Summary
Создание хронического бактериального инфицированных мышах со стойкими
Abstract
Бактериальных инфицированных мышах представляет собой мощную систему моделью для изучения таких областях, как инфекции, воспаления, иммунологии, передача сигнала, и опухолей. Многие исследователи воспользовались колит индуцированных
Protocol
Этот протокол включает в себя три части: бактериальные культуры, мышь желудочный зонд, и сальмонеллы обнаружения.
1. Сальмонеллы условием роста.
- Подготовка Salmonella Лурия-Бертани бульон (LB) пластины, инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи.
- Выберите клона из LB пластины и введены в 7 мл LB в 12 мл трубки, и трясти при 37 ° С в течение примерно 5 часов.
- Привить 50 мл LB с 0,05 мл стационарная фаза культуры и инкубировать при температуре 37 ° C без встряхивания в течение 18 часов.
- Спиновые ночь бактериальной культуры при комнатной температуре с 6000 оборотов в минуту в течение 10 минут, приостановить бактерий в HBSS использованием соотношение 100:3 (LB: HBSS). Например:
Каждые 50 мл LB культуры будет приостановлен в 1,5 HBSS мл. - Для животных желудочный зонд, далее разбавленный бактериальные культуры в 1:10. Например:
Каждый 1,5 мл LB культуры будет приостановлен в 15 мл HBSS.
2. Salmonella-инфекции модели *.
- Подготовка стрептомицин решение. Каждая мышь будет предоставлена 7,5 мг стрептомицина в 100 мкл HBSS. Например, подготовить всего 90 мг стрептомицина в 1,2 мл HBSS в течение 10 мышей. Всегда есть дополнительный объем при подготовке стрептомицин решение.
- Вывод воды и пищи за 4 часа до устного зонд лечения.
- Принудительным кормлением мышей с стрептомицина с 7,5 мг стрептомицина (100 мкл HBSS для контрольных мышей). Захватите кожу над мышью плечо крепко большим и средним пальцами, растянуть головы и шеи с указательным пальцем, чтобы сделать пищевода прямо. Прямой шар-кончик иглы кормление по небу и к правой стороне задней стенке глотки, затем аккуратно пройти вниз в пищевод и вводят 100 мкл раствора. Нет сопротивления должно ощущаться.
- В 20 часов после лечения стрептомицином, изъятые воды и пищи еще раз до мышей, инфицированных бактериями.
- Желудочный зонд каждой мыши с 100 мкл суспензии в HBSS или обработаны стерильной HBSS (контроля) по устной желудочный зонд. Желудочный зонд процедура такая же, как 2,3) принудительным кормлением мышей с стрептомицин.
Эксперименты * животных проводили с помощью специфических патогенов без женщин C57BL / 6 мышей (Taconic, Гудзон, Нью-Йорк), которые были 6-7 недель, как описано выше 1. Протокол был одобрен Университета Рочестерского университета комитета по ресурсам животных (UCAR).
3. Обнаружение сальмонелл в кишечнике.
- Сбор мыши фекальные (около 100 мг).
- Передача фекальные образца 1,5 микро центрифужную пробирку с 1 мл PBS и вихревые энергично.
- Центрифуга в течение 10 мин при 800 оборотах в минуту. Передача супернатант в чистую пробирку и отцентрифугировать.
- Центрифугирования при 6000 оборотов в минуту для 5мин. Супернатант отбрасывается и 200 мкл PBS добавляется в гранулы и встряхивали.
- Подряд 200 мкл PBS с одноразовыми разбрасыватель ячейку BBL пластины CHROMagar для обнаружения сальмонеллы. Сальмонеллы видов появляются розовато-лиловый (розового до фиолетового, см. Рис.1). Если 200 мкл дает слишком много колоний на пластину, используйте 100 мкл или 50 мкл для полосу.
4. Представитель результаты.
Когда протокол будет сделано правильно, колонизация Salmonella Typhimurium могут быть обнаружены в кишечнике мышей в течение 6 месяцев. Сальмонеллы могут быть обнаружены фекальные культуры в течение 6 месяцев (рис. 1). В качестве типичного из выйдет из этой модели, тело потери веса и смерти происходит в течение 4 недель после инфекции. В зависимости от сальмонеллы штаммы, используемые для инфекции, некоторые мышей могут не выжить в течение 6 месяцев.
