Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Summary

Bu video, fare blastosist blastosist trofoblast kök hücrelerinin izolasyonu ve derivasyon göstermektedir. Ayrıca kök hücre özelliği yanı sıra kültür farklılaşma indüksiyonu için bakım koşulları açıklar.

Abstract

Trophectoderm belirlenmesi memeli gelişiminin erken farklılaşma olayları biridir. Trophectoderm aracılık implantasyon türetilmiştir ve plasentanın fetal trofoblast soy üretir. Sonuç olarak, bu soy gelişimi embriyonun hayatta kalmak için çok önemlidir. Fare blastosist trofoblast kök (TS) hücreleri türetilmesi ilk Tanaka tarafından tarif edilmiştir<em> Ve ark.</em> 1998. Uygun stimülasyon sonra sahne ve hücre tipi özel işaretleri trofoblast özel mülkiyet ve anlatım TS hücreleri korumak için yeteneği erken plasenta olayları yansıtan sayede trofoblast soy geliştirme araştırmak için değerli bir model sistem sunmaktadır. Ayrıca, trofoblast hücrelerinin doğal genom amplifikasyon geçiren birkaç somatik hücre tipleri biri. Trofoblast polyploidization altında yatan moleküler yollar çözülmeye başlamış olmasına rağmen, trofoblast genom amplifikasyon fizyolojik rolü ve avantajı büyük ölçüde zor kalır. Kültür polyploid trofoblast hücreleri diploid kök hücre gelişimi bu<em> Ex vivo</em> Sistem, sağlık ve hastalık, genom replikasyonu ve istikrarsızlık düzenleyici bir mekanizma nedenlerine açıklık için mükemmel bir araç. Burada Chiu yılında yayımlanan değişiklik ile önceki raporlara göre bir protokol<em> Ve ark.</em> 2008.

Protocol

Bu protokol, fare blastosist hazırlanması ve TS hücre hatlarının kurulması açıklanmaktadır. Doğal çiftleşme için set ve süper ovulasyon indüksiyon dahil olmak üzere blastosist koleksiyon, önce Genel fare manipülasyonlar temelde Nagy ve ark tarafından gösterilen standart bir protokol izleyin. 2003 (pp146 150). TS hücrelerinin türetilmesi ve bakım Kur, faiz fareler arasında üreme çapraz. Besleyici hücreler olarak fare embriyonik…

Discussion

Bu videoda, biz süreci TS hücre hatları kurmak için uteri ve deneysel prosedürleri E3.5 blastosist toplamak göstermektedir. Ayrıca stemness TS hücreleri korumak ve farklılaşmış hücrelerine farklılaşma ikna etmek için durumu açıklar. Saf TS hücre hatları elde etmek için iki kritik adımlar akıbet ayrıştırılmasıyla için zamanlama (adım 9) ve ilk geçiş işleme (adım 11). Bu geniş blastosist adım 11 (Kunath ve ark, 2005) TS kolonilerin adım 9 ya da aşırı çoğalma (>% 50 confluency) …

Materials

Reagents

TS medium:
RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 mM beta-mercaptoethanol and 100 mg/ml penicillin-streptomycin.

Mitomycin C:
Dissolve 2 mg mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS and add this 2 ml mixture into 200 ml TS medium (10 ng/ml). Make 20 aliquots (10 ml) and store at -20°C until use. Add one aliquot per 100 mm plate.

Mouse embryonic fibroblast-condition medium (MEF-CM):
Plate MEFs in 100 mm plates (1 x 10⁶/plate). Next day, add 10 ml TS medium per dish and continue to culture for 48 hours. Collect the culture medium, filter them (0.45 mm) and store at -20°C in 35 ml aliquots. Thaw each aliquot when needed which can be stored at 4°C. The MEFs can be used to prepare for two more batches of CM before they become confluent.

PBS/BSA:
Dissolve BSA, fraction V (Sigma A3311, 0.1% (w/v)) in PBS (10 ml), filter through a 0.45 mm syringe filter and make 1 ml aliquots in 1.5 ml tubes. Store at -70°C and thaw one tube when needed to prepare FGF4.

FGF4 (1000x):
Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) with 1 ml of the PBS/BSA solution. Mix well and make 10 aliquots (100 ml) into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw each tube when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 times in TS medium to obtain 1x FGF4 (25 ng/ml).

Heparin (1000x):
Resuspend heparin (Sigma H3149, 10,000 units) in PBS to a final concentration of 1 mg/ml (1000x). Make 100 ml aliquots into 1.5 ml tubes and store at -70°C. Thaw aliquots when needed and store the remaining at 4°C, do not re-freeze. Dilute 1000 time in TS medium to obtain 1x heparin (1 ng/ml).