Summary
Establecer un modelo de crónica bacteriana ratones infectados con el persistente
Abstract
El modelo de ratón infectado de bacterias es un sistema poderoso modelo para el estudio de áreas tales como infección, inflamación, la inmunología, la transducción de señales y tumorigénesis. Muchos investigadores han tomado ventaja de la colitis inducida por
Protocol
Este protocolo incluye tres partes: la detección de un cultivo bacteriano, una sonda de ratón, y Salmonella.
1. Salmonella condiciones de crecimiento.
- Prepare la Salmonella caldo Luria-Bertani (LB) placa, se incuba a 37 ° C durante la noche.
- Elige un clon de la placa de LB y puesto en LB 7 ml en un tubo de 12 ml y agitar a 37 º C durante 5 horas.
- Inocular 50 ml de LB con 0,05 ml de un cultivo en fase estacionaria y se incuba a 37 ° C sin agitación durante aproximadamente 18 horas.
- Giro cultivo bacteriano durante la noche a temperatura ambiente con 6000 rpm durante 10 minutos, suspender las bacterias en HBSS con relación 100:3 (LB: HBSS). Por ejemplo:
Cada cultura LB 50 ml se suspenderá en 1,5 ml HBSS. - Para la alimentación forzada de animales, diluir aún más el cultivo bacteriano en una proporción de 1:10. Por ejemplo:
Todas las culturas de 1,5 ml LB será suspendido en 15 ml HBSS.
2. Salmonella infección modelo *.
- Prepare la solución de estreptomicina. Cada ratón se le dará 7,5 mg de estreptomicina en 100 l HBSS. Por ejemplo, prepare un total de 90 mg de estreptomicina en 1,2 ml de HBSS 10 ratones. Siempre tienen algo de volumen extra en la preparación de la solución de estreptomicina.
- Retirar el agua y la comida 4 horas antes del tratamiento de una sonda nasogástrica.
- Ratones sonda con estreptomicina con 7,5 mg de estreptomicina (100 l de HBSS para los ratones de control). Coge la piel sobre el hombro del ratón firmemente con el pulgar y el dedo medio, estirar la cabeza y el cuello con el dedo índice para hacer que el esófago directamente. Dirigir el balón de punta de la aguja de alimentación a lo largo del techo de la boca y hacia el lado derecho de la parte posterior de la faringe, y luego suavemente pase hacia el esófago y se inyecta la solución de 100 l. No hay resistencia se debe sentir.
- A las 20 horas después del tratamiento con estreptomicina, el agua extraída y la comida de nuevo antes de los ratones infectados con la bacteria.
- Sonda cada ratón con 100 l de suspensión en HBSS o tratados con HBSS estéril (control) mediante una sonda nasogástrica. El procedimiento de alimentación forzada es lo mismo que 2.3) ratones sonda con estreptomicina.
* Experimentos con animales se realizaron mediante el uso de patógenos específicos libre C57BL mujeres / 6 ratones (Taconic, Hudson, Nueva York), que fueron 6-7 semanas de edad, como se describió anteriormente 1. El protocolo fue aprobado por la Universidad de la Universidad de Rochester Comité de Recursos Animales (UCAR).
3. La detección de Salmonella en el intestino.
- Recoger las heces de ratón (100 mg).
- Transferencia de la muestra fecal en un tubo de centrífuga de 1,5 micro con 1 ml de PBS y agitar vigorosamente.
- Centrifugar durante 10 minutos a 800 rpm. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.
- Centrifugación a 6000 rpm durante 5 minutos. Sobrenadante se descarta y 200 l de PBS se añade a los gránulos y vortex.
- La racha de 200 l de PBS con un esparcidor celular desechable en una placa BBL CHROMagar para detectar Salmonella. Especies de Salmonella aparecen de color malva (rosa a púrpura, ver figura 1). Si los rendimientos de 200 l colonias demasiados en la placa, utilice 100 l ó 50 l durante la racha.
4. Los resultados representativos.
Cuando el protocolo se hace correctamente, Salmonella typhimurium colonización se puede detectar en el intestino del ratón más de 6 meses. Salmonella pueden ser detectados por cultivo fecal más de 6 meses (Fig. 1). Como fuera típica vienen de este modelo, el cuerpo de pérdida de peso y la muerte ocurren dentro de las 4 semanas después de la infección. Depende de las cepas de Salmonella utilizados para la infección, algunos ratones no pueden sobrevivir más de 6 meses.
