Summary
כמותי בזמן אמת PCR (qRT-PCR) היא כלי יעיל לאבחון רמות ה-mRNA ברקמות חרקים שונים, שלבי התפתחות. בדוח זה אנו מציגים את השימוש qRT-PCR כדי לברר רמות ה-mRNA ברקמות הזחל שונים שלבי ההתפתחות של מינים פולשניים חרקים, דקור ברקת אפר.
Abstract
אמרלד אפר דקור (EAB,
Protocol
הפרוטוקול המלא עם השלבים השונים מתואר בתרשים הזרימה באיור 1. צעדים בודדים המהווים לנתיחה, מיצוי RNA, סינתזה סטרנד ראשון cDNA qRT ו-PCR מפורטים להלן.
I. Dissection הזחל
- לפני תחילת הליך זה, מקום אמרלד אפר דקור, או EAB, זחלים על נייר לח עד והניתוחים מבוצעים. שמור טרי פוספט 1X מוכן שנאגרו מלוחים, או PBS, על קרח כדי לשמור על קור חיץ לאורך כל הניתוח.
- כדי להתחיל, לתקן את הזחלים EAB על הצלחת דיסקציה עם סיכות לנתיחה בסדר. לאחר מכן, להוסיף קר 1X PBS הצלחת לנתיחה.
- ראשית, לערוף את הזחלים עם זוג מספריים בסדר לנתיחה. לאחר מכן להסיר את קטע בטן האחרונה של הזחלים.
- בעזרת זוג מלקחיים של שען, להרים את לציפורן מהגווייה הזחל. לאחר מכן, עושים חתך לאורכו של פגר באמצעות מספריים. יש להיזהר שלא לקרוע את המעיים כמו החתך מורכב.
- בזהירות לבודד את הרקמה midgut מרקמות אחרות כגון גופים שומן ורקמת חיבור. לאחר מכן, יש לשטוף את הרקמה במאגר טרי PBS 1X על מנת להבטיח כי אין זיהום fatbody. מעבירים את midgut מבודד μL 500 של מגיב מראש צונן Trizol ב צינור Eppendorf 1.5 מ"ל.
- בשלב הבא, לבודד את רקמת השומן בגוף באמצעות מלקחיים ולהעביר אותו לתוך צינור 1.5 Eppendorf מ"ל המכיל 500 μL של מגיב Trizol צונן.
- לבסוף, לבודד את הרקמה לציפורן מהגווייה הזחל ידי מבטל את כל רקמת דבקות, נזהר שלא לגרום נזק לרקמות שלמות. שטפו את הרקמה לציפורן מבודדים טרי PBS חיץ ולהעביר אותו צינור 1.5 Eppendorf מ"ל עם μL 500 של מגיב Trizol צונן.
- רקמות שומן מבודד, הגוף לציפורן ו midgut ניתן לאחסן -80 ° C עד מיצוי RNA.
- לקראת מיצוי RNA, למיין את דגימות EAB שונים לפי שלבי ההתפתחות. שלבים אלה כוללים 1-, 2-, 3, ו 4-instars, prepupae ומבוגרים.
השנייה. הפקת רנ"א (כמו פרוטוקול יצרן s לכל לשימוש מגיב Trizol)
Homogenization
- כדי להתחיל הפקת RNA, תחילה להשתמש pestles פלסטיק homogenize הרקמות של צינורות Trizol המכיל 1.5 מ"ל Eppendorf. לאחר homogenization, להביא את סך היקף מ"ל כל מדגם to1 עם מגיב Trizol.
- במשך שלבי ההתפתחות, homogenize חיים שלמים עם חנקן נוזלי ובמכתש. ואז להוסיף aliquot של homogenate (50 מיקרוגרם) ל 1 מ"ל של Trizol.
שלב ההפרדה:
- דגירה דוגמיות עם Trizol 1 מ"ל במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר דגירה, להוסיף 200μL של כלורופורם אל צינור אחד. מייד לאחר הוספת כלורופורם, לנער את צינורות בתוקף למשך כ -15 שניות. ואז, דגירה צינורות בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות נוספות.
