Summary
एक पुरानी जीवाणु से संक्रमित माउस मॉडल लगातार स्थापित
Abstract
बैक्टीरिया संक्रमित माउस मॉडल संक्रमण, सूजन, इम्यूनोलॉजी, संकेत transduction, और tumorigenesis जैसे क्षेत्रों के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है. कई शोधकर्ताओं द्वारा प्रेरित बृहदांत्रशोथ का लाभ ले लिया है
Protocol
बैक्टीरियल संस्कृति, माउस gavage, और साल्मोनेला का पता लगाने: इस प्रोटोकॉल तीन भागों शामिल हैं.
1. साल्मोनेला विकास हालत.
- Luria Bertani शोरबा प्लेट (पौंड) साल्मोनेला, 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर सेते तैयार करें .
- लेग थाली से एक क्लोन उठाओ और 7 मिलीलीटर लेग में एक 12 मिलीलीटर की ट्यूब में डाल दिया, और 37 डिग्री के बारे में 5 घंटे के लिए सी हिला.
- एक स्थिर चरण संस्कृति और सेते 0.05 मिलीलीटर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस के बारे में 18 घंटे के लिए मिलाते हुए बिना 50 मिलीलीटर लेग टीका लगाना.
- 10 मिनट के लिए 6000 rpm के साथ कमरे के तापमान पर रातोंरात जीवाणु संस्कृति, स्पिन अनुपात 100:3 (लेग: HBSS) का उपयोग HBSS में बैक्टीरिया निलंबित. उदाहरण के लिए:
हर 50 मिलीलीटर लेग संस्कृति 1.5 मिलीलीटर HBSS में निलंबित कर दिया जाएगा. - जानवर gavage के लिए, आगे 1:10 के अनुपात में जीवाणु संस्कृति को कमजोर. उदाहरण के लिए:
हर 1.5 मिलीलीटर लेग संस्कृति 15 मिलीलीटर HBSS में निलंबित कर दिया जाएगा.
2. साल्मोनेला से संक्रमण मॉडल *.
- स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान तैयार करें. प्रत्येक माउस 100 μl HBSS में स्ट्रेप्टोमाइसिन के 7.5 मिलीग्राम दिया जाएगा. उदाहरण के लिए, 10 चूहों के लिए 1.2 मिलीलीटर HBSS में स्ट्रेप्टोमाइसिन की कुल 90 मिलीग्राम तैयार. हमेशा कुछ अतिरिक्त मात्रा है जब स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान की तैयारी.
- मौखिक gavage उपचार से पहले पानी और भोजन 4 घंटे वापस ले लें.
- स्ट्रेप्टोमाइसिन (नियंत्रण चूहों के लिए HBSS के 100 μl) का 7.5 मिलीग्राम के साथ स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ Gavage चूहों. अंगूठे और मध्यम उंगली के साथ मजबूती से पकड़ो माउस कंधे पर त्वचा, घेघा सीधे बनाने के लिए और तर्जनी के साथ सिर, गर्दन खिंचाव. सीधी गेंद मुँह की छत के साथ और ग्रसनी के पीछे के सही पक्ष की ओर खिला सुई की टिप है, तो धीरे से घेघा में नीचे से गुजारें और 100 μl समाधान इंजेक्षन. कोई प्रतिरोध नहीं महसूस होना चाहिए.
- स्ट्रेप्टोमाइसिन उपचार, पानी वापस ले लिया और फिर से पहले चूहों बैक्टीरिया से संक्रमित भोजन के बाद 20 घंटे में.
- 100 HBSS में μl निलंबन के साथ प्रत्येक माउस Gavage या मौखिक gavage द्वारा बाँझ HBSS (नियंत्रण) के साथ इलाज किया. gavage प्रक्रिया स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ उसी के रूप में 2.3) gavage चूहों है.
* पशु प्रयोगों विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त महिला C57BL / 6 (Taconic, हडसन, NY) चूहों कि 6-7 सप्ताह पुराने थे के रूप में पहले 1 में वर्णित का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया. प्रोटोकॉल रोचेस्टर विश्वविद्यालय समिति के पशु संसाधन (UCAR) पर विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था.
3. साल्मोनेला के आंत में जांच.
- माउस मल लीजिए (के बारे में 100 मिलीग्राम).