Figura 1. Salmonella Intestinal en la especie Salmonella aparecen de color malva (rosa a púrpura) en color, debido a las diferencias metabólicas en presencia de cromógenos seleccionado. Otras bacterias son inhibidas o producen colonias de color azul-verdoso o incoloro.
Figura 2. Proporciones de supervivencia de ratones infectados con Salmonella cepa mutante c PhoP, PhoP c Avra, y PhoP c AvrA-/AvrA +, c PhoP Avra durante 4 semanas (28 días).
Tabla 1. Peso corporal de los ratones infectados con Salmonella durante 4 semanas.
| 0 | 1 semana | 2 semanas | 3 semanas | 4 semanas | |
| control | 16,78 ± 1,05 | 16,91 ± 1,28 | 18,26 ± 1,23 | 19,31 ± 1,26 | 20,26 ± 1,15 |
| PhoP c 16,89 ± 1,03 | 17,14 ± 1,19 | 17,43 ± 1,63 * | 18,68 ± 1,78 | 20,05 ± 1,11 | |
| PhoP c Avra- | 16,91 ± 1,12 | 16,96 ± 1,39 | 17,06 ± 2,14 ** | 18,71 ± 2,18 | 20,15 ± 1,56 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | 16,94 ± 0,96 | 17,17 ± 1,02 | 17,63 ± 1,42 * | 18,44 ± 2,03 | 20,09 ± 1,17 |
* En comparación con el grupo control p <0,05
** En comparación con el grupo control p <0,01
Tabla 2. Cepas de Salmonella utilizada en este estudio.
| Nombre | Descripción | Referencia o fuente |
| Salmonella 14028s | De tipo salvaje S. typhimurium | ATCC |
| PhoP c | No patógenos mutantes regulador complejo | Miller et al., 1990 |
| PhoP c Avra- | Avra-mutación | Collier-Hyams et al., 2002 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | PhoP c Avra Avra complementa con plásmido que codifica | Collier-Hyams et al., 2002 |
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Discussion
Para utilizar este sistema, es necesario que el investigador que aprender a alimentación forzada de los animales. Se detalla una metodología para preparar un cultivo bacteriano y alimentación forzada de los ratones. También muestra cómo controlar la persistencia de Salmonella en el tracto gastrointestinal (GI). Los pasos críticos de este protocolo, incluyendo:
- Estreptomicina pretratamiento: estreptomicina pretratamiento podría deshacerse de algunos flora intestinal comensal y que los ratones susceptibles a la infección por Salmonella 2.
- Salmonella sonda: para el principiante, la sonda podría ser difícil. En algún momento, una sonda falla debido a que la solución se inyecta accidentalmente en las vías respiratorias y causa la muerte del ratón.
- Colonización bacteriana persistente: la necesidad de estrecha vigilancia bacterias en el tracto gastrointestinal. Además de la cultura del ratón fecal, el contenido de ciego también puede ser utilizado para la detección de Salmonella en las placas BBL CHROMagar. Recoge los contenidos ciego cuando los ratones son sacrificados después de la infección por Salmonella.
Hemos probado la colonización por Salmonella en el ratón en diferentes concentraciones: 1 x 10 3 unidades formadoras de colonias de 1 x 10 8 unidades formadoras de colonias (100 l / ratón). A 1 x 10 6 a 10 x 10 8 unidades formadoras de colonias, Salmonella fue capaz de colonizar los ratones. Por lo tanto, sobre la base de nuestras publicaciones anteriores 1, 5 y datos no publicados, la concentración final de Salmonella en esta solución no se medirá antes de sonda.
