Summary
Estabelecer um modelo de camundongo bacteriana crônica infectados com persistente
Abstract
O modelo do rato infectado de bactérias é um sistema poderoso modelo para o estudo de áreas tais como inflamação, infecção, imunologia, transdução de sinal, e tumorigênese. Muitos pesquisadores têm se aproveitado da colite induzida por
Protocol
Este protocolo inclui três partes: detecção de cultura bacteriana, gavage mouse, e Salmonella.
1. Condições de crescimento Salmonella.
- Prepare a Salmonella Luria-Bertani caldo de placa (LB), incubar a 37 ° C durante a noite.
- Escolha um clone da placa de LB e colocar em 7 LB ml em um tubo de 12 ml, e agitar a 37 ° C por cerca de 5 horas.
- Inocular 50 ml LB com 0,05 ml de uma cultura de fase estacionária e incubar a 37 ° C sem agitação por cerca de 18 horas.
- Rotação de cultura bacteriana durante a noite a temperatura ambiente com 6000 rpm por 10 minutos, suspender as bactérias em HBSS usando 100:3 ratio (LB: HBSS). Por exemplo:
Cada cultura LB 50 ml será suspenso em 1,5 ml HBSS. - Para a sonda animal, diluir a cultura bacteriana na proporção de 1:10. Por exemplo:
A cada 1,5 ml de cultura LB será suspenso em 15 ml HBSS.
2. Salmonella modelo de infecção *.
- Preparar a solução de estreptomicina. Cada rato será dado 7,5 mg de estreptomicina em 100 mL HBSS. Por exemplo, prepare mg 90 total de estreptomicina, em 1,2 ml de HBSS 10 ratos. Sempre tem algum volume extra na preparação da solução de estreptomicina.
- Retirar água e comida 4 horas antes do tratamento gavagem oral.
- Camundongos gavagem com estreptomicina com 7,5 mg de estreptomicina (100 l de HBSS para os ratos de controle). Agarre a pele sobre o ombro do mouse firmemente com o polegar eo dedo médio, esticar a cabeça e pescoço com o dedo indicador para fazer o esôfago em linha reta. Dirigir a bola ponta da agulha de alimentação ao longo do céu da boca e em direção ao lado direito da parte de trás da faringe, em seguida, delicadamente passar para dentro do esôfago e injetar a solução de 100 ml. Nenhuma resistência deve ser sentida.
- Menos 20 horas após o tratamento estreptomicina, água e alimentos retirados novamente antes de os camundongos são infectados com bactérias.
- Gavagem cada rato com 100 mL de suspensão em HBSS ou tratados com HBSS estéril (controle) por gavagem oral. O procedimento de gavagem é o mesmo que 2.3) ratos gavage com estreptomicina.
Experimentos em animais * foram realizadas utilizando-específicas isentos de agentes patogénicos C57BL feminino / 6 camundongos (Taconic, Hudson, NY), que foram 6-7 semanas de idade, como descrito anteriormente 1. O protocolo foi aprovado pela Universidade de Rochester University Comité de Recursos Animal (UCAR).
3. Detecção de Salmonella no intestino.
- Coletar rato fecal (cerca de 100 mg).
- Transferência da amostra fecal a um tubo de centrífuga de 1,5 micro com 1ml de PBS e vortex vigorosamente.
- Centrifugar por 10 min a 800 rpm. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo.
- Centrifugação a 6000 rpm por 5 min. Sobrenadante é descartado e 200 mL PBS é adicionado à pellets e agitadas.
- Raia o PBS 200 mL com um espalhador de células em um prato descartável CHROMagar BBL para detectar Salmonella. Espécies Salmonella aparecem malva (rosa ao roxo, ver Fig.1). Se 200 mL rende muitas colônias na placa, use 100 ml ou 50 ul para a raia.
4. Resultados representante.
Quando o protocolo é feito corretamente, a colonização de Salmonella typhimurium pode ser detectado no intestino do rato mais de 6 meses. Salmonella pode ser detectado por cultura fecal mais de 6 meses (Fig.1). Como fora típico vêm deste modelo, o corpo de emagrecimento e morte ocorrer dentro de 4 semanas após a infecção. Dependente do Cepas de Salmonella usado para infecção, alguns ratos não podem sobreviver mais de 6 meses.
