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Neuroscience

Amyloid β प्रोटीन, अल्जाइमर रोग की प्रेरणा का एजेंट के लिए Aptamers का चयन

Published: May 13, 2010 doi: 10.3791/1955
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Brain Research Institute, University of California, Los Angeles

Summary

Aptamers कम ribo-/deoxyribo-oligonucleotides द्वारा चयनित कर रहे हैं

Protocol

भाग 1: प्रोटीन तैयार करने और पार से जोड़ने

प्रारंभ में, SELEX के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन 1,1,1,3,3,3 - hexafluoro-2-propanol (HFIP) के साथ pretreated सजातीय, कुल मुक्त तैयारी, के रूप में 23 पहले से वर्णित प्राप्त है . यह कदम आवश्यक है क्योंकि पूर्व गठित समुच्चय amyloidogenic प्रोटीन की तेजी से प्रेरित एकत्रीकरण, गरीब प्रयोगात्मक reproducibility के 24 में जिसके परिणामस्वरूप, और aptamers unaggregated, प्रोटीन की गैर तंतुमय रूपों के लिए चयन के लिए अवांछनीय हैं.

  1. ~ 800 (~ 180 nmol) μg शुद्ध Aβ40 Microbalance का उपयोग कर वजन. सूखी lyophilized पेप्टाइड, सिलिकॉन लेपित, कम adsorbent 1.6 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों लेबल में स्थानांतरण.
  2. 100% में पेप्टाइड भंग (HFIP, 400 μl) 1,1,1,3,3,3 hexafluoro-2-propanol के रूप में 0.5 मिमी पेप्टाइड समाधान प्राप्त करने के पहले 23 में वर्णित है.
  3. इस समाधान को चार 100 μl ऐसी है कि प्रत्येक ट्यूब ~ 45 Aβ40 नाममात्र nmol शामिल aliquots में फूट डालो. HFIP को हटाने के लिए आगे बढ़ें के रूप में पहले 23 में वर्णित है.
  4. पार से जोड़ने प्रतिक्रियाओं के लिए बफर में HFIP इलाज पेप्टाइड्स solubilizing से पहले, पार से जोड़ने और शमन अभिकर्मकों तैयार करते हैं. अमोनियम persulfate वजन (ए पी एस, 228.2 मेगावाट छ / mol) और 10 मिमी सोडियम फास्फेट, 7.4 पीएच में 40 मिमी की एक समाधान तैयार है. एक भंवर का उपयोग मिक्स जब तक समाधान स्पष्ट है.
  5. 10 मिमी सोडियम फास्फेट, 7.4 पीएच में Tris के 2 मिमी समाधान (2,2 bipyridyl) dichlororuthenium hexahydrate (द्वितीय) (RuBpy, 748.63 मेगावाट छ / mol) तैयार करें. एक भंवर का उपयोग मिक्स और पूरा विघटन की पुष्टि. एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से ट्यूब को सुरक्षित रखें.
  6. शमन अभिकर्मक तैयार. Dithiothreitol (डीटीटी, 154.5 मेगावाट छ / mol) वजन और विआयनीकृत जल में या 1 एम. के लिए 10 मिमी सोडियम फास्फेट, 7.4 पीएच में भंग
  7. HFIP - इलाज बिल्कुल के रूप में 23,25 पहले से वर्णित है, लेकिन ~ 60 सुक्ष्ममापी पेप्टाइड समाधान प्राप्त करने के उद्देश्य पेप्टाइड भंग.
  8. प्रदर्शन पीआईसीयूपी Aβ40 oligomeric के मिश्रण के रूप में पहले 23 में वर्णित उत्पन्न. एक ठेठ पीआईसीयूपी प्रतिक्रिया 20 μl जहां प्रोटीन, RuBpy, और ए पी एस के अंतिम सांद्रता 30 सुक्ष्ममापी, 0.05 मिमी, और 1 मिमी, 23 क्रमशः रहे हैं की एक मात्रा में किया जाता है. यहाँ, पीआईसीयूपी के लिए इस्तेमाल किया मिश्रण 108 μl प्रोटीन, 6 μl RuBpy, 6 μl ए पी एस, और 1 μl डीटीटी और प्रोटीन की एकाग्रता, RuBpy, और ए पी एस सब ठेठ प्रतिक्रिया के सापेक्ष दोगुनी कर रहे हैं. यह पीआईसीयूपी प्रदर्शन किया जा प्रतिक्रियाओं की संख्या कम कर देता है और desalting के लिए प्रोटीन एकाग्रता बढ़ जाती है.

भाग 2: प्रोटीन तैयारी Desalting

SELEX के लिए प्रोटीन का उपयोग करने से पहले, desalting पार से जोड़ने पीआईसीयूपी के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों निकालने के लिए किया जाता है. यह पीआईसीयूपी प्रतिक्रिया मिश्रण पार से जोड़ने अभिकर्मकों और ~ 55 सुक्ष्ममापी प्रोटीन (नाममात्र एकाग्रता) शामिल हैं.

