Summary
Établir un modèle de chroniques bactériennes de souris infectées par la persistance
Abstract
Le modèle de souris infectées par des bactéries est un système puissant modèle pour étudier des domaines tels que l'infection, l'inflammation, l'immunologie, la transduction du signal, et la tumorigenèse. De nombreux chercheurs ont tiré parti de la colite induite par
Protocol
Ce protocole comprend trois parties: la détection de culture bactérienne, gavage chez la souris, et la salmonelle.
1. Condition de la croissance de Salmonella.
- Préparer la Salmonella bouillon Luria-Bertani (LB) plaque, incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- Choisissez un clone de la plaque de LB et mis en 7 LB ml dans un tube de 12 ml et agiter à 37 ° C pendant environ 5 heures.
- Inoculer 50 ml LB avec 0,05 ml d'une culture en phase stationnaire et incuber à 37 ° C sans agitation pendant environ 18 heures.
- Spin nuit culture bactérienne à la température ambiante à 6000 rpm pendant 10 minutes, de suspendre les bactéries dans HBSS utilisant 100:3 ratio (LB: HBSS). Par exemple:
Chaque culture LB 50 ml sera suspendu dans 1,5 ml de HBSS. - Pour le gavage des animaux, diluer la culture bactérienne au ratio de 01:10. Par exemple:
Chaque culture de 1,5 ml LB sera suspendu dans 15 ml de HBSS.
2. Salmonella-infection modèle *.
- Préparer la solution de streptomycine. Chaque souris sera donné 7,5 mg de streptomycine dans 100 ul de HBSS. Par exemple, préparer au total 90 mg de streptomycine dans 1,2 ml de HBSS pour les 10 souris. Toujours avoir un peu de volume supplémentaire lors de la préparation de la solution de streptomycine.
- Retirer de l'eau et de nourriture 4 heures avant le traitement par gavage oral.
- Gavage des souris avec de la streptomycine avec 7,5 mg de streptomycine (100 pi de HBSS pour les souris témoins). Prenez la peau sur l'épaule de la souris fermement avec le pouce et le majeur, étirer la tête et du cou avec l'index pour faire l'œsophage droite. Diriger la balle à pointe de l'aiguille d'alimentation sur le toit de la bouche et vers le côté droit du dos du pharynx, puis doucement descendre dans l'œsophage et injecter la solution 100 ul. Aucune résistance devrait se faire sentir.
- À 20 heures après le traitement à la streptomycine, l'eau prélevée et de la nourriture à nouveau avant que les souris sont infectées par des bactéries.
- Gavage chaque souris avec 100 ul de suspension dans HBSS ou traitées avec du HBSS stérile (contrôle) par gavage oral. La procédure de gavage est le même que 2,3) gavage des souris avec de la streptomycine.
Les expérimentations animales ont été réalisées par * à l'aide pathogènes spécifiques sans C57BL / 6 femelles souris (Taconic, Hudson, NY), qui étaient vieilles de 6-7 semaines, comme décrit précédemment 1. Le protocole a été approuvé par l'Université de Rochester University Comité des Ressources Animales (UCAR).
3. Détection des salmonelles dans l'intestin.
- Recueillir la souris fécales (environ 100 mg).
- Transférer l'échantillon fécal à un tube de 1,5 centrifugeuse micro avec 1ml de PBS et vortexer vigoureusement.
- Centrifuger pendant 10 min à 800 rpm. Transférer le surnageant dans un tube de centrifugeuse propre.
- Centrifugation à 6000 rpm pendant 5 min. Surnageant est jeté et 200 ul de PBS est ajouté aux pastilles et vortexés.
- Streak le PBS 200 pi avec un épandeur portable jetable sur une plaque BBL CHROMagar pour détecter la bactérie Salmonella. Salmonella apparaissent mauves (rose au violet, voir Fig.1). Si 200 ul rendements trop nombreuses colonies sur la plaque, utiliser 100 ul ou 50 ul de la série.
4. Des résultats représentatifs.
Lorsque le protocole est fait correctement, Salmonella typhimurium colonisation ne peut être détecté dans l'intestin de la souris sur 6 mois. Salmonella pourrait être détectée par la culture fécale plus de 6 mois (Fig.1). Comme une des caractéristiques viennent de ce modèle, le corps la perte de poids et les décès surviennent dans les 4 semaines après l'infection. Dépendant du souches de Salmonella utilisés pour l'infection, certaines souris peuvent pas survivre plus de 6 mois.
