Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR

Summary

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) is een doeltreffend instrument om mRNA niveaus te diagnosticeren in verschillende insecten weefsels en ontwikkelingsstadia. In dit rapport tonen we het gebruik van de qRT-PCR na te gaan mRNA niveaus in de verschillende weefsels en larvale ontwikkelingsstadia van de invasieve soorten insecten, smaragd as boor.

Abstract

Emerald as boor (EAB,

Protocol

Het complete protocol met verschillende stappen wordt afgebeeld in het stroomschema in figuur 1. Afzonderlijke stappen vormen dissectie, worden RNA-extractie, eerste streng cDNA-synthese en qRT-PCR hieronder beschreven.

I. larvale Dissection

1. Voorafgaand aan de start van deze procedure, plaats Emerald as boor, of EAB, larven op vochtig tissue papier tot dissecties worden uitgevoerd. Houd vers bereide 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing, of PBS, op ijs om de buffer te koud te houden gedurende de dissectie.
2. Om te beginnen, stelt de EAB larven op de dissectie plaat met fijne dissectie pinnen. Voeg vervolgens koud 1X PBS aan de dissectie plaat.
3. De eerste, onthoofden larven met een fijne paar van dissectie schaar. Verwijder vervolgens de laatste abdominale segment van de larven.
4. Met behulp van een horlogemaker tang, til de cuticula van de larvale karkas. Dan maakt een incisie over de lengte van het karkas met behulp van een schaar. Zorg ervoor dat u scheuren de darm als de incisie wordt gemaakt.
5. Zorgvuldig te isoleren middendarm weefsel van andere weefsels zoals vet organen en bindweefsel. Daarna, spoel het weefsel in verse 1X PBS buffer om ervoor te zorgen dat er geen besmetting van fatbody. Breng de geïsoleerde middendarm tot 500 ul van pre-gekoelde TRIzol reagens in een 1,5 ml Eppendorf buis.
6. Vervolgens isoleren het vet lichaam weefsel met behulp van een tang en breng het in een 1,5 ml Eppendorf buisje met 500 pi van gekoelde TRIzol reagens.
7. Tot slot, isoleren van de cuticula weefsel van de larvale karkas door sloop af daaraan klevend weefsel, zorg ervoor dat u de integriteit weefsel beschadigen. Spoel de geïsoleerde cuticula weefsel in verse PBS buffer en overbrengen naar een 1,5 ml Eppendorf buis met 500 pl van gekoelde TRIzol reagens.
8. De geïsoleerde dik lichaam, nagelriem en middendarm weefsel kan worden opgeslagen bij -80 ° C tot RNA-extractie.
9. Ter voorbereiding van RNA-extractie, sorteren van de verschillende EAB monsters volgens de ontwikkelingsstadia. Deze fasen zijn 1e-, 2e-, 3e-en 4e-stadia, prepupae en volwassenen.

II. RNA-extractie (Per fabrikant s-protocol voor het gebruik van TRIzol Reagens)

Homogenisering

1. Om te beginnen RNA-extractie, het eerste gebruik plastic stampers naar de weefsels homogeniseren in de TRIzol met 1,5 ml Eppendorf-buisjes. Na homogenisering, brengt het totale volume van elk monster tot1 mL met de TRIzol reagens.
2. Voor de ontwikkelingsstadia, homogeniseren hele dier in vloeibare stikstof met een mortier en een stamper. Voeg vervolgens een hoeveelheid van de homogenaat (50 ug) tot 1 ml TRIzol.

Fasescheiding:

3. Incubeer het monster buisjes met een mL TRIzol gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Na de incubatie, voeg 200μL van chloroform aan elke buis. Onmiddellijk na het toevoegen van chloroform, krachtig schudden van de buizen voor ongeveer 15 seconden. Dan, incubeer de buizen bij kamertemperatuur voor een extra 2-3 minuten.
5. Vervolgens centrifuge de monsters bij 12.000 xg gedurende 15 minuten bij 2 ° C. Na het centrifugeren, wordt het RNA in de waterige fase. Het volume van de waterfase moet 600 ul, of 60% van het totale volume TRIzol worden.

