSG, 잭슨 연구소)의 꼬리를 잡고 restrainer 뒤쪽에있는 작은 오프닝 바깥으로 튀어나와있는 슬릿과 꼬리 상대로 다시와 마우스 restrainer으로 당겨 .
- 반지는 마우스의 입을 잡는다 한번 천천히 슬릿을 따라 안쪽 링 슬라이드 및 장소에 잠금. 마우스가 자유롭게 이동 할 수있는 거 아니지만, 호흡의 정상적인 비율이 있어야합니다.
- 주요 꼬리 정맥을 찾아보십시오. 네 개의 주요 혈관은 마우스 꼬리에 존재한다. 꼬리 지느러미 및 복부 양쪽에 혈관이 동맥 있습니다. 정맥 꼬리의 측면 측면에 있습니다.
- 1mL 주사기에 준비 세포의 200 명 이상 μL을 그립니다. 30 G1 / 2 인치 바늘을 부착하고있을 수있는 공기 방울을 밀어. 주사기의 세포의 최종 부피는 200 μL (즉, 5 총 X 10 5 세포)해야합니다.
- 꼬리 정맥에 세포를 주입.
- 첫 번째 재판이 실패한다면, 꼬리보다 근위 영역이 두 번째 시도에 사용될 수 꼬리의 말초 월말부터 시작합니다.
- 70 % 에탄올로 꼬리를 닦아주십시오. 바로 꼬리를 당겨. 엄지와 꼬리의 끝을 잡고 검지로 주입을위한 지점을 지원합니다.
- 정맥에 바늘을 넣고 세포를 주입. 바늘과 주사기가 주사시 정맥에 병렬로되어 있는지 확인하십시오, 그렇지 않으면 바늘이 혈관 벽을 통해 찌를와 인접한 꼬리 조직에 세포를 주입합니다.
- 주사 후 바늘을 철회. 피가 분사가 성공적으로 간 경우 주사 사이트에서 넘치도록해야합니다. 응고 촉진 사출 사이트에 종이 타월이나 면봉의 깨끗한 부분을 누르면, 유통 정맥에 잔류 시료를 밀어 꼬리 위쪽을 촉진하다.
- restrainer에서 마우스를 해제하고 감옥에 돌아갑니다. 연구실 노트 (예를 들어, 얼마나 많은 시련이 세포를 주입하는 데리고 얼마나 세포 주입되었다) 사출 과정을 기록합니다.
- 로 샘플 준비 섹션에서 설명한 주입 후 세포의 생존을 결정, 9 단계. 이 단계는 세포가 사출 과정에서 살아남는 것을 안심을 제공합니다. 주사 실험의 끝에, 세포의 생존 능력은 감소되지만 80% 이상이어야합니다.
- (옵션) 남은 세포를 스핀 다운하여 한 번 PBS로 알약을 씻어. 미래의 분석 (예를 들어, 유전자 발현이나 knockdowns 확인을 위해 서부 blots)를 -80 OC에서 알약을 고정.
- 일반적으로 1 ~ 2 개월 후, 생쥐 해부되며 metastases의 위치는 조잡한 결정됩니다. 그것은 세포가 그들이 이후에 발생되는 최초의 모세관 침대 포함되어 있으므로 폐암이 전이의 기본 사이트입니다순환을 입력합니다.
- PBS, 폐 (또는 metastases을 포함한 다른 조직)의 각 엽과 rinsing 후 해부 현미경 (그림 1)에서 관찰됩니다. 폐 metastases의 총 개수로 폐 양쪽에 감지 metastases의 수를 계산하고 모든 네 개의 엽 (叶)에 폐 metastases의 숫자가 함께 추가됩니다. 폐가가 포르말린 하룻밤에 수정하는 경우 한 폐에 metastases 더 쉽게 감지 , metastases는 인접한 어두운 갈색 폐 조직에 대조적으로 약간 흰 반점으로 apppear 때문에.
3. 룽 Metastases에서 Culturing 셀
- 룽 metastases는 주입 생쥐에서 격리됩니다. 각각은 별도 양식되어야합니다.
- 각 전이는 70 μm의 셀 스트레이너에 주사 바늘 뚜껑 (멸균)의 말까지 다진 것입니다.
- 매체 및 문화 접시에있는 필터를 통과 수집된 세포의 여러 MLS와 셀 스트레이너 린스.
- 방해하지 않고 적어도 나흘 동안 37 ° C에서 세포를 품어.
- PBS와 함께 접시에 혈액이나 조직 파편을 멀리 씻으십시오.
- 신선한 매체를 추가하십시오. 처음에는, 암 세포 fibroblast 세포 모두 접시에 성장하지만, 점차, fibroblast 세포 밖으로 죽을 암 세포로 대체됩니다. 암 세포가 어떠한 약물 모성 유전자를 가지고있다면, 해당 항생제로 셀을 선택합니다.
- 파생 세포의 순도는 인간 특정 단백질에 대한 항체를 사용 immunostaining에 의해 평가됩니다. 우리는 안티 인간 vimentin 항체 (NCL - VIM - V9, Novocastra)를 사용합니다. 우리가 파생된 세포도 약물 선택의 부재에서 인간 세포의 99 % 이상 일반적으로 포함되어 있습니다. 새로 파생된 세포는 위에서 설명한 바와 같이, 그들의 전이성 능력을 테스트하기 위해 immunodeficient 생쥐에 다시 주입 수 있습니다.