Figura 1. Salmonella intestinal na espécie Salmonella aparecem malva (rosa ao roxo) na cor, devido às diferenças metabólicas na presença de cromógenos selecionado. Outras bactérias são inibido ou produzir colônias azul-esverdeada ou incolor.
Figura 2. Proporções de sobrevivência de camundongos infectados com Salmonella cepa mutante PhoP c, c PhoP Avra, e PhoP AvrA-/AvrA c +, c PhoP Avra durante 4 semanas (28 dias).
Tabela peso corporal 1. De camundongos infectados com Salmonella durante 4 semanas.
| 0 | 1 semana | 2 semanas | 3 semanas | 4 semanas | |
| controle | 16,78 ± 1,05 | 16,91 ± 1,28 | 18,26 ± 1,23 | 19,31 ± 1,26 | 20,26 ± 1,15 |
| PhoP c 16,89 ± 1,03 | 17,14 ± 1,19 | 17,43 ± 1,63 * | 18,68 ± 1,78 | 20,05 ± 1,11 | |
| PhoP c Avra- | 16,91 ± 1,12 | 16,96 ± 1,39 | 17,06 ± 2,14 ** | 18,71 ± 2,18 | 20,15 ± 1,56 |
| PhoP c + AvrA-/AvrA | 16,94 ± 0,96 | 17,17 ± 1,02 | 17,63 ± 1,42 * | 18,44 ± 2,03 | 20,09 ± 1,17 |
* Comparado ao grupo controle p <0,05
** Quando comparado ao grupo controle p <0,01
Tabela 2. Cepas de Salmonella utilizados neste estudo.
| Nome | Descrição | De referência ou fonte |
| Salmonella 14028s | Do tipo selvagem S. typhimurium | ATCC |
| PhoP c | Não-patogênicos complexo regulador mutante | Miller et al., 1990 |
| PhoP c Avra- | Avra mutação | Collier-Hyams et al., 2002 |
| PhoP c + AvrA-/AvrA | PhoP c Avra com Avra codificação complementada plasmídeo | Collier-Hyams et al., 2002 |
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Discussion
Para utilizar este sistema, é necessário que o pesquisador para aprender a gavagem os animais. Detalhamos uma metodologia para preparar a cultura bacteriana e gavagem a camundongos. Também mostramos como monitorar a persistência de Salmonella no trato gastrointestinal (TGI). Os passos críticos neste protocolo, incluindo:
- Estreptomicina pré-tratamento: Estreptomicina pré-tratamento, poderia se livrar de alguns comensais da flora intestinal e fazer os ratos suscetíveis à infecção por Salmonella 2.
- Salmonella gavage: para o iniciante, a sonda pode ser um desafio. Algum tempo, gavage falha porque a solução é acidentalmente injetado para as vias respiratórias e causa a morte do rato.
- Colonização bacteriana persistente: a necessidade de acompanhamento próximo bactérias no trato gastrointestinal. Além de cultura do mouse fecal, conteúdo de ceco também pode ser usado para a detecção de Salmonella em placas de CHROMagar BBL. Coletar o conteúdo ceco, quando os ratos são sacrificados após infecção por Salmonella.
Nós testamos a colonização de Salmonella em camundongos em diferentes concentrações: 1 x 10 3 unidades formadoras de colônias de 1 x 10 8 unidades formadoras de colônia (100 l / mouse). Menos 1 x 10 6 a 10 x 10 8 unidades formadoras de colônia, Salmonella foi capaz de colonizar os ratos. Portanto, com base em nossas publicações anteriores 1, 5 e dados não publicados, a concentração final de Salmonella em que esta solução não será medido antes de gavage.
