Immunocytochemical تحليل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام جهاز Cytospin عصامي

Summary

وقد تحقق تلطيخ تعليق immunocytochemical البشرية الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) عن سطح الخلية علامات (SSEA-3/SSEA-4) على أساس استخدام جهاز cytospin عصامي لإنشاء أحادي الطبقة من الخلايا للمراقبة والقياس الكمي.

Abstract

الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) التي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والبشرية الناجمة عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) هي مصادر الخلية مثيرة نظرا لقدراتها الذاتية التجديد لا حدود لها وقدرتها على التمايز إلى أنواع خلايا متعددة. عادة ما يتم تقييم حالة المحفزة للhPSCs بواسطة تقنيات مثل qPCR ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، وغيرها

Protocol

الجزء 1 : يلطخ تعليق Immunocytochemical

1. ويتم حصاد الخلايا في خلية واحدة تعليق.
2. ثم يتم نقل الخلايا في أنابيب microcentrifuge 1.5 2mL وطرد في 200G لمدة 4 دقائق.
3. تغسل الخلايا التي طاف بها الشفط ، وإعادة معلقة في 1mL من برنامج تلفزيوني -- (بدون المغنيسيوم والكالسيوم ^{2 + 2 +)} ثم طرد مرة أخرى في 200G لمدة 4 دقائق. وينبغي أن يتم ذلك مرتين.
4. بعد غسلها ، ثم يتم إصلاح الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في بارافورمالدهيد ٪ 1mL من 4 (PFA) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
5. يتم غسلها مرتين مع الخلايا مرة أخرى 1mL من برنامج تلفزيوني --
6. بعد غسل كتلة الخلايا ، من خلال إعادة تعليقها في 1mL من الحل بلوك (6 ٪ serum/94 PBS ٪ --). احتضان هذه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
7. بعد ذلك ، في أنابيب الطرد المركزي 200G لمدة 4 دقائق ، ونضح من الحل بلوك. اعادة تعليق الخلايا في 1mL الضد من الحل الأساسي (كتلة مصنوعة من الحل في التخفيف مستحسن). يمكن أن تكون إما خلايا حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو على 4 درجات مئوية خلال الليل قبل الشروع في الخطوة التالية.
8. ثم يتم غسلها مرتين مع الخلايا 1mL من الحل بلوك.
9. بعد ذلك اعادة تعليق الخلايا في جسم 1mL حل الثانوية (مصنوعة من كتلة الحل في التخفيف الموصى بها) ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
10. بعد 1 ساعة ، يجب أن تكون الخلايا ثم غسلها مرة أخرى مرتين مع 1mL من الحل بلوك.
11. بعد غسله بمحلول بلوك ، يغسل خلايا مرة أخرى مع 1mL من برنامج تلفزيوني --
12. بعد يغسل المختلفة ، وإعادة تعليق من الخلايا في 1mL دابي النووية وصمة عار (1:10،000 تخفيف دابي في برنامج تلفزيوني --) ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
13. بعد 5 دقائق ، في أنابيب الطرد المركزي 200G لمدة 4 دقائق. نضح بها النووية دابي حل صمة عار والخلايا في اعادة تعليق 1mL من برنامج تلفزيوني --

الجزء 2 : إدراج hPSCs في الشرائح التي تتولد من خلال جهاز cytospin

1. وتعد الشرائح البلاستيكية بجعل المبلغ المطلوب من الثقوب فيها مع الصحافة الحفر. القطر يجب أن يكون أكبر في معظم 1MM من أوسع قطرها غيض micropipette (ق) ليتم استخدامها.
2. يتم قطع الورق لتصفية المعلمات الشريحة من البلاستيك مع المقص.
3. ثم يتم إجراء ثقوب في ورقة الترشيح. ينبغي أن حجم الثقب (ق) أن تكون كبيرة بما يكفي التلميح micropipette (ق) يناسب سنججلي من خلال ذلك.
4. بعد ذلك ، وضعت واحدة من الشرائح البلاستيكية أعدت على أعلى شريحة زجاجية وضعت في أسفل ورقة تصفية قطع (الشكل 1). يتم تأمين طبقات مع الشريط.
5. ثم يتم وضع كحد أقصى 100μL (اعتمادا على الكثافة أحادي الطبقة المطلوب) لتعليق الخلية الملون من الجزء 1 الى الجزء العلوي من طرف micropipette (ق).
6. إذا لزم الأمر ، يمكن أن وزن الجهاز مع حل الخلية ، وخلق توازن مضاد لوزن مماثل.
7. ويمكن للجهاز cytospin ومكافحة ميزان ثم توضع في جهاز الطرد المركزي في سطح المكتب وطرد 200G لمدة 4 دقائق.
8. بعد الطرد المركزي ، يتم تفكيكها بعناية جهاز cytospin بطريقة أن لا إزاحة الخلايا من شريحة زجاجية.
9. إذا ، من الضروري زيادة PBS المحيطة بها -- على الجانب الزجاجي في يستنشق بها.
10. ويمكن عندئذ أن ينظر الخلايا باستخدام مجهر مضان للتحقق مما إذا تم تحقيق المونولاير الخلية المطلوبة.