RNA neerslag

6. Verwijder voorzichtig alleen de waterige fase. Aanwezigheid van stoffen onder de waterige fase zal leiden tot vervuiling van het geëxtraheerde RNA. Dan overdracht van de waterige fase in een passend etiket 1,5 mL eppendorfbuisje.
7. Aan neerslag het RNA uit de waterige fase, mix 0,5 ml isopropylalcohol aan elke buis. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na de incubatie, centrifuge de buizen bij 12.000 xg gedurende 10 minuten bij 2 ° C.

RNA Wash

8. Na centrifugatie, gooi het supernatans van de buizen. RNA is aanwezig in de gel-achtige pellet gevormd op de bodem van de buis. Was de pellet met 75% ethanol, het toevoegen van ten minste 1 mL van 75% ethanol per 1 ml TRIzol. En door vortexen gemengd. Dan, centrifuge de buizen op 7500Xg gedurende 5 minuten bij 2 ° C.

RNA elutie

9. Verwijder het supernatant van de buizen. Weer Centrifugeer de buizen in de kleine tafel centrifuge gedurende 1 minuut. Verwijder eventuele overtollige supernatans van de buis door een zorgvuldige pipetteren. Laat de tube open en laat de pellet drogen aan de lucht gedurende 5-10 minuten. Wees voorzichtig niet meer dan drogen de korrel, omdat dit sterk zal dalen zijn oplosbaarheid.
10. Na het drogen aan de lucht, resuspendeer de pellet in diethylpyrocarbonate , of DEPC, behandeld water. De hoeveelheid water die wordt gebruikt om de pellet opnieuw in suspensie zal afhangen van de grootte van de pellet. Gebruik 50 ul van DEPC behandeld water voor een smalle pellet of 100 uL voor een grote pellet. Laat de pellet volledig in DEPC behandeld water op te lossen door het verplaatsen van de pipetpunt op en neer een paar keer.
11. Nadat de pellet is opgelost, plaats het monster bij 55 ° C gedurende 10 minuten.
12. Dan, het meten van de concentratie van elk RNA-monster met behulp van een Nanodrop spectrofotometer (2 pi van het RNA monster).
13. Bewaar het RNA monsters bij -80 ° C tot verder gebruik.

III. Eerste streng cDNA Synthese (Per fabrikant s-protocol met behulp van SuperScript eerste streng synthese kit van Invitrogen.)

1. Voor elk RNA-monster voeg de volgende in een PCR-buis:

   RNA	x ul
   10 mM dNTP mix M	1μl
   Oligo (dt) (0,5 pg / pl)	1 pi
   DEPC behandeld water	(8-x) ul
   Totaal Volume:	10 pi
   Let op: x is het volume van de RNA wordt gebruikt voor de cDNA synthese. Afhankelijk van de concentratie van het RNA, zal 2 tot 3 pg van RNA worden gebruikt voor elke reactie en het totale volume van elke reactie moet 10 pi te worden.

2. Plaats de bovenstaande reactie mix in een thermocycler bij 65 ° C gedurende 4 minuten.
3. Haal de buizen van de theromocyler en leg ze op ijs onmiddellijk gedurende minstens 2 minuten.
4. De voorbereiding van de eerste streng master mix door toevoeging van het volgende:

   10X RT Buffer	2μl
   25MM MgCl 2	4 pl
   0,1 M DTT	2 pi
   RNase uit	1 pi

5. Voeg 9 pl master mix aan elke buis met het RNA-monster, meng door pipetteren en centrifugeer het mengsel kort.
6. Plaats de buizen in de thermocycler en incubeer gedurende 2 minuten bij 42 ° C.
7. Pauzeer het thermocycler en voeg 1 pl Superscript II reverse transcriptase enzym (Invitrogen) aan elke buis. Deze stap moet snel worden gedaan.
8. Incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 1,5 uur.
9. Beëindig de reactie bij 70 ° C gedurende 15 minuten.
10. Haal de buizen van de thermocycler en plaats ze op ijs.
11. Voeg 1 ui van RNase H aan elke buis en plaats ze terug in de thermocycler bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
12. Na het nemen van de monsters uit de thermocycler, voeg 20 ul van nuclease-vrij water in elke buis. Het volume van elk monster wordt verdubbeld in dit stadium.
13. Controleer de concentratie van elk monster met behulp van 2 pi van het monster. Neem de hoeveelheid van elk monster, om de concentratie van 20ng/μl te maken voor gebruik in qRT-PCR. De hoeveelheid water te maken van de monsters naar een concentratie van 20ng/μl zal afhangen van de aanvankelijke concentratie van het cDNA gesynthetiseerd.