Neste procedimento experimental, foi utilizado específicas-isentos de agentes patogénicos C57BL feminino / 6 camundongos (Taconic, Hudson, NY), que foram de 6-7 semanas de idade. Cepas bacterianas utilizadas incluem Salmonella typhimurium ATCC14028s tipo selvagem tensão (WT-SL), não-patogênico Salmonella cepa mutante PhoP c3, PhoP c Avra, e PhoP AvrA-/AvrA c +, c PhoP Avra (tabela 2). Usando este protocolo, Salmonella typhimurium colonização pode ser detectado no intestino do rato mais de 6 meses (fig. 1). Infecção por Salmonella e inflamação foram medidos através da observação matéria fecal e peso menino. Quando amostras de tecido e sangue foram coletadas, o comprimento do intestino foi medido como uma característica de inflamação intestinal. Os pesos de baço e fígado também foram examinados. Rato de citocinas no soro foram testadas por ELISA5. Métodos ainda mais, bioquímicos e moleculares são ainda usados para testar as alterações de citocinas inflamatórias e alterações patologia induzida por Salmonella 5.
Tipicamente, a perda de peso corporal e morte ocorrer dentro de 4 semanas após a infecção (Tabela 1). Pós infecção por Salmonella, houve perda significativa de peso corporal nos grupos de bactérias infectadas em comparação ao grupo controle sem tratamento bacteriana (* p <0,05 ou p <0,001 Tabela 1). O peso corporal foi medido semanalmente. As proporções de sobrevivência pós-infecção 4 semanas foram mostrado na figura. 2. No geral, 92% dos camundongos (n = 50) infectados com cepas de Salmonella PhoP c, 78% PhoP c Avra, ou 70% PhoP AvrA-/AvrA c + pode sobreviver com Salmonella persistente no intestino. Após a infecção aguda, todos os sobreviventes ainda carregava Salmonella, que pode ser detectada infecção pós 6 meses usando o método descrito na presente proposta. Uma vez que os ratos sobreviver três semanas após a infecção, os ratos ganharam peso corporal e menor morte ocorreu (Fig.2). Além disso, os dados também mostram coloração imunofluorescência a invasão da mucosa intestinal de Salmonella em 27 semanas após a infecção (Fig. 3). Estes dados mostraram que PhoP c, c PhoP Avra, ou PhoP AvrA-/AvrA c + pode ser usado para o modelo de infecção crônica.
Camundongos com fator de resistência a NRAMP1 + / + são resistentes à infecção por Salmonella 3-6. C57/BL6 camundongos com defeito foram Nramp utilização nos estudos atuais. Nós descobrimos que camundongos infectados com 90% patogênicos 14028s cepa Salmonella não pode sobreviver mais de 4 semanas (dados não mostrados). Para entender os efeitos a longo prazo do tipo selvagem infecção S. Typhimurium, camundongos com Nampr1 + / + poderia ser usado.
Este modelo é criado em um laboratório de NBS-2. Nosso protocolo é aprovado pela Universidade de Rochester University Comité de Recursos Animal (UCAR). Camundongos infectados com Salmonella são susceptíveis de sofrer desconforto e angústia e tornar-se menos ativa e movimentar-se lentamente. Sua pele pode-se irritado e eles não podem se alimentar ou beber normalmente. Os animais serão observados de perto e se qualquer sinal de desconforto, tais como incapaz de deambular bem o suficiente para manter a hidratação e ingestão calórica Se um rato mostrou indicação de que ela tinha aspirado líquido ou perda de peso significativa do corpo (10% ou mais) 7, e fez não morra imediatamente, o rato foi humanamente eutanasiados. Todo o pessoal de laboratório serão treinados emobservando os ratos adequadamente 8, 9.
Muitos estudos usaram o pré-tratamento estreptomicina-se aproveitaram da colite induzida por Salmonella typhimurium para os estudos sobre a fase inicial da infecção 1,2,10. No entanto, apenas poucas relatório sobre a infecção crônica no modelo de camundongo in vivo 11. Camundongos com existência persistente Salmonella no trato gastrointestinal nos permitem explorar a host-bacteriana interação a longo prazo, transdução de sinal, e tumorigênese. Nós estabelecemos um modelo de camundongo bacteriana crônica infectadas com Salmonella typhimurium colonização no intestino do rato mais de 6 meses. Este modelo pode também ser usado para E.coli patogênese e estudos de probióticos. Globalmente, este protocolo vai ajudar os pesquisadores utilizando o modelo de mouse para abordar questões de fundamental importância biológicos e microbiológicos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIDDK KO1 DK075386 subvenção ea Sociedade Americana do Câncer RSG-09-075-01-MBC para junho dom
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
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