- 1ml पीबीएस और भंवर सख्ती के साथ एक 1.5 सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थानांतरण fecal नमूना.
- 800 rpm पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. एक साफ microfuge ट्यूब में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
- 5min के लिए 6000 rpm पर centrifugation. सतह पर तैरनेवाला त्याग और 200 μL पीबीएस छर्रों से जोड़ा जाता है और vortexed.
- स्ट्रीक बीबीएल CHROMagar साल्मोनेला का पता लगाने की थाली पर एक डिस्पोजेबल सेल स्प्रेडर के साथ 200 μl पीबीएस. साल्मोनेला प्रजातियों चमकीला गुलाबी रंग दिखाई देते हैं (बैंगनी करने के लिए गुलाब, Fig.1 देखें ). 200 μl पैदावार यदि थाली पर भी कई कालोनियों, 100 μl या लकीर के लिए 50 μl का उपयोग करें.
4. प्रतिनिधि परिणाम.
जब प्रोटोकॉल सही ढंग से किया है, साल्मोनेला उपनिवेशण 6 महीने से अधिक माउस आंत में पाया जा सकता है साल्मोनेला fecal संस्कृति से 6 महीने (Fig.1) में पाया जा सकता है है . के रूप में एक ठेठ बाहर इस मॉडल के आते हैं, शरीर के वजन घटाने और मृत्यु 4 सप्ताह के बाद संक्रमण के भीतर होते हैं. साल्मोनेला उपभेदों संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया पर निर्भर है, कुछ चूहों को 6 महीने से अधिक जीवित रह सकता है.
चित्रा 1 साल्मोनेला प्रजातियों में आंतों साल्मोनेला. चमकीला गुलाबी रंग दिखाई देते है (बैंगनी के लिए गुलाब) रंग में चयनित chromogens की उपस्थिति में चयापचय मतभेदों के कारण . अन्य बैक्टीरिया या नीले, हरे या बेरंग कालोनियों का उत्पादन हिचकते हैं.
चित्रा 2 साल्मोनेला उत्परिवर्ती तनाव PhoP ग, PhoP ग से संक्रमित चूहों की जीवन रक्षा के अनुपात AVRA, और PhoP ग AvrA-/AvrA + PhoP ग AVRA 4 सप्ताह (28 दिन) के लिए.
टेबल 1 4 हफ्तों के लिए साल्मोनेला से संक्रमित चूहों के शरीर का वजन.
| 0 | 1 सप्ताह | 2 सप्ताह पहले | 3 सप्ताह पहले | 4 सप्ताह | |
| नियंत्रण | 16.78 ± 1.05 | 16.91 ± 1.28 | 18.26 ± 1.23 | 19.31 ± 1.26 | 20.26 ± 1.15 |
| PhoP ग 16.89 ± 1.03 | 17.14 ± 1.19 | 17.43 1.63 ± * | 18.68 ± 1.78 | 20.05 ± 1.11 | |
| PhoP ग - AVRA | 16.91 ± 1.12 | 16.96 ± 1.39 | 17.06 2.14 ± ** | 18.71 ± 2.18 | 20.15 ± 1.56 |
| PhoP ग + AvrA-/AvrA | 16.94 ± 0.96 | 17.17 ± 1.02 | 17.63 1.42 ± * | 18.44 ± 2.03 | 20.09 ± 1.17 |
* समूह पी <0.05 नियंत्रण की तुलना में
** समूह पी <0.01 नियंत्रण की तुलना में
टेबल 2. साल्मोनेला उपभेदों इस अध्ययन में इस्तेमाल किया .