- בשלב הבא, בצנטריפוגה דגימות XG 12,000 במשך 15 דקות 2 ° C. לאחר צנטריפוגה, RNA יהיה בשלב מימית. היקף השלב מימית צריך להיות 600 μl, או 60% מנפח Trizol מוחלט.
RNA משקעים
- בזהירות להסיר רק את השלב מימית. נוכחות של חומרים מתחת השלב מימית יגרום לזיהום של ה-RNA חילוץ. ואז, להעביר את השלב מימית לתוך צינור שכותרתו כראוי Eppendorf 1.5 מ"ל.
- כדי לזרז את הרנ"א משלב מימית, תערובת של 0.5 מ"ל אלכוהול איזופרופילי על צינור אחד. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר דגירה, צנטריפוגה הצינורות בבית XG 12,000 עבור 10 דקות 2 ° C.
RNA שטפי
- בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant מן הצינורות. RNA נמצא את הג'ל כמו גלולה נוצר בחלק התחתון של הצינור. שטפו את הכדור עם אתנול 75%, והוסיף לפחות 1 מ"ל של אתנול 75% לכל 1 מ"ל של Trizol. מערבבים על ידי vortexing. ואז, צנטריפוגה הצינורות בבית 7500Xg במשך 5 דקות ב 2 ° C.
RNA elution
- בטל supernatant מן הצינורות. צנטריפוגה הצינורות שוב בצנטריפוגה שולחן קטן דקה 1. הסר את כל supernatant עודף מהצינור על ידי pipetting זהיר. השאירו הצינור פתוח ולתת את האוויר גלולה יבש למשך 5-10 דקות. היזהר שלא מעל לייבש את גלולה כמו זה יהיה להקטין באופן ניכר את המסיסות שלו.
- לאחר ייבוש באוויר, resuspend גלולה ב diethylpyrocarbonate , או DEPC, מים מטופלים. כמות המים המשמשים resuspend גלולה יהיה תלוי בגודל של גלולה. השתמש 50 μL מים מטופלים DEPC עבור מ"רכל μL גלולה או 100 עבור גלולה גדולה. בואו גלולה לחלוטין מתמוססים במים שטופלו DEPC ידי הזזת קצה פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים.
- לאחר גלולה נמס, המקום מדגם ב 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- ואז, למדוד את הריכוז של כל דגימה RNA באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop (2 μL המדגם RNA).
- חנות דגימות רנ"א ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
ג. סטרנד ראשון סינתזה cDNA (כמו פרוטוקול יצרן s לכל באמצעות סינתזה עילי first ערכת גדיל ידי Invitrogen).
- עבור כל דגימה RNA להוסיף את הדברים הבאים צינור PCR:
RNA x μl 10mm dNTP לערבב M 1μl אוליגו (dt) (0.5 מיקרוגרם / μl) 1 μl DEPC טיפול במים (8-x) μl סה"כ נפח: 10 μl הערה: x הוא נפח של RNA המשמש לסינתזת cDNA. בהתאם לריכוז של רנ"א, 2-3 מיקרוגרם של רנ"א ישמש התגובה לכל הנפח הכולל של כל תגובה צריכה להיות 10 μl. - מניחים את תערובת התגובה לעיל thermocycler על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
- הסר את הצינורות מן theromocyler ומניחים אותם על קרח מיד 2 דקות לפחות.
- הכן את המאסטר הראשון גדיל לערבב ידי הוספת את הדברים הבאים:
מאגר 10X RT 2μl 25mm MgCl 2 4 μl 0.1M DTT 2 μl RNase החוצה 1 μl - הוסף 9 μl של תמהיל המאסטר הצינור המכיל את כל מדגם RNA, לערבב ידי pipeting ו בצנטריפוגה בקצרה תערובת.
- מניחים את הצינורות בחזרה thermocycler ו דגירה במשך 2 דקות על 42 ° C.
- השהה thermocycler ולהוסיף 1 μl של כתב עילי השנייה הפוכה transcriptase אנזים (Invitrogen) על צינור אחד. צעד זה צריך להיעשות במהירות.
- דגירה דגימות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות.