  1. बंद desalting 5 मिलीलीटर स्तंभ शीर्ष टोपी निकालें, एक स्टैंड द्वारा स्तंभ समर्थन, स्तंभ आउटलेट के नीचे एक बीकर जगह है, और आउटलेट प्लग निकाल. के माध्यम से भंडारण बफर प्रवाह चलो और बीकर में इकट्ठा.
  2. 10 मिमी अमोनियम एसीटेट, 8.3 पीएच में स्तंभ संतुलित करना. इस बफर के 3 मिलीलीटर aliquots में 5 राल बिस्तर मात्रा (25 मिलीलीटर) स्तंभ जोड़ें के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं.
  3. इस बीच, लेबल 8 कम adsorbent, सिलिकॉन लेपित 1.6 मिलीलीटर ट्यूब और एक ट्यूब रैक में उन्हें जगह.
  4. बाद स्तंभ equilibrated है, एकल desalting उपयोग के प्रति प्रति स्तंभ पीआईसीयूपी प्रतिक्रिया मिश्रण का एक 0.5-0.7 मिलीलीटर विभाज्य लागू (स्तंभों, धोया जा सकता है संग्रहित, और बाद में उपयोग के लिए equilibrated). प्रोटीन मिश्रण स्तंभ राल में सोख करने के लिए और बीकर में प्रवाह के माध्यम से त्यागने की अनुमति दें.
  5. स्तंभ आउटलेट के नीचे की पहली संग्रह ट्यूब रखें. स्तंभ के लिए 0.5 मिलीलीटर एसीटेट बफर जोड़ें और पहली 0.5 मिलीलीटर के माध्यम से बह अंश इकट्ठा.
  6. 2.4 और 2.5 चरणों को दोहराएँ, और इसी ट्यूबों में आठ 0.5 मिलीलीटर भिन्न करने के लिए इकट्ठा.
  7. संख्या 8 कम adsorbent, सिलिकॉन लेपित छोटे 0.6 मिलीलीटर ट्यूबों के एक सेट और एक रैक में उन्हें जगह. के रूप में एक और ट्यूब लेबल "रिक्त है." लेबल 0.6 मिलीलीटर ट्यूबों में प्रत्येक अंश और हस्तांतरण के 150 μl लो. एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए 20 μl का प्रयोग करें (चित्रा 1) के रूप में 23 पहले दिखाया गया.
  8. खाली ट्यूब में 150 μl 10 मिमी अमोनियम एसीटेट, 8.3 पीएच, स्थानांतरण. इस ट्यूब प्रयोग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रिक्त सेट.
  9. एक क्वार्ट्ज क्युवेट में λ = 280 एनएम पर प्रत्येक अंश के 130 μl में absorbance के उपाय.
  10. Absorbance के बाद मापा जाता है, उच्चतम प्रोटीन सामग्री (आमतौर पर 3-5 भिन्न) के साथ भिन्न गठबंधन है, धीरे से एक विंदुक का उपयोग मिश्रण, और एमिनो एसिड के विश्लेषण के लिए एक 10 μl विभाज्य रखने के लिए वास्तविक प्रोटीन एकाग्रता (नहीं दिखाया गया है) निर्धारित है.
  11. ~ 2 ट्यूब प्रति nmol प्रोटीन के कई aliquots में नमूना फूट डालो और lyophilizer में नमूने lyophilize.
  12. Lyophilization के पूरा होने के बाद, 100% HFIP के साथ पहले के रूप में नमूने का इलाज.
  13. -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब स्टोर प्रत्येक SELEX चक्र के लिए एक ट्यूब का उपयोग करें (नीचे).

भाग 3: सिंथेटिक पीसीआर द्वारा यादृच्छिक ssDNA पुस्तकालय का प्रवर्धन

सिंथेटिक ssDNA SELEX के लिए यहां इस्तेमाल किया पुस्तकालय 49 यादृच्छिक nucleotides (टी: जी: एक सी = 25:25:25:25%) के रूप में निरंतर क्लोनिंग (हाई बैम, पारिस्थितिकी आरआई) साइटों और एक T7 प्रमोटर शामिल क्षेत्रों द्वारा flanked, 26 पहले से वर्णित है .

  1. : 202 μl विआयनीकृत जल, 40 μl 10x Taq डीएनए पोलीमरेज़ बफर, 2 μl ssDNA टेम्पलेट (0.5 nmol), 120 μl 25 मिमी 2 MgCl, 28 μl 10 मिमी deoxynucleoside triphosphate मिश्रण पुस्तकालय बढ़ाना निम्नानुसार मानक पीसीआर प्रतिक्रिया सेट (dNTPs), 1 μl आगे (300 pmol) किताब, 1 μl रिवर्स प्राइमर (300 pmol), और 4 μl Taq पोलीमरेज़.
  2. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक थर्मल cycler का उपयोग पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन: 94 पर 5 मिनट ° सी के लिए प्रारंभिक विकृतीकरण, 30 सेकंड, 52 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 ° सी के 20 annealing के लिए 30 सेकंड के लिए प्रत्येक चक्र, 72 ° 30 सेकंड के लिए सी के लिए विस्तार, और 72 पर अंतिम विस्तार ° सी 7 मिनट के लिए.
  3. पीसीआर प्रतिक्रिया के पूरा होने के बाद, प्रवर्धित डीएनए निर्माता के निर्देशों के अनुसार Qiagen QiaQuick पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर उत्पाद शुद्ध. आम तौर पर, इन प्रयोगों में एकाग्रता और डीएनए की उपज 160 हैं ± 10 / 50 μl में एनजी μl.
  4. पीसीआर के बाद डीएनए की मात्रा 2% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा सत्यापित करें.

भाग 4: 32 पी - लेबल शाही सेना के इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा जनरेशन