Рисунок 1. Кишечные сальмонеллы в Salmonella видов появляются розовато-лиловый (розового до пурпурного) цвета, вследствие метаболических различий в присутствии выбранного хромогенов. Другие бактерии, либо подавляется или производить сине-зеленые или бесцветные колонии.
Рисунок 2. Выживание пропорции мышей, инфицированных сальмонеллой мутантного штамма PhoP с, PhoP с Авра-и PhoP с AvrA-/AvrA +, PhoP с Avra в течение 4 недель (28 дней).
Таблица 1. Масса тела мышей, инфицированных сальмонеллой в течение 4 недель.
| 0 | 1 неделя | 2-х недель | 3 недели | 4 недели | |
| контроль | 16,78 ± 1,05 | 16,91 ± 1,28 | 18,26 ± 1,23 | 19,31 ± 1,26 | 20,26 ± 1,15 |
| PhoP с 16,89 ± 1,03 | 17,14 ± 1,19 | 17,43 ± 1,63 * | 18,68 ± 1,78 | 20,05 ± 1,11 | |
| PhoP с Авра- | 16,91 ± 1,12 | 16,96 ± 1,39 | 17,06 ± 2,14 ** | 18,71 ± 2,18 | 20,15 ± 1,56 |
| PhoP с AvrA-/AvrA + | 16,94 ± 0,96 | 17,17 ± 1,02 | 17,63 ± 1,42 * | 18,44 ± 2,03 | 20,09 ± 1,17 |
* По сравнению с контрольной группой р <0,05
** По сравнению с контрольной группой р <0,01
Таблица 2. Сальмонеллы штаммы, используемые в данном исследовании.
| Имя | Описание | Ссылка или источник |
| Сальмонелла 14028s | Дикого типа С. Typhimurium | АТСС |
| PhoP с | Номера для патогенных комплекса регулятор мутант | Миллер и соавт., 1990 |
| PhoP с Авра- | Авра-мутации | Кольер-Hyams и соавт., 2002 |
| PhoP с AvrA-/AvrA + | PhoP с Авра-плазмиды с дополняемыми Avra кодирования | Кольер-Hyams и соавт., 2002 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для использования этой системы, это необходимо для исследователя чтобы узнать, как зонд животных. Мы подробно методология подготовки бактериальные культуры и принудительным кормлением мышей. Мы также показываем, как осуществлять мониторинг сальмонеллы настойчивость в желудочно-кишечном тракта (ЖКТ). Критические шаги в этом протоколе в том числе:
- Стрептомицин-предварительной обработки: Стрептомицин-предварительной обработки могли бы избавиться от некоторых синантропных флоры кишечника и сделать мышей восприимчивы к инфекции сальмонеллы 2.
- Сальмонелла зонд: для начинающих, зонд может быть сложной задачей. Когда-то, зонд не потому, что решение случайно вводится в дыхательные пути и вызывает мыши смерти.
- Стойкие бактериальной колонизации: необходимость тщательного мониторинга бактерий в желудочно-кишечном тракте. В дополнение к мыши фекальной культуры, содержимое слепой кишки может также использоваться для обнаружения сальмонеллы в BBL пластин CHROMagar. Сбор слепой кишки содержимое, когда мыши были принесены в жертву после сальмонеллезной инфекции.
Мы протестировали сальмонеллы колонизации мыши в различных концентрациях: 1 х 10 3 КОЕ в 1 х 10 8 колониеобразующих единиц (100 мкл / мышь). На 1 х 10 6 до 10 х 10 8 колониеобразующих единиц, сальмонелла удалось колонизировать мышей. Поэтому, исходя из наших предыдущих публикаций 1, 5 и неопубликованные данные, конечная концентрация сальмонеллы в этом решении не будет измеряться перед принудительным кормлением.