- לסיים את התגובה על 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- הסר את הצינורות מן thermocycler ומניחים אותם על הקרח.
- הוסף 1 μl של RNase H כדי צינור לכל מקום אותם בחזרה thermocycler ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
- לאחר לקיחת דגימות מתוך thermocycler, מוסיפים 20 μl מים nuclease ללא בצינור אחד. היקף כל דגימה היא הכפילה בשלב זה.
- בדוק את ריכוז של כל דגימה באמצעות 2 μl של המדגם. קח aliquot של כל דגימה, כדי להפוך את הריכוז של 20ng/μl לשימוש qRT-PCR. כמות המים לפצות את דגימות ריכוז של 20ng/μl יהיה תלוי בריכוז ההתחלתי של cDNA מסונתז.
IV. qRT-PCR:
פריימר עיצוב וקביעת גן התייחסות
- עיצוב primers עם טמפרטורת התכה (TM) של 60 מעלות צלזיוס גודל תוצר של ~ 100bp.
- AP-PERI1 משמש הגן עניין של ניסוי זה. גן הפניה או הבקרה הפנימית נדרשת לניתוח נורמליזציה מאוחר יותר של הנתונים. חלבון ריבוזומלי (AP-RP1) משמש הגן התייחסות לצורך הניסוי הזה.
- הכן את מניות הפועלים 5uM של primers אשר ישמשו, כולל גן לעיונך.
הכנת תקנים
- כדי לחשב את היעילות של primers בשימוש תקני צריך להיעשות.
- הכן תערובת של cDNA מן מדגמים שונים כי ייבדקו.
- הפוך את דילולים סדרתי 5X עבור כל נקודה הרצוי בגרף. ארבעה דילולים צריך להיות מספיק אבל חמישה מומלץ ביותר.
- היקף ישתנו בהתאם כמה נקודות וכמה טכני משכפל נמצאים בשימוש. צריך להיות מספיק כדי לעשות תקן גן כל נבדק, כולל הגן התייחסות.
פלייט תבנית
- עיצוב תבנית המציין את שם המדגם עבור היטב כל צלחת qRT-PCR. זכור לכלול סטנדרטים עבור כל גן ולפחות שתי טכניות משכפל לדגימה.
הגדרת הפרמטרים רכיבה על אופניים
- כבה את המכשיר qRT-PCR על ולהזין את הפרמטרים רכיבה על אופניים. הפרמטרים אופניים לצורך הניסוי הזה הוא כדלקמן:
שלב 1:- מחזור 1: 95 ° C 3 דקות
- 40 מחזורים: 95 ° C 15 שניות ואחריו 60 ° C 30 שניות
(אופציונאלי: לקביעת עקומת התכה כוללות את הפעולות הבאות) שלב 3: - מחזור 1: 95 ° C 1 דקות
- 1cycle: 55 ° C 1 דקות
- 81 מחזורים: 55 ° C 30 שניות
פלייט להגדיר עבור CFX96 (BioRad) מכונה
- מכינים את תערובת אב כל גן (כולל הגן הפניה) בצינור נפרד. במשך כל טוב, תמהיל אמן מורכב
Nuclease מים חינם 2μl 2.5 X SYBR ירוק 4 μl פריימר קדימה 1 μl פריימר הפוכה 1 μl סך נפח Μl 8 - בזמן הכנת תערובת מאסטר כוללים 1-2 תגובות נוספות כדי להסביר שגיאות pipetting.
- על פי התבנית נועדה קודם לכן, להוסיף 2 μL (20 ng / μL) של cDNA זה היטב. לאחר מכן, להוסיף 8 μL של תמהיל האב היטב לכל, והתוצאה היא בהיקף כולל של 10 μL לכל תגובה.
- פיפטה למעלה ולמטה (2-3X) כדי לוודא המדגם הוא מעורב היטב. בדוק כי לא נשאר נוזל על קצה. כדי למנוע זיהום לחצות, השתמש טיפ חדש מדגם זה.