  1. 20 μl 5x T7 प्रतिलेखन बफर, 7.5 μl 100 मिमी RATP, rGTP, rUTP, 1 100 μl प्रत्येक एक O-अंगूठी से छाया, 1.6 मिलीलीटर ट्यूब में निम्नानुसार कुछ संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सेट मिमी rCTP, 2 μl α 32 पी CTP की (3000 Ci mmol /), 5-10 μg डीएनए टेम्पलेट (~ 30-40 μl डीएनए उत्पाद शुद्ध), 10 μl एंजाइम मिश्रण, और 100 μl को अंतिम मात्रा बनाने शुद्ध nuclease - मुक्त पानी जोड़कर.
  2. समाधान एक विंदुक द्वारा धीरे मिश्रण, मिश्रण अपकेंद्रित्र, और 37 में डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
  3. प्रतिक्रिया के अंत में, डीएनए टेम्पलेट हटा दिया जाना चाहिए. 37 में 1 / यू टेम्पलेट और 4 घंटे के लिए डीएनए सेते के μg के एक एकाग्रता RQ1 RNase मुक्त DNase जोड़ें डिग्री सेल्सियस डीएनए टेम्पलेट को पचाने के लिए.
  4. क्लोरोफॉर्म:: isoamyl शराब (125:24:1, पीएच 4.7) 4 घंटे के बाद, साइट्रेट संतृप्त phenol के 1 मात्रा जोड़कर शाही सेना निकालने. 2 मिनट के लिए 16,000 ग्राम पर ~ 1 मिनट और अपकेंद्रित्र के लिए एक भंवर से मिलाएं.
  5. एक ताजा ट्यूब के लिए ऊपरी, जलीय चरण स्थानांतरण या एक micropipette का उपयोग आकांक्षा से नीचे चरण त्यागें. Isoamyl (24:1) शराब, 1 मिनट और अपकेंद्रित्र के रूप में 4.4 में वर्णित के लिए एक भंवर द्वारा मिश्रण: 1 क्लोरोफॉर्म की मात्रा जोड़ें.
  6. एक ताजा ट्यूब के लिए ऊपरी, जलीय चरण स्थानांतरण या एक micropipette का उपयोग आकांक्षा से नीचे चरण त्यागें. अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म और micropipette के साथ नीचे चरण के microcentrifuge हटाने में एक त्वरित स्पिन (10 सेकंड) के प्रदर्शन द्वारा हटाया जा सकता है. इस चरण में, यह आसान है supernate बजाय नीचे चरण हटायें.
  7. करने के लिए शाही सेना वेग, 3M सोडियम एसीटेट के बराबर 0.1 मात्रा 5.2 पीएच, और 2 - propanol 1 मात्रा के बराबर जोड़ें. मिक्स और 15 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जगह है.
  8. के बाद 15 मिनट, शीर्ष गति से स्पिन, अधिमानतः 4 पर एक प्रशीतित microcentrifuge में डिग्री सेल्सियस, 20-30 मिनट के लिए शाही सेना उत्पाद वेग.
  9. Supernate सावधानी Aspirate, 70% इथेनॉल के 0.5 मिलीलीटर, 4 ° C पर अपकेंद्रित्र के साथ शाही सेना गोली धोने और आकांक्षा द्वारा इथेनॉल त्यागें.
  10. एक गर्मी ब्लॉक करने के लिए शाही सेना गोली युक्त ट्यूब स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए 37 पर गोली ° सी सूखी.
  11. 150 मिमी STE बफर, पीएच 8.0 (illustra ProbeQuant जी 50 microcolumns के साथ प्रदान की) या nuclease मुफ्त पानी में एक में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया यानी, 100 μl (4.1 कदम) के समान मात्रा के लिए शाही सेना नमूना भंग.
  12. 70 में शाही सेना उत्पाद युक्त डिग्री सेल्सियस गर्मी और एक भंवर द्वारा ब्लॉक मिश्रण में 10 मिनट के लिए शाही सेना के विघटन को सुविधाजनक बनाने के लिए ट्यूब हीट.
  13. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए शीर्ष गति से अपकेंद्रित्र.
  14. जगमगाहट गिनती और TBE यूरिया polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (भाग 6) के लिए एक लेबल ट्यूब 0.6 मिलीलीटर में शाही सेना के एक 1-μl विभाज्य रखें.

भाग 5: अनिगमित nucleotides का हटाया जाना है, शाही सेना desalting, और जगमगाहट गिनती

अनिगमित nucleotides को हटाने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार दो जी 50-स्तंभों का उपयोग.

  1. राल resuspend भंवर से कॉलम और मिश्रण उलटें.
  2. वेध में स्तंभों के नीचे बंद स्नैप प्लास्टिक किट में दिए गए उपकरण का उपयोग और आउटलेट अछूता छोड़ के लिए सुनिश्चित करें. टोपी एक तिमाही बारी ढीला और जी में साफ संग्रह प्रदान ट्यूबों में स्तंभों की जगह-50 किट.
  3. 1 मिनट के लिए 730 ग्राम पर संग्रह ट्यूबों में स्तंभों स्पिन भंडारण बफर हटाने के लिए.
  4. दो नए O-अंगूठी - छाया, 1.6 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए कॉलम स्थानांतरण और 32 के 50 μl पी लेबल पर सीधे स्तंभ प्रति राल राल perturbing बिना आरएनए नमूना लोड
  5. 2 मिनट के लिए 730 ग्राम पर स्पिन शुद्ध लेबल शाही सेना इकट्ठा. इस कदम के बाद, स्तंभ त्यागें.
  6. जगमगाहट गिनती और वैद्युतकणसंचलन (भाग 6) के लिए एक 0.6-मिलीलीटर ट्यूब G-50-शुद्ध शाही सेना के एक μl स्थानांतरण. SELEX के लिए उपयोग जब तक स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर शेयर शाही सेना. यह वांछनीय है कि शाही सेना और गतिविधि की गिरावट के नुकसान से बचने के लेबलिंग के बाद 2 दिनों के भीतर प्रयोग किया जाता है.
  7. दो 1 μl कदम 4.14 और 5.6 से शाही सेना aliquots मिनट प्रति मायने रखता है (सीपीएम μl /) के एक जगमगाहट काउंटर का उपयोग को मापने का प्रयोग करें. यहाँ, हम Triathler जगमगाहट बेंच टॉप काउंटर का उपयोग करें.
  8. 32 पी गिनती के लिए इस्तेमाल प्लास्टिक एडाप्टर के अंदर शाही सेना नमूना युक्त ट्यूबों, Triathler के साथ प्रदान की स्थानांतरण . एडाप्टर और गिनती कक्ष के अंदर ट्यूब रखो, चैम्बर के ढक्कन बंद करने के लिए, 32 पी गिनती चुनते हैं, और शुरू की गिनती शुरू दबाएँ.
  9. % लेबल समावेश यानी, 32 α पी CTP = (सीपीएम / μl G-50 के लिए "" नमूना ÷ सीपीएम / "कुल" नमूना के लिए μl) x 100% समावेश की गणना . कुल नमूना G-50 शुद्धि से पहले नमूना है.
  10. जगमगाहट गिनती और प्रतिशत समावेश की गणना के बाद, शाही सेना और शाही सेना की विशिष्ट गतिविधि की उपज की गणना. उदाहरण के लिए, यदि शाही सेना के एक पूल के लिए (237,370 सीपीएम μl /) से पहले और बाद में गिना जाता है जी 50 (सीपीएम 191,330 / μl) शुद्धि उपज 81% समावेश है, तो निम्नलिखित शाही सेना की उपज प्राप्त करने से पहले की गणना कर रहे हैं:

