Summary
Kalıcı kronik bakteriyel enfekte fare modelinin oluşturulması
Abstract
Bakteri enfekte fare modelinde, enfeksiyon, enflamasyon, immünoloji, sinyal iletimi, ve tümörogenez gibi alanlarda çalışmak için güçlü bir model sistem. Birçok araştırmacı tarafından uyarılan kolit avantajı almış
Protocol
Bakteri kültürü, fare sonda ve Salmonella tespiti: Bu protokol, üç porsiyon içerir .
1. Salmonella büyüme durumdur.
- ° C gecede 37 inkübe Salmonella Luria Bertani suyu (LB) plaka hazırlayın.
- LB plaka seçin ve bir klon, 7 ml LB, 12 ml tüp içine koyun ve 37 ° C'de yaklaşık 5 saat boyunca sallamak.
- 37 ° C'de yaklaşık 18 saat sallayarak olmadan sabit bir faz kültür ve inkübe 0.05 ml, 50 ml LB inoküle edin.
- HBSS bakteri oranı 100:3 (HBSS LB) kullanarak askıya alma, 10 dakika boyunca 6000 rpm ile oda sıcaklığında bir gecede bakteri kültürü dönerler. Örneğin:
Her 50 ml LB kültür, 1.5 ml HBSS askıya alınacaktır. - Hayvan gavaj için 1:10 oranında daha fazla bakteri kültürü sulandırmak. Örneğin:
Her 1.5 ml LB kültür 15 ml HBSS askıya alınacaktır.
2. Salmonella enfeksiyonu modeli *.
- Streptomisin çözüm hazırlayın. Her fare 100 ul HBSS 7.5 mg streptomisin verilecektir. Örneğin, 10 fareler için 1.2 ml HBSS toplam 90 mg streptomisin hazırlamak. Streptomisin çözümü hazırlarken her zaman bazı ekstra hacim var.
- 4 saat ağızdan sonda ile tedavi öncesi su ve yiyecek çekin.
- Streptomisin (100 kontrol fareler için HBSS ul), 7.5 mg streptomisin ile sonda fareler. Işaret parmağı ile baş ve boyun, yemek borusu düz yapmak için streç, fare omzunun üzerinden cilt başparmak ve orta parmağı ile sıkıca tut. Doğrudan çatı boyunca ağız ve yutak arka sağ tarafına doğru beslenme iğne ucu top, sonra yavaşça aşağı özofagus içine geçmesi ve 100 ul çözüm enjekte. Direnç hissedilir olmalıdır.
- Streptomisin tedavisi, çekilen su ve bakteriler ile enfekte fareler daha önce yemek sonra 20 saat.
- HBSS 100 ul süspansiyon her fare sonda veya ağızdan sonda ile steril HBSS (kontrol) ile tedavi. Gavaj prosedür streptomisin ile aynı) 2.3 sonda fareler.
* Hayvan deneyleri, özel-patojen-free kadın C57BL / 6 farelerin önceden 1'de açıklandığı gibi, 6-7 hafta eski (Taconic, Hudson, NY) ile yapıldı . Protokol Hayvan Kaynakları (UÇAR) University of Rochester Üniversitesi Komitesi tarafından onaylandı.
3. Bağırsak Salmonella tespiti.
- (Yaklaşık 100 mg), fare fekal toplayın.
- Fekal örnek şiddetle 1ml PBS ve vorteks ile 1.5 mikro santrifüj tüpüne aktarın.
- 800 rpm'de 10 dakika santrifüj. Süpernatant temiz bir mikrofuge'de boru içine aktarın.
- 5min için 6000 rpm santrifüj. Süpernatant atılır ve 200 mcL PBS pelet eklendi ve vortekslenmiş.
- Salmonella tespit etmek için bir BBL CHROMagar plaka üzerinde bir tek hücre dağıtıcısı Streak 200 ul PBS Salmonella (mor gül, Şekil 1) leylak rengi görünür. 200 ul verim Eğer plaka üzerinde bir çok koloniler, 100 ul veya çizgi için 50 ul kullanın.
4. Temsilcisi Sonuçlar.
Protokol doğru yapıldığında, Salmonella typhimurium kolonizasyon 6 ay içinde farenin bağırsak tespit edilebilir. Salmonella 6 ay (Şekil 1) üzerine dışkı kültürü ile tespit edilebilir. Tipik bir çıkış bu model gelir kaybı ve ölüm gibi, vücut 4 hafta enfeksiyonu içinde meydana gelen tartın. Salmonella enfeksiyonu için kullanılan bağlı olarak, bazı fareler hiçbir 6 ay içinde yaşayabilir.
Şekil 1. Bağırsak Salmonella Salmonella seçilen kromojenler varlığı metabolik farklılıklar nedeniyle, renk (mor gül) leylak rengi görünür. Diğer bakteri ya inhibe veya mavi-yeşil renkli veya renksiz koloniler oluşturur.
Şekil 2. Salmonella mutant suşu PhoP c, PhoP c ile enfekte farelerde Survival oranlarda Avra-ve PhoP c AvrA-/AvrA + 4 hafta (28 gün) PhoP c Avra.
Tablo 1: 4 hafta boyunca Salmonella ile enfekte farelerde vücut ağırlığı.
| 0 | 1 hafta | 2 hafta | 3 hafta | 4 hafta | |
| kontrol | 16.78 ± 1.05 | 16,91 ± 1,28 | 18,26 ± 1,23 | 19.31 ± 1.26 | 20,26 ± 1,15 |
| PhoP c 16.89 ± 1.03 | 17.14 ± 1.19 | 17.43 ± 1.63 * | 18.68 ± 1.78 | 20.05 ± 1.11 | |
| PhoP c Avra- | 16,91 ± 1.12 | 16.96 ± 1.39 | 17.06 ± 2.14 ** | 18.71 ± 2.18 | 20.15 ± 1.56 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | 16,94 ± 0,96 | 17.17 ± 1.02 | 17.63 ± 1.42 * | 18,44 ± 2.03 | 20.09 ± 1.17 |
* Grup p <0.05 kontrol etmek için karşılaştırıldığında
** Grup p <0.01 kontrol ile karşılaştırıldığında
Tablo 2'de bu çalışmada kullanılan Salmonella.
| Isim | Tanım | Referans veya kaynak |
| Salmonella 14028s | Wild-tip S. typhimurium | ATCC |
| PhoP c | Mutant patojen olmayan karmaşık regülatörü | Miller ve ark, 1990 |
| PhoP c Avra- | Avra-mutasyon | Collier-Hyams ve ark, 2002 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | PhoP c tamamlanmaktadır plazmid kodlama Avra Avra- | Collier-Hyams ve ark, 2002 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIDDK KO1 DK075386 hibe ve Amerikan Kanser Derneği Haziran Sun RSG-09-075-01-MBC tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
References
- Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
- Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
- Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
- Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
- Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
- Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
- Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
- Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).
- Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , Forthcoming (2010).