Figure 1. Salmonella intestinales chez les espèces de Salmonella apparaissent mauves (rose au violet) en couleur, en raison de différences métaboliques, en présence de chromogènes sélectionné. D'autres bactéries sont soit inhibé ou produire des colonies bleu-vert ou incolore.
Figure 2. Proportions de survie de souris infectées par la bactérie souche mutante PhoP c, c PhoP Avra-et PhoP c AvrA-/AvrA +, c PhoP Avra pendant 4 semaines (28 jours).
Le poids corporel Tableau 1. De souris infectées par des salmonelles pendant 4 semaines.
| 0 | 1 semaine | 2 semaines | 3 semaines | 4 semaines | |
| le contrôle | 16,78 ± 1,05 | 16,91 ± 1,28 | 18,26 ± 1,23 | 19,31 ± 1,26 | 20,26 ± 1,15 |
| PhoP c 16,89 ± 1,03 | 17,14 ± 1,19 | 17,43 ± 1,63 * | 18,68 ± 1,78 | 20,05 ± 1,11 | |
| PhoP c Avra- | 16,91 ± 1,12 | 16,96 ± 1,39 | 17,06 ± 2,14 ** | 18,71 ± 2,18 | 20,15 ± 1,56 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | 16,94 ± 0,96 | 17,17 ± 1,02 | 17,63 ± 1,42 * | 18,44 ± 2,03 | 20,09 ± 1,17 |
* Par rapport au groupe contrôle p <0,05
** Par rapport au groupe témoin p <0,01
Tableau 2. Souches de Salmonella utilisé dans cette étude.
| Nom | Descriptif | Référence ou source |
| Salmonella 14028s | Wild-type S. typhimurium | ATCC |
| PhoP c | Non-pathogènes régulateur complexe mutant | Miller et al., 1990 |
| PhoP c Avra- | Avra-mutation | Collier-Hyams et al., 2002 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | PhoP c Avra-avec Avra encodage complété plasmidique | Collier-Hyams et al., 2002 |
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Discussion
Pour utiliser ce système, il est nécessaire pour le chercheur d'apprendre à gavage des animaux. Nous détaillons une méthode pour préparer une culture bactérienne et gavage des souris. Nous montrons aussi comment contrôler la persistance de Salmonella dans le tractus gastro-intestinal (GI). Les étapes essentielles de ce protocole, y compris:
- Streptomycine prétraitement: streptomycine prétraitement pourrait se débarrasser de certains flore intestinale commensale et de faire des souris sensibles à l'infection à Salmonella 2.
- Salmonella gavage: pour les débutants, le gavage pouvait être difficile. Parfois, gavage échoue parce que la solution est accidentellement injecté pour les voies respiratoires et provoque la mort de la souris.
- Persistants colonisation bactérienne: les bactéries ont besoin à proximité de surveillance dans le tractus gastro-intestinal. En plus de la culture de la souris fécale, le contenu du caecum peut également être utilisé pour la détection de Salmonella dans des plaques CHROMagar BBL. Recueillir le contenu du caecum lorsque les souris sont sacrifiées après infection par Salmonella.
Nous avons testé la colonisation par Salmonella chez la souris à une concentration différente: 1 x 10 3 unités formant colonie à 1 x 10 8 unités formant colonie (100 pi / souris). A 1 x 10 6 à 10 x 10 8 unités formant colonie, Salmonella a été capable de coloniser la souris. Par conséquent, basé sur nos publications antérieures 1, 5 et les données non publiées, la concentration finale de Salmonella dans cette solution ne sera pas mesuré avant gavage.