    4.1 कदम से, 3000 Ci mmol / μCi और / 10 μl में α 32 P-CTP की राशि है:
    एक समीकरण .
    unlabeled CTP की राशि इस्तेमाल किया है:
    2 समीकरण .
    CTP प्रयोग किया जाता का कुल राशि 100006.7pmol है. शाही सेना के आणविक भार की गणना निम्न प्रकार है
    3 समीकरण
    जहां 321.45 छ / mol 27 rNTPs का औसत द्रव्यमान है 100 बीपी, अनुक्रम में अपने अड्डों की संख्या है, और 17 बीपी T7 प्रमोटर में अपने अड्डों है कि लिखित नहीं कर रहे हैं की संख्या है . 61.96 छ / oligonucleotide आणविक वजन से तिल के घटाव HPO 2 (63.98) के खाते को हटाने और दो ​​हाइड्रोजन (2.02) परमाणुओं 27 के अलावा में लेता है . क्योंकि, 4 rNTPs, CTP सीमित अभिकर्मक है, अगर सभी CTP उत्पादन शाही सेना गया होता सैद्धांतिक जन शामिल हो रहे थे:
    4 समीकरण .
    हालांकि, 81% के समावेश की वजह से, अब इस जन 2156 μg है. शाही सेना के μg प्रति गिनता तो होगा
    5 समीकरण
    जहां 100 μl प्रतिलेखन प्रतिक्रिया की मात्रा है, और moles की शर्तों में: 26618.4 μg / μmol x 8874 सीपीएम / μg = 2.4x10 8 / सीपीएम μmol. यहाँ से nmol और उसके उचित मात्रा में शाही सेना की राशि प्रोटीन के साथ ऊष्मायन के लिए इस्तेमाल किया जैसे गणना की जा सकती है, 5 μl शाही सेना ~ 4 nmol शाही सेना, अर्थात् में शामिल होंगे,
    6 समीकरण
    इन प्रयोगों में, 300 1 nmol प्रोटीन और 100 nmol शाही सेना के 4 nmol pmol 21 इस्तेमाल किया गया .

भाग 6: शाही सेना उत्पाद के वैद्युतकणसंचलन और autoradiography द्वारा विशेषता

  1. वैद्युतकणसंचलन के लिए नमूने तैयार करने के लिए, कदम 4.14 और 5.6 से G-50 शुद्धि से पहले और बाद में शाही सेना के एक μl aliquots क्रमशः का उपयोग करें,. 4 μl STE बफर और 5 μl 2x Novex नमूना TBE - यूरिया बफर जोड़ें.
  2. में 70 नमूने हीट ° सी के 5 मिनट के रूप में आमतौर पर शाही सेना वैद्युतकणसंचलन (हीटिंग के लिए अनावश्यक हो पाया था क्योंकि जेल संकल्प के साथ और हीटिंग के बिना आरएनए नमूने इस प्रयोगात्मक सेटअप में एक ही है) के लिए सिफारिश के लिए.
  3. जेल चल तंत्र में एक 6% TBE यूरिया - polyacrylamide जेल इकट्ठा करने के लिए, 1x Novex TBE यूरिया रनिंग बफर के साथ अंदर और बाहर कक्षों को भरने के. मिल में बना हुआ जेल के कुओं एक 1 मिलीलीटर विंदुक द्वारा बफर का उपयोग कर कुल्ला.
  4. शाही सेना ट्यूबों अपकेंद्रित्र और नमूने (10 μl कुल) जेल लोडिंग सुझावों का उपयोग कर लोड. 50 मिनट के लिए 180 वी पर जेल चलाएँ.
  5. 50 मिनट के बाद, के अलावा प्लास्टिक मोल्ड को तोड़ने के द्वारा जेल जुदा, हटाने और केवल जेल आचारण के कम समर्थन त्यागें, लेकिन जेल के लिए एक सहायता के रूप में अब समर्थन छोड़ दें.
  6. Decon (या अन्य उपयुक्त रेडियोधर्मिता decontaminant) यकीन है कि contaminating सभी रेडियोधर्मी धब्बे को हटा रहे हैं बनाने के साथ काम के क्षेत्र की सतह को साफ करें.
  7. प्लास्टिक सरन लपेटो के बाहर दो परतों लेटाओ, दो plied प्लास्टिक लपेटो में जेल और प्लास्टिक समर्थन लपेटो.
  8. प्लास्टिक में एक के एक पत्रक के लिए लिपटे जेल बेनकाबutoradiography अंधेरे कमरे में एक जोखिम कैसेट के अंदर सुरक्षित प्रकाश एक्स - रे के तहत, फिल्म. 60-90 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर कैसेट छोड़ो.
  9. एक स्वत: फिल्म डेवलपर (चित्रा 2) का उपयोग कर 60-90 मिनट के बाद सुरक्षित प्रकाश के तहत अंधेरे कमरे में फिल्म का विकास करना.

भाग 7: आरएनए प्रोटीन ऊष्मायन और फिल्टर बाध्यकारी

सबसे पहले, आरएनए और प्रोटीन समाधान में incubated रहे हैं और तब शाही सेना के दृश्यों कि प्रोटीन के लिए बाध्य गैर बाँधने से अलग हो रहे हैं. SELEX चक्र प्रगति के रूप में, फिल्टर बाइंडिंग प्रोटीन शाही सेना बाध्यकारी संवर्धन का एक संकेत दे देंगे.