الجزء 3 : تركيب الشرائح

1. يتم وضع قطرة من وسائل الإعلام المطلوب تركيب مباشرة في مركز كل منطقة تحتوي على الخلايا.
2. بعد ذلك يتم خفض بلطف زلة تغطية على الشرائح في محاولة لتجنب فقاعات الهواء إذا أمكن ذلك.
3. ثم تتم إزالة الزائدة وسائل الاعلام متزايدة من الشرائح.
4. بعد ذلك يتم اغلاق الجانبين من زلات مع تغطية طلاء الأظافر.
5. يمكن الاحتفاظ الشرائح في منطقة مظلمة حتى يتم تخزين النتائج لوحظ وتوثيقها.

Discussion

لأغراض مختبرنا ، يتم تخصيص طبق 35mm الثقافات الخلايا الجذعية الجنينية المزروعة في الخلايا الليفية الماوس (MEFs) لإجراء تلطيخ immunocytochemical للاستخدام مع جهاز cytospin. ثم يتم جمع الخلايا من خلال الركض الأنزيمية ، وإزالة أكبر قدر من طبقة MEF ممكن ، في تعليق وحيد الخلية. إذا كان المطلوب أكثر من الخلايا الجذعية فعالة بمعزل عن طبقة MEF ، يمكن المستعمرات التقطت يدويا ثم هضمها في التعليق. إذا استخدمت ظروف التغذية الحرة في زراعة الخلايا الجذعية الثقافات ، يمكن ببساطة أن المستعمرات كشطت وهضمها في التعليق. بينما أولية وحيدة الخلية تعليق مثالي ، ينبغي بفعالية أي كتل الخلوية يمكن كسرها بعيدا في أنحاء عديدة الغسيل وإعادة تعليق الخطوات المطلوبة في هذا الإجراء تلطيخ immunocytochemical.

ركز الفيديو على استخدام علامات خارج الخلية لhPSCs تلطيخ. إذا كان المطلوب من الخلايا تلطيخ hPSCs ، خطوة إضافية قبل إضافة محلول بلوك (الخطوة 1.6) يجب القيام به حيث يتم غسل الخلايا في محلول من 1mL Permeabilization (50mLs العازلة من الملح مع 25μL من توين 20) ثلاث مرات قبل إعادة تعليقها في الحل بلوك. نقطة أخرى الحرجة التي ينبغي ذكرها هي أن من الخطوة 1.9 في الإجراء ، ينبغي توخي الحذر في التقليل من التعرض للضوء على عينات لمنع تبييض مضان من الأجسام المضادة الثانوية وصمة عار دابي النووية.

بسبب العديد من غسل وإعادة تعليق الخطوات في هذا الإجراء ، طبق كامل 35mm مع كمية لا بأس بها من جاهزة للمرور مستعمرات الخلايا الجذعية ، تشير التقديرات إلى أن حوالي 400K - 600K الخلايا ، فمن المستحسن أن يتم هضمها واستخدامها في التعليق الأولي . يتم ذلك تحسبا لفقدان بعض الخلايا نتيجة لطبيعة هذا الاجراء. نظريا ، يمكن استخدام كمية أقل بكثير من الخلايا في التعليق الأولي ولكن يجب أن تؤخذ كمية اضافية من الرعاية من أجل تقليل خسارة المزيد من الخلايا. عند تحميلها على جهاز cytospin بعد العملية تلطيخ immunocytochemical ، كثافة الخلية 50K - 10K هو المثل الاعلى. وتجدر الإشارة إلى أنه ، في حين 100μL هو المبلغ الأقصى الذي يمكن تحميله على جهاز يستخدم cytopsin 0.1μL غيض micropipette 10μL ، وهي كمية أقل (حوالي 20μL -- 30μL) التي تحتوي على كثافة الخلية المثالي هو الموصى بها. هذا يقلل من السائل الفائض لا لزوم لها على الشريحة الزجاجية. أخيرا ، عند استخدام أجهزة الطرد المركزي مع cytospin ، طالما أن الجهاز هو في مأمن من الحركة الجانبية ، وقوة الطرد المركزي التي أنشأتها أثناء تشغيل و، على حد علمنا ، لم تكن كافية في الحفاظ على الجهاز من التقليب أو السقوط.

المكونات اللازمة لحلول المستخدمة في إجراء immunocytochemical :

1. 2 ٪ لامتصاص العرق (PFA) / السكروز 2 ٪
   1. إضافة 75 مل من الماء المقطر ، ووضع على لوحة اثارة ساخنة عند 56 درجة مئوية.
   2. خارج تزن 2 غرام PFA ، وإضافة إلى الدورق الزجاجي.
   3. خارج تزن 2 غرام السكروز ، وإضافة إلى منهاج العمل في الدورق الزجاجي.
   4. إضافة 2 قطرات من هيدروكسيد الصوديوم 1M.
   5. مرة واحدة كل الكواشف قد ذهب إلى حل ، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 10X + +.
   6. ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل ل7،2-7،4.
   7. لإظهار حجم 100 مل من الماء المقطر.
      المحل في 4 درجات مئوية ، واستخدم في حدود 1 في الاسبوع. ويمكن تخزين Aliquots @ -20 درجة مئوية لمدة شهر 1. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة بعد ذوبان لإزالة أي راسب.
2. كتلة محلول (10ML)
   1. إضافة 9.4 مل PBS --.
   2. إضافة 0.6 مل من الدم إلى برنامج تلفزيوني -- (وهذا قد يحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل الأجسام المضادة).
      المحل في 4 درجات مئوية ، واستخدم في غضون 48 ساعة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normal Goat Serum	Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG	Invitrogen	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride	Calbiochem	268298