| नाम | विवरण | संदर्भ या स्रोत |
| साल्मोनेला 14028s | जंगली - प्रकार एस. साल्मोनेला | ATCC |
| PhoP ग | गैर रोगजनक जटिल उत्परिवर्ती नियामक | मिलर एट अल, 1990 |
| PhoP ग - AVRA | AVRA उत्परिवर्तन | खनक Hyams एट अल, 2002 |
| PhoP ग + AvrA-/AvrA | PhoP ग पूरित प्लाज्मिड एन्कोडिंग AVRA AVRA के साथ | खनक Hyams एट अल, 2002 |
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Discussion
इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए, यह जानने के लिए कैसे पशुओं gavage के लिए शोधकर्ता के लिए आवश्यक है. जीवाणु संस्कृति को तैयार है और gavage चूहों के लिए हम एक पद्धति के विस्तार. हम यह भी बताएंगे कि कैसे जठरांत्र संबंधी मार्ग (GI) में साल्मोनेला दृढ़ता की निगरानी के लिए . सहित इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम:
- स्ट्रेप्टोमाइसिन pretreatment: स्ट्रेप्टोमाइसिन - pretreatment कुछ खानेवाला आंत वनस्पति के छुटकारा और साल्मोनेला -2 संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील चूहों कर सकता है.
- साल्मोनेला gavage: शुरुआत के लिए, gavage चुनौतीपूर्ण हो सकता है. कुछ समय, gavage विफल रहता है क्योंकि गलती से airway के लिए समाधान अंतःक्षिप्त है और माउस की मौत का कारण बनता है.
- लगातार जीवाणु उपनिवेशण: बंद GI पथ में जीवाणु निगरानी की जरूरत है. माउस मल संस्कृति के अलावा, cecum की सामग्री भी BBL CHROMagar प्लेटों में साल्मोनेला का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Cecum सामग्री ले लीजिए जब चूहों साल्मोनेला संक्रमण के बाद बलिदान कर रहे हैं.
हम माउस में साल्मोनेला उपनिवेशण का परीक्षण किया है विभिन्न एकाग्रता में: 1 x 10 3 1 x 10 8 कॉलोनी के गठन इकाइयों (100 μl / माउस) इकाइयों कॉलोनी गठन. 1 से कम 10 x 6 से 10 x 10 8 कॉलोनी के गठन इकाइयों, साल्मोनेला करने के लिए चूहों का उपनिवेश स्थापित करने में सक्षम था. इसलिए, हमारे पिछले 1 प्रकाशनों, 5 और अप्रकाशित डेटा के आधार पर, इस समाधान में साल्मोनेला के अंतिम एकाग्रता gavage पहले नहीं किया जा मापा जाएगा .
इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया में, हम विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त महिला C57BL / 6 (Taconic, हडसन, NY) चूहों कि 6-7 सप्ताह पुराने थे इस्तेमाल किया. बैक्टीरियल इस्तेमाल किया उपभेदों जंगली प्रकार साल्मोनेला तनाव ATCC14028s (WT-एसएल) शामिल हैं, गैर रोगजनक साल्मोनेला उत्परिवर्ती तनाव PhoP C3, PhoP ग AVRA, और PhoP ग AvrA-/AvrA + PhoP ग AVRA (तालिका 2). इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, साल्मोनेला उपनिवेशण 6 महीने (Fig1) से अधिक माउस आंत में पाया जा सकता है साल्मोनेला संक्रमण और सूजन fecal मामला और लड़का वजन देख द्वारा मापा गया. जब ऊतकों के नमूनों और रक्त एकत्र किए गए थे, आंत की लंबाई आंतों की सूजन के एक फीचर के रूप में मापा गया था. spleens और यकृत का वजन भी जांच की गई. माउस सीरम cytokine ELISA5 द्वारा परीक्षण किया गया. इसके अलावा, जैव रासायनिक और आणविक विधियों आगे भड़काऊ cytokine परिवर्तन और 5 साल्मोनेला द्वारा प्रेरित विकृति परिवर्तन का परीक्षण किया जाता है .