  1. 90 ° C पर विकृतीकरण के लिए 10 मिनट के लिए और फिर धीमी renaturation के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शाही सेना सेते हैं.
  2. 2.12 कदम से 8 μl 60 मिमी NaOH में प्रोटीन भंग और 36 μl nuclease मुक्त विआयनीकृत जल जोड़ने. 1 मिनट के लिए मिश्रण Sonicate और 36 μl 2x शाही सेना बाध्यकारी बफर (20 ​​मिमी Tris, 300 मिमी NaCl, 10 मिमी 2 MgCl, 7.5 पीएच) जोड़ें.
  3. 20 μl 10x शाही सेना बाध्यकारी बफर के साथ शाही सेना की उचित मात्रा में मिक्स और nuclease - मुक्त पानी जोड़कर 200 μl मात्रा. लेबल ट्यूब "नकारात्मक नियंत्रण."
  4. 20 μl 10x शाही सेना बाध्यकारी बफर के साथ 20 μl प्रोटीन और शाही सेना के वांछित राशि मिक्स और nuclease मुक्त पानी के साथ 200 μl मात्रा. ट्यूब "प्रतिक्रिया" लेबल.
  5. मिश्रण और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ट्यूबों को सेते हैं. इस बीच फिल्टर और फिल्टर बाध्यकारी अगले कदम के लिए सेटअप तैयार.
  6. एक वैक्यूम इनलेट एक 125 मिलीलीटर की ओर हाथ फ्लास्क संलग्न. एक पूर्व साफ ओर हाथ फ्लास्क पर फ़िल्टर के लिए झरझरा कांच समर्थन रखें.
  7. एक 35x10 मिमी 10-15 मिनट के लिए पेट्री डिश में 1x शाही सेना बाध्यकारी बफर के 2-3 मिलीलीटर में 3 फिल्टर झिल्ली को संतुलित करना. पहली फ़िल्टर वैक्यूम चूषण का समायोजन करने के लिए उपयोग किया जाएगा, दूसरा शाही सेना अकेले के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, नकारात्मक नियंत्रण फिल्टर, बंधन, और तीसरे शाही सेना, प्रोटीन मिश्रण के फिल्टर बंधन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  8. 30 मिनट के बाद, बाध्यकारी प्रतिक्रिया और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए शीर्ष गति पर नियंत्रण ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
  9. वैक्यूम पर मुड़ें और झरझरा कांच पर पहला झिल्ली जगह. एक micropipette का प्रयोग, झिल्ली पर शाही सेना बाध्यकारी बफर के 0.5 मिलीलीटर ड्रिप और वैक्यूम समायोजित करने के लिए झिल्ली के माध्यम से प्रत्येक बफर बूंद के धीमी गति से प्रवाह की अनुमति.
  10. झरझरा कांच पर दूसरा झिल्ली प्लेस और एक ही प्रवाह की दर का उपयोग कर, झिल्ली पर नकारात्मक नियंत्रण लागू होते हैं.
  11. 1x शाही सेना बाध्यकारी बफर के 4x0.5 मिलीलीटर aliquots लागू झिल्ली धोने और प्रवाह के माध्यम से त्यागें. नोट करें कि अगर पूर्व समाशोधन वांछित है, प्रवाह के माध्यम से शाही सेना निकासी के लिए रखा जाता है. पूर्व समाशोधन आरएनए दृश्यों कि फिल्टर करने के लिए बाध्य निकालता है.
  12. तदनुसार लेबल जगमगाहट गिनती के लिए 1.6 मिलीलीटर ट्यूब में नकारात्मक नियंत्रण झिल्ली और जगह निकालें.
  13. एक पूर्व साफ दूसरी झरझरा कांच समर्थन के साथ झरझरा कांच बदलें.
  14. झरझरा कांच पर तीसरे डिस्क प्लेस और प्रतिक्रिया मिश्रण लागू होते हैं. 7.11 कदम के रूप में फिल्टर धो और प्रवाह के माध्यम से त्यागें. washes की संख्या बाद SELEX चक्र में वृद्धि हो SELEX शर्तों की तंगी में वृद्धि कर सकते हैं.
  15. एक 1.6 मिलीलीटर प्रतिक्रिया "मिश्रण" लेबल ट्यूब में फ़िल्टर डिस्क और जगह निकालें और जगमगाहट गिनती के लिए रहते हैं.
  16. 5.8 कदम के रूप में गिनती जगमगाहट प्रदर्शन और नीचे संबंधित फ़िल्टर के लिए मायने रखता है नोट.
  17. रेडियोधर्मिता झिल्ली (% बंधन) करने के लिए लागू की कुल राशि की तुलना में फिल्टर बाध्य रेडियोधर्मिता के स्तर की गणना. यह SELEX प्रगति के रूप में बाध्यकारी संवर्धन का एक संकेत दे देंगे.

8: भाग फिल्टर से शाही सेना निकासी

शाही सेना के दृश्यों कि प्रोटीन के लिए बाध्य प्राप्त करने के लिए फिल्टर से निकाला जाता है. इन दृश्यों को अगले SELEX चक्र के लिए परिलक्षित कर रहे हैं.

