Summary
세포 - 표면 마커에 대한 인간의 pluripotent 줄기 세포의 중지 immunocytochemical 얼룩 (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4)가 관측 및 부량에 대한 세포 monolayer을 생성하기 위해 스스로 만든 cytospin 장치의 사용을 기반으로 달성했다.
Abstract
인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 인간의 유도 pluripotent 줄기 세포 (hiPSCs)를 포함 인간 pluripotent 줄기 세포 (hPSCs)은 무한한 자기 갱신 기능 및 여러 세포 유형으로 구별하기 위해 잠재적으로 인해 흥미로운 셀 소스입니다. hPSCs의 pluripotent 상태는 일반적 qPCR, immunocytochemistry 같은 방법으로 평가, 그리고 기타로
Protocol
1 부 : 서스펜션 Immunocytochemical 스테 이닝
- 세포는 단일 세포 현탁액에 수확하고 있습니다.
- 세포는 다음 1.5 2mL microcentrifuge 튜브로 옮겨 4 분 200g에 centrifuged 있습니다.
- 세포 표면에 뜨는을 aspirating에 의해 씻겨 있으며, PBS의 1mL에 다시 일시 중지 - (MG이없는 + 및 CA 2 +) 4 분 200g에서 다시 centrifuged 다음합니다. 이것은 두 번 수행되어야합니다.
- 세척 후, 세포를 그 다음 10 분 동안 상온에서 1mL 4 %의 paraformaldehyde (PFA)에 다시 보류 그들에 의해 해결됩니다.
- 전지는 PBS의 1mL와 함께 두 번 다시 씻어 있습니다 -.
- 로 세척, 블록 전지 후 다시 정지 차단 솔루션 1mL (6 % serum/94 % PBS -)에 있습니다. 45 분 동안 실온에서 이들을 품어.
- 후, 4 분 200g에 튜브를 원심 분리기 및 차단 솔루션을 대기음. 기본 항체 용액 (권장 희석에서 차단 솔루션으로 만들어진)의 1mL의 세포를 다시 일시 중지합니다. 세포 중 1 시간 또는 4 ° C 하룻밤 다음 단계를 진행하기 전에 실온에서 incubated 수 있습니다.
- 전지는 다음 블록 솔루션 1mL로 두 번 씻어 있습니다.
- 차 항체 용액 (권장 희석에서 차단 솔루션을 만든)과 1 시간 동안 실온에서 품어의 1mL에 다시 정지 세포, 후.
- 일시간 후, 세포를 그 다음 블록 솔루션 1mL와 함께 두 번 다시 세탁해야합니다.
- 차단 솔루션과 함께 세척 후, PBS의 1mL로 다시 세포를 씻어 -.
- 다양한 세척 후의 1mL의 세포를 다시 중단 DAPI 핵 얼룩 (PBS에서 DAPI의 1:10,000 희석 -) 5 분 실온에서 알을 품다.
- 5 분 후에, 4 분 200g에 튜브를 원심 분리기. - PBS의 1mL의 DAPI 핵 얼룩 솔루션과 다시 중단 세포를 대기음.
2 부 : cytospin 장치를 통해 생성된 슬라이드의 hPSCs의 설립
- 플라스틱 슬라이드는 드릴 프레스와 그들의 구멍에서 원하는 금액을하여 준비가되어 있습니다. 직경 사용할 micropipette 팁 (들)의 넓은 직경보다 가장 큰 1mm에서해야합니다.
- 필터 페이퍼는 가위로 플라스틱 슬라이드의 매개 변수로 절단됩니다.
- 구멍은 다음 여과지에 만들어집니다. 구멍의 크기 (들) micropipette 팁 (S)는 그것을 통해 snuggly 맞는 충분히 커야합니다.
- 후 준비 플라스틱 슬라이드 중 하나는 상단과 컷 필터 용지 (그림 1)의 하단에 위치에있는 유리 슬라이드에 배치됩니다. 레이어는 테이프로 안전하고 있습니다.
- 파트 1에서 스테인드 세포 현탁액의 100μL의 최대 (원하는 monolayer 밀도에 따라 다름) 다음 micropipette 팁 (들)의 상단에 배치됩니다.
- 필요한 경우, 셀 솔루션기구는 무게와 유사한 체중의 카운터 - 균형을 만들 수 있습니다.
- cytospin 장치 및 카운터 - 균형은 다음 바탕 화면 원심 분리기에 배치 4 분 200g에 centrifuged 아르 수 있습니다.
- 원심 분리 후, cytospin 장치는 신중하게 유리 슬라이드에서 세포를 이동시키다 나던 방법으로 분해됩니다.
- 필요한 경우, 초과 주변 PBS - 유리쪽에에 밖으로 aspirated.
- 세포는 다음 원하는 세포 monolayer가 달성되었는지 확인하기 위해 형광 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다.
파트 3 : 슬라이드 마운트
- 원하는 설치 미디어의 방울이 세포를 포함하는 각 지역의 중심에 직접 저장됩니다.
- 후 커버 슬립이 부드럽게 가능한 경우 기포를 피하려고 슬라이드로 저하됩니다.
- 초과 설치 미디어는 다음 슬라이드에서 제거됩니다.
- 후, 커버 전표의 측면은 손톱 바니와 함께 봉인하고 있습니다.