IV. qRT-PCR:

Primer Ontwerp en Bepaling van de referentie-gen

1. Ontwerp van primers met een smelttemperatuur (Tm) van 60 ° C en een product grootte van ~ 100 basispunten.
2. AP-PERI1 wordt gebruikt als het gen van belang zijn voor dit experiment. Een verwijzing gen of de interne controle is nodig voor latere analyse en normalisatie van de gegevens. Ribosomaal eiwit (AP-RP1) wordt gebruikt als de referentie-gen voor dit experiment.
3. Bereid 5UM werkvoorraden van de primers die gebruikt zullen worden, met inbegrip van uw referentie-gen.

Opstellen van normen

4. Om de efficiëntie van de primers gebruikte normen moeten worden gesteld te berekenen.
5. Maak een mix van het cDNA van de verschillende monsters die zal worden getest.
6. Maak 5x seriële verdunningen voor elk gewenst punt in de grafiek. Vier verdunningen zou genoeg moeten zijn, maar vijf zijn sterk aanbevolen.
7. Het volume is afhankelijk van hoeveel punten en hoeveel technische repliceert worden gebruikt. Er moet genoeg zijn om een ​​standaard voor elk gen wordt getest met inbegrip van het referentie-gen te maken.

Plaat Template

8. Ontwerp een sjabloon waarin de sample naam voor elke goed in de qRT-PCR-plaat. Vergeet niet om normen voor elk gen en ten minste twee technische duplo's per steekproef op te nemen.

Stel de fiets-parameters

9. Draai de qRT-PCR machine op en voer het fietsen parameters. Het fietsen parameters voor dit experiment is als volgt:
   Stap 1:
   • Een cyclus: 95 ° C 3 min
   Stap 2:
   • 40 cycli: 95 ° C 15 seconden, gevolgd door 60 ° C 30 sec
     (Optioneel: voor het bepalen van de smeltcurve omvat de volgende stappen)
   Stap 3:
   • Een cyclus: 95 ° C 1 min.
   Stap 4:
   • 1cycle: 55 ° C 1 min.
   Stap 5:
   • 81 cycli: 55 ° C 30 sec

Plaat opgezet voor CFX96 (BioRad) machine

11. Bereid de master mix voor elk gen (inclusief de referentie-gen) in aparte buis. Voor elke goed, de meester mix bestaat uit

    Nuclease gratis water	2μl
    2.5 X SYBR groen	4 pl
    Primer vooruit	1 pi
    Primer achteruit	1 pi
    Totale volume	8 ul

12. Bij de voorbereiding van de master mix zijn 1-2 extra reacties om rekening te houden pipetteren fouten.
13. Volgens de eerder ontworpen sjabloon, voeg 2 pl (20 ng / pl) van cDNA aan elk putje. Vervolgens voegt u 8 pi van de master mix in elk putje, wat resulteert in een totaal volume van 10 pi per reactie.
14. Pipet op en neer (2-3x) om te controleren of het monster goed gemengd is. Controleer of er geen vloeistof blijft op het puntje. Om te voorkomen dat kruisbesmetting, gebruik een nieuwe tip voor elk monster.
15. Zodra de hele plaat is ingesteld, bedek de plaat met optische tape. Vermijd het aanraken van de tape als de aanwezigheid van vet kan de lezing van invloed zijn. Dan, centrifuge de plaat bij 500 rpm gedurende 1 minuut om ervoor te zorgen dat alle producten in de putjes zijn aan de onderkant van de plaat.
16. Na centrifugatie, controleer of er geen ijs of water op de bodem van de plaat. Tot slot plaatst u de plaat in de qRT-PCR-machine en start het PCR-programma.

V. Schematische weergave van het Experiment

Figuur 1: Schema beeltenis van de volgorde van stappen voor de genexpressie te bestuderen.