  1. जगमगाहट गिनती के बाद, ट्यूब से फिल्टर बंधन रिएक्शन (7.15 कदम से) और एक साफ, सूखे, 35x10 मिमी पेट्री डिश में जगह हटा दें.
  2. एक साफ स्केलपेल और चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए छोटे टुकड़ों में झिल्ली में कटौती.
  3. चिमटी का प्रयोग, 8.1 कदम से एक ही लेबल ट्यूब में झिल्ली कट टुकड़े की जगह.
  4. 400 μl elution बफर (7 एम यूरिया, 3 मिमी EDTA, 100 मिमी सोडियम साइट्रेट, 5.0 पीएच) जोड़ें और 95 ° C पर 10 मिनट के लिए ट्यूब को सेते हैं.
  5. कमरे के तापमान पर शीर्ष गति से ट्यूब अपकेंद्रित्र, aspirate, और एक नया लेबल ट्यूब में निकासी मक्खन इकट्ठा.
  6. निष्कर्षण दक्षता का आकलन गिनती जगमगाहट के द्वारा झिल्ली टुकड़े युक्त ट्यूब में शेष रेडियोधर्मिता मायने रखता है उपाय.
  7. निष्कर्षण प्रक्रिया (8.4-8.6 कदम) को तीन बार दोहराएँ. 3 extractions के बाद दक्षता आमतौर पर 95-96% ~ है.
  8. क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब (125:24:1) शाही सेना के अर्क से युक्त ट्यूबों में, साइट्रेट संतृप्त 1 (400 μl) मात्रा (4.7 पीएच) फिनोल जोड़ने ~ 1 मिनट और centrifu के लिए एक भंवर से मिक्स2 मिनट के लिए 16,000 ग्राम पर जीई .
  9. एक ताजा ट्यूब के लिए ऊपरी, जलीय चरण स्थानांतरण या एक micropipette का उपयोग आकांक्षा से नीचे चरण त्यागें.
  10. Isoamyl (24:1) शराब, 2 मिनट के लिए 16,000 ग्राम पर 1 मिनट और अपकेंद्रित्र के लिए एक भंवर द्वारा मिश्रण: 1 क्लोरोफॉर्म की मात्रा जोड़ें.
  11. एक ताजा ट्यूब के लिए ऊपरी, जलीय चरण स्थानांतरण या एक micropipette का उपयोग आकांक्षा से नीचे चरण त्यागें.
  12. करने के लिए शाही सेना वेग, 3 एम सोडियम एसीटेट के 0.1 मात्रा, 5.2 पीएच, शाही सेना coprecipitant के रूप में 3-4 μl ग्लाइकोजन (10 μg / μl), और 1 2 propanol की मात्रा बराबर जोड़ें. मिक्स जगह और एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रात भर.
  13. शीर्ष गति से स्पिन के लिए, अधिमानतः में 4 पर एक microcentrifuge ° C 20-30 मिनट के लिए, 8.12 कदम से शाही सेना वेग.
  14. Centrifugation के बाद, शाही सेना है कि मुश्किल से दिखाई है एक तरल चरण में अलग है. ट्यूब के नीचे यह मुश्किल से दिखाई तेज़ चरण dislodging बिना supernate सावधानी Aspirate.
  15. शाही सेना "गोली" धो 70% इथेनॉल के 0.5 मिलीलीटर के साथ शीर्ष गति से 5 मिनट के लिए 4 में अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस और मुश्किल से दिखाई तेज़ चरण dislodging बिना आकांक्षा से इथेनॉल त्यागें.
  16. 50 μl STE बफर में शाही सेना गोली भंग और चरण 5 में के रूप में जी 50 शुद्धि के लिए आगे बढ़ना.

भाग 9: रिवर्स और जारी रखने के SELEX चक्र के लिए प्रतिलेखन पीसीआर

SELEX के अगले चक्र के लिए आगे बढ़ना, शाही सेना डीएनए के लिए रिवर्स लिखित और पीसीआर से परिलक्षित हो गया है.

  1. 5 फीट 0.6 मिलीलीटर ट्यूबों लेबल, शुद्ध 3 μl, 8 गुना पतला रिवर्स प्राइमर के 2 μl के साथ जी 50 desalted शाही सेना मिश्रण. लेबल एक ट्यूब 'नकारात्मक नियंत्रण.'
  2. 70 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए, और फिर एक और 5 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण करने के लिए शाही सेना के लिए प्राइमर के संकरण की अनुमति सेते हैं.
  3. बर्फ पर इस मिश्रण करने के लिए, 6.4 μl nuclease मुक्त पानी, 4 μl ImProm द्वितीय 5x प्रतिक्रिया बफर, 1.6 μl 25 मिमी 2 MgCl, 1 μl 10 मिमी dNTP मिश्रण, 1 μl RNasein Ribonuclease अवरोध करनेवाला, 1 μl ImProm द्वितीय रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस जोड़ें 15 μl की कुल बना.
  4. नकारात्मक नियंत्रण के लिए 7.4 μl nuclease मुक्त पानी जोड़ने और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस छोड़. ट्यूबों तदनुसार लेबल. नकारात्मक नियंत्रण है कि पिछले एक चक्र से डीएनए contaminating अगले SELEX चक्र के लिए नहीं परिलक्षित होता है सत्यापित करने के लिए शामिल है. यह कदम RQ1 RNase मुक्त DNase द्वारा डीएनए टेम्पलेट की 4.3 चरण में पाचन की प्रभावशीलता का परीक्षण.
  5. एक थर्मल cycler प्रयोग के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 42 ° annealing और पहली कतरा डीएनए, क्रमशः, 70 द्वारा पीछा के विस्तार के लिए सी 1 ज के लिए के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेते सी 15 मिनट के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस निष्क्रिय °.
  6. रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के बाद, पीसीआर मिश्रण सेट. 30 μl पानी nuclease मुक्त, 10 μl 10x Taq बफर, 30 μl 25 मिमी 2 MgCl, 7 μl 10 मिमी dNTP मिश्रण, प्रत्येक प्राइमर के 1 μl, और सभी ट्यूबों में 1 μl Taq पोलीमरेज़ जोड़ें.
  7. 9-14 चक्र के लिए 3 भाग के रूप में पीसीआर प्रोग्राम चलाएँ.
  8. डीएनए शुद्ध उत्पाद के रूप में 3.3 चरण में है.
  9. 2 μl लोड हो रहा है डीएनए डाई और 15-20 मिनट (चित्रा 3) के लिए 100 वी पर electrophorese 2% agarose पर के साथ मिश्रण डीएनए उत्पाद के 8 μl.
  10. डीएनए उत्पाद भाग 4 के रूप में लेबल शाही सेना के लिए लिखित जा SELEX के अगले चक्र के लिए इस्तेमाल के लिए तैयार है.