В этой экспериментальной процедуры, мы использовали конкретных патогенов без женщин C57BL / 6 мышей (Taconic, Гудзон, Нью-Йорк), которые были 6-7 недель. Бактериальные штаммы, используемые включать Salmonella Typhimurium штамма дикого типа ATCC14028s (WT-SL), непатогенные мутантный штамм сальмонеллы PhoP c3, PhoP с Авра-и PhoP с AvrA-/AvrA +, PhoP с Avra (таблица 2). Используя этот протокол, Salmonella Typhimurium колонизации может быть обнаружен в кишечнике мышей в течение 6 месяцев (Рис1). Заражение сальмонеллой и воспаление измерялась путем наблюдения фекалии и мальчик весом. Когда образцы тканей и крови были собраны, длина кишечника был измерен как функция кишечного воспаления. Веса селезенки и печени также были рассмотрены. Мышь сыворотке цитокинов были проверены ELISA5. Более того, биохимические и молекулярные методы в дальнейшем используются для проверки изменений, воспалительных цитокинов и патологии изменения, вызванные сальмонеллой 5.
Как правило, потеря веса тела и смерти происходит в течение 4 недель после заражения (табл. 1). Сообщение сальмонеллезной инфекции, была значительная потеря веса тела в бактериальных инфицированных группах по сравнению с контрольной группой без лечения бактериального (* р <0,05 и р <0,001 Таблица 1). Массы тела измеряли в неделю. Выживание пропорции 4 недели после заражения были показаны на рис. 2. В целом, 92% мышей (п = 50) инфицированы штаммами Salmonella PhoP с, 78% PhoP с Авра-, или 70% PhoP с AvrA-/AvrA + может выжить с постоянным сальмонелл в кишечнике. После острой инфекции, все выжившие до сих пор осуществляется сальмонелла, которая может быть обнаружена после заражения 6 месяцев с помощью метода, описанного в этом предложении. После мышей выжить 3 недели после заражения, мыши получили массу тела и менее смерть наступила (рис.2). Кроме того, данные immunofluroscence окрашивание также показывают вторжения сальмонеллы в слизистой оболочке кишечника 27 недель после заражения (рис.3). Эти данные показали, что PhoP с, PhoP с Авра-или PhoP с AvrA-/AvrA + может быть использована для модели хронического инфицирования.
Мыши с принимающими Коэффициент сопротивления Nramp1 + / +, устойчивых к инфекции сальмонеллы 3-6. C57/BL6 мыши с дефектным Nramp было использовать в текущих исследований. Мы обнаружили, что 90% мышей, зараженных патогенным штаммом сальмонеллы 14028s не может выжить в течение 4 недель (данные не приведены). Для того чтобы понять долгосрочные последствия дикого типа инфекции S. Typhimurium, мыши с Nampr1 + / + может быть использован.
Эта модель создана в BSL-2 лаборатории. Наш протокол утверждается Университета Рочестерского университета комитета по ресурсам животных (UCAR). Мышей, зараженных сальмонеллой, скорее всего, страдают дискомфорта и дистресса и становятся менее активными и двигаться медленно. Их мех может стать взъерошенные и они не могут питаться и пить как обычно. Животные будут внимательно следил, и если какие-либо признаки дискомфорта, такие как не в состоянии передвигаться достаточно хорошо, чтобы сохранить увлажнение и калорий Если мышь показала признаков того, что он атмосферный жидкости или значительной потере массы тела (10% и более) 7, и сделал не умирают сразу, мышь гуманно усыпляют. Все лабораторные персонал будет обученнаблюдения мышей надлежащим 8, 9.
Многие исследования использовали стрептомицин предварительной обработки воспользовались колит индуцированных Salmonella Typhimurium для исследования на ранней стадии инфекции 1,2,10. Тем не менее, лишь немногие отчет о хронической инфекции в мышиной модели в естественных условиях 11. Мыши с сальмонеллой стойкие существование в желудочно-кишечном тракте позволит нам изучить долгосрочные хост-бактериальных взаимодействие, передача сигнала, и опухолей. Мы установили хронический бактериальный инфицированных мышах с Salmonella Typhimurium колонизации в кишечнике мышей в течение 6 месяцев. Эта модель может также использоваться для E.coli патогенеза и пробиотики исследований. В целом, этот протокол поможет исследователям с помощью мыши модель для решения принципиально важных биологических и микробиологических вопросы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIDDK KO1 DK075386 гранта и Американского онкологического общества RSG-09-075-01-MBC в июне ВС
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
References
- Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
- Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
- Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
- Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
- Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
- Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
- Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
- Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).
- Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , Forthcoming (2010).