4. 대표 결과
- 거의 폐 metastases가 저조한 전이성 암 세포 라인에서 올 때이 분석의 끝에, 높은 전이성 암 세포 라인은 일반적으로 많은 폐 metastases (그림 1), 1 상승을 제공합니다.
- 이 방법을 사용하여 파생된 세포는 일반적으로 그들이 다시 분석을 사용하여 테스트하는 부모의 라인보다 metastases을 일으키다. 1-3
암 세포의 꼬리 정맥 주사 후 마우스 폐 그림 1. 대표 이미지. 전이성 인간 흑색증 셀 라인, SM 세포 4 5 X 10 5 immunodeficient 생쥐의 꼬리 정맥에 주입했다. 두 달 후 폐는 고립되었고 metastases은 정상적인 폐 조직 간의 분산 발견되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
전이는 암 환자에서 사망의 주요 원인입니다. 그들의 주요 loci, 유통에 자신의 항목 (intravasation), 순환 (넘쳐 흐름)에서 자신의 종료, 그리고 먼 장기에 생존과 성장에서 암 세포의 분리 : 그것은 네 개의 주요 단계를 포함한다. 인간의 전이는 느린 과정으로 간주하고 종종 지연 년 이후 각성입니다. 적시에 자사의 진행을 연구하기 위해 위의 비교적 신속하게 실험적인 분석은 immunodeficient 생쥐에서 설립되었습니다. 4 설립 이래, 그것이 다른 전이성 능력을 가진 세포를 분리하기 위해 효과적으로 사용되고 있습니다, 최대 - 아래 - 규제하는 동안 아르 유전자를 식별 전이 1,2,5, 그리고 전이 동안 이러한 유전자의 인과 관계 역할을 테스트 3.
이 분석에서 가장 어려운 단계는 꼬리 정맥에 세포를 주입하는 것입니다. 그것은 주입 기술을 마스터하는 방법을 걸립니다. 비록 경험이 연구자를위한, 성공적인 주사를 달성하기 전에 몇 가지 실험은 매우 일반적인 수 있습니다. 마우스 꼬리에 정맥 바로 그들의 중간에 아주 얇고 삽입 바늘 아르 쉬운 일이 아닙니다. 램프를 사용하여 간단히 꼬리를 데워 부드럽게 주사하기 전에 꼬리를 마사지하면 혈관의 팽창을 유도하고 주사를 용이하게 수 있습니다. 대부분의 연구자에 대한 일반적인 실수는 혈관이 꼬리에 깊은되고 따라서 피부에 너무 깊이 세포를 주입 있다고 가정하는 것입니다. 혈관 실제로 피부의 표면에 매우 가까이 있으며, 따라서 하나는 가능 한한 shallowly 주입하려고한다.
바늘이 성공적으로 정맥 안으로 삽입하는 경우 주사는 아무런 저항도 함께 원활하게 이동해야합니다. 바늘은 정맥에 삽입 아니라 인접 조직에 주입 샘플 신속하게 유체 압력을 구축하고 샘플의 나머지의 전달을 방지할 수있는 경우. 이러한 실패 시험의 각 따라서 몇 가지 샘플을 잃게됩니다. 이 손실을 최소화하기 위해 경험이 연구자는 바늘이 샘플의 최소 금액을 주입하고 유체 압력의 저항을 평가하여 정맥 또는하지의 여부를 예측하려고합니다. 그가 저항을 느끼는 경우, 바늘은 정맥에해서는 안됩니다 그는 다음 바늘을 뽑아 다시 시도합니다. 아무 저항을 생각하지 않으면 바늘이 혈관에해야하며 시료의 모든 한번에 주입됩니다. 후자의 경우, 하나는 종종 그것이 몸쪽으로 그것의 방법을 만들면서 혈액을 이동시켜 생기죠, 정맥 최대 샘플 "골인"를 볼 수 있습니다.
그것이 크게 세포의 전이성 가능성에 따라 다릅니다 이후 분석은 각 세포주에 대한 경험적으로 결정되어야 종료할 때. 생쥐는 주사 후 다른 시간 시점에서 해부되고 폐 전이의 범위가 결정됩니다. 그것은 양적 결과를 제공하며 후보 유전자 섭동 의한 metastases의 증가 또는 감소를위한 공간을 떠난 이후 미세 감지 폐 metastases의 셀 수있는 숫자 결과가 일반적으로 선택되는 시간의 길이. 긍정적인 제어로 높은 전이성 세포 라인을 (예 : 인간 흑색증 셀 라인, A375, 또는 높은 전이성 파생 상품 등)를 사용하여, 처음으로이 분석을 수행하는 연구자를위한 것이 좋습니다. 또한, 마우스의 나이와 성별은 크게 결과에 영향을, 그것이 다른 세포 라인의 전이성 능력을 비교하는 경우 일관된 연령 및 성별을 유지하는 것이 좋다는 것이다. 위에서 언급한 요인에 의해 도입된 변화로 인해 적어도 다섯 생쥐는 어떤 통계적으로 의미있는 결론에 도달하는 각 세포주에 대한 주입해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 프로토콜은 테스트 및 박사 리차드 하인즈 (MIT)의 실험실에서 처음에 최적화되었습니다. 기금은 NYSTEM 아이디어 수상 (LX)을하고 루트 L. Kirschstein 내셔널 리서치 서비스 수상 (LX)를 제공합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