भाग 10: प्रतिनिधि परिणाम

SELEX प्रयोगों में, लक्ष्य, शाही सेना की गुणवत्ता प्रत्येक चक्र के लिए इस्तेमाल किया, और सफल शाही सेना और प्रत्येक चक्र के बाद निकासी प्रवर्धन के रूप में इस्तेमाल किया Aβ40 oligomers की प्रकृति महत्वपूर्ण हैं. हम पीआईसीयूपी इस्तेमाल शुद्धि और पार से जोड़ने अभिकर्मकों हटाने के बाद SELEX के लिए एक oligomeric Aβ40 मिश्रण उत्पन्न. desalting भाग 2 में वर्णित प्रयोगों आमतौर पर 50-55% प्रोटीन घटाने के लिए सीसा. प्रोटीन की मात्रा और गुणवत्ता absorbance (λ 280 =) माप और एसडीएस PAGE (चित्र 1) का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. 5 व्यक्ति Aβ40 उन प्रयोगों में eluted के एक ठेठ एसडीएस पृष्ठ प्रोफ़ाइल overlaying प्रयोगों से Aβ40 eluates की औसत absorbance के प्रोफ़ाइल चित्र 1 में दिखाया जाता है. डेटा बताते हैं कि प्रोटीन लगातार 3-5 भिन्न और पार से जोड़ने 6 अंश बाद elute अभिकर्मकों (7 अंश, चित्रा 1 में वृद्धि हुई absorbance) में स्तंभ से elutes. एसडीएस पृष्ठ ठेठ Aβ40 oligomer 22 वितरण से पता चलता है. इस वितरण में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य के बाद प्रोटीन भिन्न (2.11) lyophilized थे, (2.11) HFIP, resolubilized (7.1) के साथ इलाज किया, और एसडीएस पृष्ठ से फिर से विश्लेषण किया गया था.

शाही सेना के प्रत्येक SELEX चक्र के लिए वफ़ादारी भी SELEX की प्रगति पुनरावृत्त के लिए महत्वपूर्ण है, खासकर जब nuclease अतिसंवेदनशील ribo - oligonucleotides उपयोग किया जाता है. शाही सेना के प्रवर्धन और लेबलिंग (भाग 4) के बाद, लेबल शाही सेना की गुणवत्ता TBE - यूरिया - polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. एक अक्षुण्ण लेबल आरएनए उत्पाद का एक विशिष्ट प्रोफ़ाइल से पहले और बाद में G-50 शुद्धि (पी5 कला) चित्रा 2 में दिखाया गया है.

प्रत्येक SELEX चक्र के बाद, शाही सेना फिल्टर बाइंडिंग के बाद झिल्ली (भाग 8) और पीसीआर प्रवर्धन के लिए डीएनए (9.5 चरण) के लिए रिवर्स लिखित (पार्ट 9) से निकाला जाता है. पिछले एक चक्र से डीएनए टेम्पलेट तो 32 पी - लेबल अगले चक्र के लिए शाही सेना (पार्ट 4) उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यदि कुछ contaminating पिछले एक चक्र से डीएनए टेम्पलेट में इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं (भाग 4) के बाद लेबल आरएनए उत्पाद में बनी रहती है, SELEX चक्र की दक्षता, कम हो जाएगा अधिक चक्र की मांग. इस के लिए नियंत्रण करने के लिए, प्रत्येक SELEX चक्र और इसी रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर प्रतिक्रिया के बाद, agarose वैद्युतकणसंचलन (9.12) किया जाता है. नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया ट्यूबों (9.4) में डीएनए उत्पाद की अनुपस्थिति डीएनए टेम्पलेट के सफल हटाने पिछले एक SELEX चक्र (चित्रा 3) से प्रारंभिक संकेत करता है. यदि पीसीआर द्वारा डीएनए प्रवर्धन नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब में मनाया जाता है, यह सलाह दी जाती है कि RQ1 DNase (4.3) के साथ लंबे समय तक ऊष्मायन की अवधि. निर्माता की सिफारिश की RQ1 DNase साथ ऊष्मायन अवधि 15 मिनट है, लेकिन हमने पाया है कि अब incubations (4-5 घंटे) टेम्पलेट डीएनए (चित्रा 3) पूरी तरह से हटाने के लिए आवश्यक थे.

1 आंकड़ा
चित्रा 1. एसडीएस पृष्ठ और पीआईसीयूपी उत्पन्न desalted Aβ40 oligomers के absorbance के प्रोफ़ाइल. 5 व्यक्ति desalting स्तंभों से absorbance प्रोफ़ाइल औसत था और एक प्रतिनिधि जेल पर overlain. आण्विक वजन मार्करों सही पर दिखाया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. TBE - यूरिया - polyacrylamide शाही सेना के उत्पाद के पहले जेल वैद्युतकणसंचलन और G-50 शुद्धि के बाद. शाही सेना उत्पाद के प्रवास दिशा कैथोड से anode रूप में संकेत दिया है.

चित्रा 3
चित्रा रिवर्स प्रतिलेखन और पीसीआर प्रवर्धन के बाद डीएनए उत्पाद के 3. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन .

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Discussion

SELEX प्रक्रिया के शुरुआती बिंदु एक यादृच्छिक oligonucleotide आम तौर पर 10 12 -10 15 दृश्यों से युक्त पुस्तकालय के संश्लेषण है. डीएनए SELEX में, इस लायब्रेरी सीधे प्रयोग किया जाता है के बाद एक ssDNA पूल उत्पन्न होता है, जबकि शाही सेना SELEX में, यहाँ प्रदर्शन, ssDNA पुस्तकालय एक शाही सेना पूल करने के लिए पहली कनवर्ट किया जाता है enzymatically में इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा. फिर, SELEX iteratively किया जाता है जिससे प्रत्येक चक्र के जोखिम और इच्छित लक्ष्य के लिए oligonucleotides के बंधन शामिल है, गैर बाध्यकारी दृश्यों, और बाध्यकारी दृश्यों के elution से बाँधने का विभाजन. चक्र में बाद में, लक्ष्य और शाही सेना और / या washes की संख्या के stoichiometry, बदला जा सकता है या SELEX शर्तों की तंगी को बढ़ाने के प्रतिस्पर्धी inhibitors बंधन या धोने बफर में जोड़ा जा सकता है है. फ़िल्टर बाध्यकारी एक क्लासिक, सरल है, और तेजी से 10 SELEX के लिए विधि का इस्तेमाल किया है, हालांकि कई तरीकों बंधन और विभाजन के लिए किया गया है 28 में वर्णित है. फ़िल्टर बाध्यकारी कब्जा और समाधान में शाही सेना लक्ष्य बातचीत के चयन के लिए आदर्श है. जब चयन लक्ष्य छोटे अणुओं या पेप्टाइड्स रहे हैं, फिल्टर बंधन में इस्तेमाल किया झिल्ली के ध्यान में लीन होना आकार एक सीमित कारक है और एक महत्वपूर्ण विचार हो जाता है.