Dans cette procédure expérimentale, nous avons utilisé pathogènes spécifiques sans C57BL / 6 femelles souris (Taconic, Hudson, NY), qui étaient vieilles de 6-7 semaines. Les souches bactériennes utilisées sont Salmonella typhimurium ATCC14028s souche de type sauvage (WT-SL), non pathogène Salmonella souche mutante PhoP c3, c PhoP Avra-et PhoP c AvrA-/AvrA +, c PhoP Avra (tableau 2). En utilisant ce protocole, la colonisation de Salmonella typhimurium peut être détecté dans l'intestin de la souris sur 6 mois (Fig1). Infection à Salmonella et l'inflammation ont été mesurés en observant la matière fécale et le poids garçon. Lorsque des échantillons de tissus et de sang ont été collectées, la longueur de l'intestin a été mesurée comme une caractéristique de l'inflammation intestinale. Le poids de la rate et du foie ont également été examinés. Sérum de souris de cytokines ont été testés par ELISA5. D'autres méthodes plus biochimiques et moléculaires sont encore utilisés pour tester les changements de cytokines inflammatoires et des changements de pathologie induite par Salmonella 5.
Typiquement, une perte de poids et les décès surviennent dans les 4 semaines après l'infection (tableau 1). Infection à Salmonella Post, il ya eu une perte significative de poids corporel dans les groupes de bactéries infectées par rapport au groupe contrôle sans traitement bactérien (* p <0,05 ou p <0,001 Tableau 1). Le poids corporel a été mesuré chaque semaine. Les proportions de survie 4 semaines après l'infection ont été montrés dans la Fig. 2. Globalement, 92% des souris (n = 50) infectés par Salmonella souches c PhoP, 78% PhoP c Avra-, soit 70% PhoP c AvrA-/AvrA + Salmonella peut survivre avec persistance dans l'intestin. Après l'infection aiguë, tous les survivants portait encore la salmonelle, qui pourrait être détectée après l'infection 6 mois selon la méthode décrite dans cette proposition. Une fois que les souris survivent 3 semaines après l'infection, les souris ont pris du poids du corps et moins de décès survenus (Fig.2). Par ailleurs, les données montrent également immunofluroscence coloration de l'invasion de Salmonella dans la muqueuse intestinale 27 semaines après l'infection (Fig.3). Ces données ont montré que PhoP c, c PhoP Avra-, ou PhoP c AvrA-/AvrA + peut être utilisé pour le modèle de l'infection chronique.
Souris avec un facteur de résistance de l'hôte Nramp1 + / + sont résistantes à l'infection à Salmonella 3-6. C57/BL6 souris avec Nramp défectueux ont été utilisé dans les études actuelles. Nous avons constaté que les souris infectées avec 90% 14028s souche pathogène Salmonella ne peut pas survivre plus de 4 semaines (données non présentées). Pour comprendre les effets à long terme de type sauvage infection à S. Typhimurium, souris avec Nampr1 + / + peuvent être utilisés.
Ce modèle est établi dans un laboratoire BSL-2. Notre protocole est approuvé par l'Université de Rochester University Comité des Ressources Animales (UCAR). Les souris infectées par la bactérie Salmonelle sont susceptibles de souffrir de l'inconfort et la détresse et à devenir moins actifs et de se déplacer lentement. Leur fourrure peut devenir ébouriffé et ils ne peuvent pas nourrir ou de boire comme d'habitude. Les animaux seront observés de près, et si aucun signe d'inconfort comme incapable de déambuler assez bien pour maintenir l'hydratation et l'apport calorique Si une souris a montré indication qu'il avait aspiré fluide ou une perte significative de poids corporel (10% ou plus) 7, et ne ne meurent pas immédiatement, la souris a été euthanasiés. Tout le personnel de laboratoire sera formé àobservant les souris convenablement 8, 9.
Des études ont utilisé la streptomycine prétraitement ont profité de la colite induite par Salmonella typhimurium pour les études sur la phase précoce de l'infection 1,2,10. Cependant, seuls quelques Rapport sur l'infection chronique dans le modèle de souris in vivo 11. Souris avec l'existence persistante Salmonella dans le tube digestif nous permettra d'explorer la relation hôte-bactérienne à long terme d'interaction, la transduction du signal, et la tumorigenèse. Nous avons établi un modèle de chroniques bactériennes de souris infectées avec la colonisation de Salmonella typhimurium dans l'intestin de la souris sur 6 mois. Ce modèle peut également être utilisé pour la pathogenèse de E. coli et les études de probiotiques. Globalement, ce protocole aidera les chercheurs utilisant le modèle de souris pour l'adresse d'une importance fondamentale des questions biologiques et microbiologiques.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIDDK KO1 DK075386 subvention et l'American Cancer Society RSG-09-075-01-MBC à juin dim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
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