Figuur 2: A) larven EAB dissectie zien middendarm in het midden. B) geïsoleerde middendarm van larvale EAB

Figuur 3: A) Gemiddelde relatieve expressie waarden (toerental) voor een peritrophin gen (AP-PERI1) in verschillende weefsels waaronder larven cuticula (Cu), middendarm (MG) ​​en vet organen (FB). Een EAB specifieke ribosomaal eiwit (hierin genoemd, AP-RP1) werd gebruikt als de interne controle voor het normaliseren van de gegevens verkregen voor het gen van belang, AP-PERI1. B) Relatieve voudige verandering van de AP-PERI1 in larvale weefsels. De nagelriem weefsel toonde de minst expressie en daarom werd genomen als de kalibrator (1X) monster (Pfaffl, 2001).

Figuur 4: A) Gemiddelde relatieve expressie waarden (toerental) voor een peritrophin gen (AP-PERI1) in verschillende ontwikkelingsstadia van EAB inclusief larve stadia (1e, 2e, 3e en 4e), prepupae (PP) en volwassenen (A). Een EAB specifieke ribosomaal eiwit (AP-RP1) werd gebruikt als de interne controle voor het normaliseren van de gegevens verkregen voor het gen van belang, AP-PERI1. B) Relatieve voudige verandering van de AP-PERI1 in verschillende ontwikkelingsstadia. De PP monster toonde de minst niveau van mRNA niveaus en daarom werd genomen als de kalibrator (1x monster).

VI. Conclusie

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) is een doeltreffend instrument om mRNA niveaus te diagnosticeren in verschillende insecten weefsels en ontwikkelingsstadia. Verder is qRT-PCR meestal is het belangrijkste instrument om gegevens gegenereerd uit high throughput genexpressie analyses zoals microarrays en de nieuwe generatie RNA-Seq valideren.

Discussion

De drempel cycli (Ct) waarde wordt verkregen voor elk monster in de qRT-PCR-plaat. Voor het maken van de standaard curve, is de Ct-waarde verkregen voor elke verdunning uitgezet tegen de log van de concentratie. De Ct-waarden voor de experimentele monsters werden vervolgens uitgezet op deze verdunningsreeks standaardcurve. Target hoeveelheden werden berekend op basis van aparte standaard curves gegenereerd voor elk experiment dat wil zeggen weefsel en ontwikkeling expressie. De relatieve expressie-waarden (toerental) werden vervolgens bepaald door de hoeveelheden van de doelwit sequentie van belang (in dit geval AP-PERI1) met de hoeveelheid verkregen voor de interne controle (AP-RP1). Voor berekeningen van betekenis, werden de logboeken van het toerental voor elk gen geanalyseerd met ANOVA (Analysis of Variance) met de PROC MIXED procedure van SAS (SAS Institute Inc SAS / STAT gebruikershandleiding s Guide, versie 9.1). Betekenis in expressie werd bepaald bij p <0,05. Relatieve veranderingen vouw in het geval van weefsels werden berekend door het nemen van de cuticula monster als de kalibrator (1X monster, Pfaffl, 2001). Daarom is de expressie niveaus in de middendarm en vet lichamen werden ten opzichte van de cuticula. In het geval van ontwikkeling expressie, was de prepupal monster genomen als de kalibrator. Voor beide studies, twee biologische herhalingen en drie technische repliceert werden gebruikt.

Ons experiment bleek significant (p <0,05) hogere niveaus van AP-PERI1 transcript in de middendarm weefsel (afb. 3) in vergelijking met andere weefsels getest. Tijdens de ontwikkeling van de voeding stadia (dwz de larvale stadia en volwassen) waren significant (p <0,05) hoger dan het prepupae monster (afb. 4). De minst mRNA niveaus werden berekend voor nagelriem en prepupae (figuur 3 & 4). Gezien het feit dat peritrophins zijn integraal onderdeel van het insect middendarm onze resultaten bevestigen eerdere bevindingen in andere insectensoorten (Mittapalli et al. 2007).. De patronen waargenomen tijdens de ontwikkelingsstadia verder te bevestigen dat de functie van de AP-PER1 de spijsvertering en-gerelateerde processen. De meest gebruikte Bacillus thuringiensis (Bt) toxinen in gewassen inderdaad doel en verstoren de PM bij insecten (Pauchet et al.., 2009). Daarom kunnen de resultaten in deze studie niet alleen onthullen potentiële controle doelstellingen voor EAB, maar ook fundamentele kennis over hoe invasieve soorten insecten aan te passen aan hun nieuwe omgeving.