Elution के बाद, बाध्यकारी लक्ष्य oligonucleotides प्रवर्धित और आगे चक्र के लिए इस्तेमाल किया कर रहे हैं. जब डीएनए SELEX का उपयोग कर, समृद्ध पूल पीसीआर द्वारा amplified किया जा सकता है है सीधे और पूरक अनुक्रम और डीएनए लेबलिंग के पाचन के बाद अगले चक्र के लिए इस्तेमाल किया. जब शाही सेना SELEX का उपयोग, इस पूल रिवर्स प्रतिलेखन द्वारा डीएनए के लिए परिवर्तित हो सकता है और तब प्रवर्धित पीसीआर द्वारा लिखित में इन विट्रो, और फिर अगले चक्र के लिए जारी रखने के लिए लेबल है. आमतौर पर, 8-20 जैसे चक्र एक समृद्ध aptamer पूल, जो बाद में क्लोन है और व्यक्तिगत aptamers अनुक्रम और विशेषता कर रहे हैं प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. क्योंकि तंतुमय amyloid संरचनाओं के लिए oligonucleotides के निहित आत्मीयता संभावित शारीरिक 21 शर्तों के तहत गैर तंतुमय amyloid प्रोटीन के लिए विशिष्ट aptamers के विकास hinders amyloid प्रोटीन, aptamers के लक्षण वर्णन विशेष रूप से महत्वपूर्ण है का उपयोग अध्ययन में. इस निहित, oligonucleotides के अनुक्रम स्वतंत्र आत्मीयता गैर तंतुमय amyloidogenic 17,19-21 प्रोटीन के लिए aptamers उत्पन्न करने के लिए लक्ष्य अध्ययन में महीन रेशा पार प्रतिक्रियाशील aptamers की पीढ़ी के लिए नेतृत्व हो सकता है. हाल ही में, Takahashi एट अल. आरएनए aptamers Aβ40 की एक oligomeric मॉडल के खिलाफ पीढ़ी की सूचना दी और micromolar आत्मीयता के साथ 29 monomeric Aβ के साथ जेट से पता चला है. हालांकि, Aβ40 तंतुमय के साथ या अन्य तंतुमय amyloidogenic प्रोटीन के साथ इन aptamers के पार जेट नहीं निर्धारित किया गया था.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम NIH / एनआईए और 07-65798 से सार्वजनिक स्वास्थ्य के कैलिफोर्निया विभाग से AG030709 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. हम पेप्टाइड संश्लेषण और एमिनो एसिड विश्लेषण, की मदद करने और परियोजना, समर्थन और अभिकर्मकों प्रदान करने के लिए डा. ची हांग बी चेन के प्रारंभिक कदम का समर्थन करने के लिए डॉ. एलिजाबेथ एफ Neufeld, और डॉ. एंड्रयू विकास के लिए मार्गरेट एम. Condron स्वीकार करते हैं उपयोगी विचार - विमर्श के लिए. Ellington.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aβ40 UCLA Biopolymers Laboratory Lyophilized powder
MX5 Automated-S Microbalance Mettler Toledo
Silicon-coated, 1.6-ml tubes Denville Scientific C19033 or C19035
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) TCI America H0424 Use in a fume hood.
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A-7460 Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate Sigma-Aldrich 224758-1G Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
D-Salt™ Excellulose™ desalting columns Thermo Fisher Scientific, Inc. 20449
Ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
Silicon-coated, 0.6-ml tubes Denville Scientific C19063
Novex Tricine Gels (10–20%) Invitrogen EC6625B0X 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa
Quartz cuvette Hellma 105.250-QS
Beckman DU 640 spectrophotometer Beckman Coulter Inc.
ssDNA library Integrated DNA Technologies Custom-ordered The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’
Taq DNA polymerase USB Corp., Affymetrix 71160 Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR.
PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution USB Corp., Affymetrix 77212 (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Forward primer Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’
Reverse primer Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’
Thermal cycler Denville Scientific Techne TC-312
QIAquick PCR Purification Kit (50) Qiagen 28104
Agarose Denville Scientific CA3510-8
Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings Denville Scientific C19040-S
RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 Promega Corp. P1300 The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water
α-32P-cytidine 5’-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), PerkinElmer, Inc. BLU008H250UC Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)
Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) Sigma-Aldrich 77619
Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) Sigma-Aldrich C0549
Absolute ethanol for molecular biology Sigma-Aldrich E7023
Z216-MK refrigerated microcentrifuge Denville Scientific C0216-MK
illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns GE Healthcare Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide
Triathler Bench-top Scintillation counter Hidex Oy, Turku, Finland Triathler LSC Model: 425-034
Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) Invitrogen LC6876
6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells Invitrogen EC6865BOX
Novex® TBE Running Buffer (5×) Invitrogen LC6675
Radioactivity decontaminant Fisher Scientific 04-355-67
Gel-loading tips Denville Scientific P3080
XCell SureLock Mini-Cell Invitrogen EI0001 XCell SureLock Mini-Cell
Autoradiography film Denville Scientific E3018 Use in complete darkness
Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL Amersham RPN3114K Can be used under red safe light.
Membrane discs EMD Millipore GSWP02500 Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes
Fritted glass support base for 125-ml flask VWR international 26316-696
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-11YZ
Urea Fisher Scientific AC32738-0050
EDTA Fisher Scientific 118430010
Glycogen Sigma-Aldrich G1767
2-Propanol for molecular biology Sigma-Aldrich I9516
Recombinant RNase inhibitor USB Corp., Affymetrix 71571
ImProm-II™Reverse Transcription System Promega Corp. A3802
Recombinant RNase inhibitor USB Corp., Affymetrix 71571
RapidRun™ Loading Dye USB Corp., Affymetrix 77524

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References

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Rahimi, F., Bitan, G. Selection of Aptamers for Amyloid β-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (39), e1955, doi:10.3791/1955 (2010).

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