- 결과가 관찰하고 설명하는 때까지 슬라이드는 어두운 저장 영역에 보관하실 수 있습니다.
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Discussion
우리 연구소의 목적을 위해, 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEFs)에 성장 줄기 세포 문화 35mm 요리가 cytospin 장치와 함께 사용하기위한 immunocytochemical 얼룩 절차에 할당된 것입니다. 세포는 다음 단일 세포 현탁액에, 가능한 한 MEF 층의 제거, passaging 효소에 의해 수집됩니다. MEF 계층에서 더 효과적으로 줄기 세포 격리가 필요한 경우, 식민지를 수동으로 정지에 소화 다음 포착 수 있습니다. 피더 무료 조건은 줄기 세포의 문화를 성장에서 사용하는 경우, 식민지 단순히 긁어 냈 및 정지로 소화 수 있습니다. 초기 단일 세포 현탁액 이상적이지만, 모든 세포 대단히 짧은 시간은 효과적으로 immunocytochemical 얼룩 프로 시저에 대한 호출 수많은 세탁 다시 정지 단계에 걸쳐 분해해야합니다.
동영상은 얼룩의 hPSCs에 대한 세포 마커의 사용에 초점을 맞추었습니다. hPSCs의 세포내 얼룩이 원하는 경우, 차단 솔루션의 추가하기 전에 추가 단계 (단계 1.6)은 세포가 Permeabilization 솔루션 1mL에 씻어 아르했었습니다 (트윈 20 25μL로 높은 소금 버퍼의 50mLs)을 세 번 할 필요가 하기 전에 다시 보류 블록 솔루션에 있습니다. 언급해야 또 다른 중요한 포인트는 프로 시저에서 1.9 단계에서 치료가 형광 차 항체의 표백 및 DAPI 핵이 얼룩을 방지하기 위해 샘플에 빛을 노출을 최소화로 이동해야한다는 것입니다.
때문에 수많은 세탁과 프로 시저에서 다시 서스펜션 단계 400k - 600k 세포 주위에 가지고 추정 통과 가능한 줄기 세포 식민지의 좋은 금액 랑 35mm 요리의 초기 정지에 소화하는 것이 좋습니다 사용 . 이 절차의 성격으로 인해 일부 세포의 손실에 대비 이루어집니다. 이론적으로, 세포의 훨씬 작은 금액은 초기 정지에 사용될 수 있지만 치료의 추가 금액은 더 셀 손실을 최소화하기 위해 이동해야합니다. immunocytochemical 얼룩 절차 후 cytospin 장치에 로드할 때, 10K - 50K의 세포 밀도가 이상적입니다. 이상적인 셀 밀도를 포함하는 것이 좋습니다 - 이것은 100μL가 0.1μL 10μL micropipette 팁을 사용하는 cytopsin 장치에 로드할 수있는 최대 금액, 작은 금액 (30μL 20μL 정도) 동안, 그 언급해야합니다. 이것은 유리 슬라이드에 액체의 불필요한 오버플로우를 최소화합니다. 마지막으로, 원심과 cytospin 장치를 사용할 때, 한 기기는 틀지 또는 떨어지에서 장치를 유지에 충분한되었습니다 측면 운동, 우리의 지식이 있습니다 실행하는 동안 원심 분리기에 의해 생성된 힘에서 보안 때문입니다.
immunocytochemical 절차에 사용되는 솔루션에 대한 성분 :
- 2 % Paraformaldehyde (PFA) / 2 % 자당
- 56 온수 저어 플레이트에 75 ML 증류수, 장소 추가 ° C.
- 2g PFA를 무게, 그리고 유리 비커에 추가할 수 있습니다.
- 2g의 자당을 무게, 유리 비커에 PFA 추가할 수 있습니다.
- 1M 수산화 나트륨 2 방울을 추가합니다.
- 모든 시약은 용액에 갔을되면, 10X PBS의 10 ML을 추가합니다 + +.
- 7.2-7.4로 솔루션의 산도를 조정합니다.
- 증류수 100 ML에 볼륨을 가져 오십시오.
4 스토어 ° C, 1 주일 이내에 사용합니다. Aliquots는 1 달 동안 @ -20 ° C 저장할 수 있습니다. 어떤 침전물을 제거하는 해동 후 간단히 원심 분리기.
- 블록 솔루션 (10mL)
- 9.4 ML PBS를 추가 -.
- PBS 0.6 ML의 혈청을 추가 -. (이것은 각각의 항체에 최적화된해야 할 수 있습니다.)
4 스토어 ° C, 48 시간 이내에 사용합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품에 대한 부분적인 자금은 NSF - 경력 0,744,556 (라오)와 VCU - HHMI 과학 교육 및 연구 프로그램 (파스쿠알)을 통해 장학금에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab Tek Permanox Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 117437 | Material for re-used plastic slides |
| Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 0.1-10μL Filter Tips | USA Scientific, Inc. | 1121-3810 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 120542-B | |
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | Mounting Medium |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 10000C | |
| Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody | EMD Millipore | MAB4304 | Primary Antibody for SSEA-4 staining |
| Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody | EMD Millipore | MAB4303 | Primary Antibody for SSEA-3 staining |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11029 | Secondary Antibody for SSEA-4 staining |
| Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG | Invitrogen | A11006 | Secondary Antibody for SSEA-3 staining |
| DAPI, Dihydrochloride | Calbiochem | 268298 |
References
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R.