En este procedimiento experimental, se utilizó específicas libres de patógenos C57BL mujeres / 6 ratones (Taconic, Hudson, Nueva York), que fueron 6-7 semanas de edad. Cepas bacterianas utilizadas son Salmonella typhimurium de tipo salvaje ATCC14028s cepa (WT-SL), no patógena cepa mutante de Salmonella PhoP c3, c PhoP Avra, y PhoP c AvrA-/AvrA +, c PhoP Avra (tabla 2). El uso de este protocolo, la colonización de Salmonella typhimurium se puede detectar en el intestino del ratón más de 6 meses (Fig 1). Infección por Salmonella y la inflamación se midieron mediante la observación de la materia fecal y el peso de niño. Cuando las muestras de tejido y de sangre fueron recolectadas, la longitud del intestino se midió como una característica de la inflamación intestinal. Los pesos de bazo y el hígado también fueron examinados. Ratón de citoquinas séricas fueron analizadas por ELISA5. Otros métodos más, bioquímicos y moleculares son más utilizados para probar los cambios de citoquinas inflamatorias y cambios patología inducida por Salmonella 5.
Por lo general, pérdida de peso corporal y la muerte ocurren dentro de las 4 semanas después de la infección (Tabla 1). Después de la infección por Salmonella, se produjo una pérdida significativa del peso corporal en los grupos infectados por las bacterias en comparación con el grupo de control sin tratamiento bacteriano (* p <0,05 o p <0,001 Tabla 1). El peso corporal se midió semanalmente. Las proporciones de supervivencia a 4 semanas después de la infección se muestra en la figura. 2. En general, el 92% de los ratones (n = 50) infectados con cepas de Salmonella c PhoP, el 78% PhoP c Avra-, o el 70% PhoP c + AvrA-/AvrA puede sobrevivir con Salmonella persistente en el intestino. Después de la infección aguda, todos los sobrevivientes todavía lleva a Salmonella, que pueden ser detectados después de la infección de 6 meses usando el método descrito en esta propuesta. Una vez que los ratones sobreviven después de la infección 3 semanas, los ratones aumentaron de peso corporal y la muerte se produjo menos (Fig. 2). Además, los datos también muestran manchas immunofluroscence la invasión de la mucosa intestinal de Salmonella en 27 semanas después de la infección (Fig. 3). Estos datos demostraron que PhoP c, c PhoP Avra, o PhoP c AvrA-/AvrA + puede ser utilizado para el modelo de infección crónica.
Los ratones con el factor de resistencia a la sede Nramp1 + / + son resistentes a la infección por Salmonella 3-6. C57/BL6 ratones con NRAMP defectuoso se utilizan en los estudios actuales. Encontramos que los ratones infectados con el 90% 14028s cepa patógena Salmonella no puede sobrevivir más de 4 semanas (datos no mostrados). Para comprender los efectos a largo plazo de tipo salvaje infección por S. typhimurium, los ratones con Nampr1 + / + se podría utilizar.
Este modelo se ha establecido en un laboratorio BSL-2. El protocolo ha sido aprobado por la Universidad de la Universidad de Rochester Comité de Recursos Animales (UCAR). Los ratones infectados con Salmonella son propensos a sufrir malestar e incomodidad y se vuelven menos activas y se mueven lentamente. Su piel puede llegar a ser volantes y que no pueden alimentar o beber con normalidad. Los animales serán observados de cerca y si cualquier signo de malestar, como no puede deambular lo suficientemente bien como para mantener la hidratación y la ingesta calórica Si un ratón mostraron indicios de que había aspirado líquido o la pérdida significativa del peso corporal (10% o más) 7, y lo hizo no mueren de inmediato, el ratón fue sacrificado humanamente. Todo el personal de laboratorio serán capacitados enla observación de los ratones adecuada 8, 9.
Muchos estudios utilizan la estreptomicina, el pretratamiento se han aprovechado de la colitis inducida por Salmonella typhimurium en los estudios en la fase temprana de la infección 1,2,10. Sin embargo, sólo unos pocos informes sobre la infección crónica en el modelo de ratón in vivo 11. Los ratones con Salmonella existencia persistente en el tracto gastrointestinal nos permiten explorar el anfitrión-bacterial interacción a largo plazo, la transducción de señales y tumorigénesis. Hemos establecido un modelo de crónica bacteriana ratón infectado con la colonización de Salmonella typhimurium en el intestino del ratón más de 6 meses. Este modelo también puede ser utilizado para la patogénesis de E. coli y los estudios de los probióticos. En términos generales, este protocolo ayudará a los investigadores que utilizan el modelo de ratón para hacer frente a cuestiones biológicas y microbiológicas de fundamental importancia.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIDDK KO1 DK075386 subvención y la Sociedad Americana del Cáncer RSG-09-075-01-MBC de junio dom
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
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