आमतौर पर, शरीर के वजन घटाने और मृत्यु 4 सप्ताह पोस्ट संक्रमण (तालिका 1) के भीतर होते हैं. डाक साल्मोनेला संक्रमण, जीवाणु से संक्रमित समूहों में महत्वपूर्ण शरीर के वजन घटाने जीवाणु उपचार के बिना नियंत्रण समूह की तुलना में था (* पी <0.05 या पी <0.001 एक टेबल). शरीर के वजन साप्ताहिक मापा गया था. अस्तित्व अनुपात 4 सप्ताह के बाद संक्रमण चित्र में दिखाया गया है. 2. कुल मिलाकर, चूहों के 92% (n = 50) से संक्रमित साल्मोनेला उपभेदों PhoP ग, 78% PhoP ग AVRA, या 70% PhoP ग AvrA-/AvrA + आंत में लगातार साल्मोनेला के साथ जीवित रह सकते हैं . तीव्र संक्रमण के बाद, सभी बचे अभी भी साल्मोनेला किया जाता है, जो पोस्ट संक्रमण हो पाया जा सकता है 6 महीने इस प्रस्ताव में वर्णित विधि का उपयोग. एक बार जब चूहों 3 सप्ताह पोस्ट संक्रमण जीवित है, चूहों शरीर के वजन प्राप्त की और कम मौत हुई (Fig.2). इसके अलावा, immunofluroscence धुंधला डेटा भी आंत्र mucosa 27 सप्ताह के बाद संक्रमण (Fig.3) में साल्मोनेला के आक्रमण दिखा. इन आंकड़ों से पता चला है कि PhoP ग, ग PhoP AVRA -, या PhoP ग AvrA-/AvrA + जीर्ण संक्रमण मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
मेजबान प्रतिरोध Nramp1 कारक के साथ चूहे + / + साल्मोनेला संक्रमण 3-6 करने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं . Nramp साथ C57/BL6 चूहों दोषपूर्ण वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया गया. हमने पाया है कि 90% रोगजनक साल्मोनेला तनाव 14028s के साथ संक्रमित चूहों 4 सप्ताह (नहीं दिखाया डेटा है) से अधिक जीवित नहीं रह सकते. जंगली प्रकार एस typhimurium संक्रमण की लंबी अवधि के प्रभाव को समझने के लिए, Nampr1 के साथ चूहों + + / इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस मॉडल BSL-2 एक प्रयोगशाला में की स्थापना की है. हमारी प्रोटोकॉल रोचेस्टर विश्वविद्यालय समिति के पशु संसाधन (UCAR) पर विश्वविद्यालय द्वारा मंजूरी दे दी है. साल्मोनेला से संक्रमित चूहे को परेशानी और संकट ग्रस्त हैं और कम सक्रिय हो जाते हैं और चारों ओर धीरे धीरे कदम की संभावना है. उनकी फर झालरदार हो और वे फ़ीड या सामान्य रूप में नहीं पी सकते हो सकता है. जानवरों बारीकी से मनाया जाएगा और अगर इस तरह के रूप में असुविधा के किसी भी हस्ताक्षर अच्छी तरह से पर्याप्त ambulate जलयोजन और गरमी सेवन बनाए रखने यदि एक माउस संकेत है कि यह द्रव या महत्वपूर्ण शरीर के वजन हानि (10% या उससे अधिक) 7 से aspirated था दिखाया था और करने में असमर्थ मरने के तुरंत नहीं, माउस humanely euthanized किया गया था. सभी प्रयोगशाला कर्मियों में प्रशिक्षित किया जाएगाउचित चूहों 8, 9 को देख .
कई अध्ययनों का इस्तेमाल स्ट्रेप्टोमाइसिन pretreatment 1,2,10 संक्रमण के प्रारंभिक चरण में पर अध्ययन के लिए साल्मोनेला से प्रेरित बृहदांत्रशोथ के लाभ ले लिया है. हालांकि, केवल 11 vivo में माउस मॉडल में पुराने संक्रमण पर कुछ रिपोर्ट है . साल्मोनेला GI पथ में लगातार अस्तित्व के साथ चूहे हमें लंबी अवधि के मेजबान जीवाणु बातचीत, संकेत transduction, और tumorigenesis का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं . हम माउस आंत में 6 महीनों में साल्मोनेला typhimurium उपनिवेशण के साथ एक क्रोनिक बैक्टीरियल संक्रमित माउस मॉडल की स्थापना की है. यह मॉडल भी ई. कोलाई रोगजनन और प्रोबायोटिक्स अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल माउस मॉडल का उपयोग करने के लिए मूल रूप से महत्वपूर्ण जैविक और सूक्ष्मजीवविज्ञानी सवालों के पते के शोधकर्ताओं की सहायता करेगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम NIDDK KO1 DK075386 अनुदान और अमेरिकन कैंसर सोसायटी जून रवि RSG-09-075-01-अति पिछड़े वर्गों के के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
References
- Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
- Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
- Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
- Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
- Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
- Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
- Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
- Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).
- Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , Forthcoming (2010).