- לאחר הצלחת כולה ההתקנה, מכסים את הצלחת עם הקלטת אופטי. הימנע מנגיעה את הקלטת כמו נוכחות של שומן יכולים להשפיע על הקריאה. ואז, צנטריפוגה את הצלחת ב 500 סל"ד במשך דקה 1 על מנת להבטיח כי כל המוצרים בבארות הם בתחתית הצלחת.
- בעקבות צנטריפוגה, לבדוק כי אין קרח או מים בתחתית הצלחת. לבסוף, במקום את הצלחת מכונת qRT-PCR ו להפעיל את תוכנית ה-PCR.
V. ייצוג בתרשים של הניסוי
איור 1: תרשים זרימה המתאר את בסדר רציף של צעדים ללימוד ביטוי גנים.
איור 2: א) הזחל לנתיחה EAB מראה midgut באמצע. ב) מבודד midgut של הזחל EAB
איור 3: A) ממוצע ערכים ביטוי יחסית (סיבובים) עבור גן peritrophin (AP-PERI1) ברקמות שונות, כולל הזחל לציפורן (Cu), midgut (מ"ג) וגופים שומן (FB). חלבון ספציפי EAB ריבוזומלי (בשם בזאת, AP-RP1) שימש הבקרה הפנימית על נירמול הנתונים שנתקבלו עבור הגן של עניין, AP-PERI1. ב) שינוי לקפל יחסית של AP-PERI1 ברקמות הזחל. הרקמה לציפורן הראה את הביטוי לפחות ולכן נלקח כמו כיל (1X) מדגם (Pfaffl, 2001).
איור 4: א) ממוצע ערכים ביטוי יחסית (סיבובים) עבור גן peritrophin (AP-PERI1) בשלבים התפתחותיים שונים של EAB כולל instars הזחל (1, 2, 3 ו - 4), prepupae (PP) ומבוגרים (A). חלבון ריבוזומלי EAB ספציפיים (AP-RP1) שימש הבקרה הפנימית על נירמול הנתונים שנתקבלו עבור הגן של עניין, AP-PERI1. ב) שינוי לקפל יחסית של AP-PERI1 בשלבים התפתחותיים שונים. מדגם PP הראו את רמת לפחות של רמות ה-mRNA, ולכן נלקח כמו כיל (1X לדוגמה).
VI. מסקנה
כמותי בזמן אמת PCR (qRT-PCR) היא כלי יעיל לאבחון רמות ה-mRNA ברקמות חרקים שונים, שלבי התפתחות. יתר על כן, qRT-PCR הייתה בעיקר כלי מפתח כדי לאמת את הנתונים המופקים מן הגן תפוקה גבוהה מנתח הביטוי כגון microarrays ואת הדור החדש RNA-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחזורי הסף (CT) מתקבל ערך למדגם כל צלחת qRT-PCR. להכנת עקומת תקן, ערך ה-CT שהתקבלו עבור כל אחד מהם היה דילול זממו נגד ביומן של ריכוז שלה. ערכי ה-CT של דגימות הניסוי היו זממו אז על זה עקומת סדרה דילול סטנדרטי. כמויות יעד חושבו מתוך עקומות תקן נפרד שנוצר עבור כל ניסוי כלומר רקמות ואת הביטוי ההתפתחותי. ערכים הביטוי יחסית (סיבובים) נקבעו אז על ידי חלוקת כמויות רצף היעד של עניין (במקרה זה AP-PERI1) עם כמות המתקבלים על הבקרה הפנימית (AP-RP1). עבור חישובים של משמעות, היומנים של סיבובים עבור כל גן נותחו על ידי ANOVA (ניתוח שונות) באמצעות ההליך proc מעורבת של SAS (SAS Institute חברת SAS / STAT מדריך למשתמש, גרסה 9.1). משמעות ברמת ביטוי נקבע על p <0.05. שינויים לקפל יחסית במקרה של רקמות חושבו על ידי לקיחת דגימה לציפורן כמו כיל (1X המדגם, Pfaffl, 2001). לפיכך, רמות ביטוי הגופים midgut ושומן היו יחסית לציפורן. במקרה של ביטוי התפתחותי, המדגם prepupal נלקח כמו כיל. עבור שני המחקרים, שני משכפל ביולוגיים ושלושה טכני משכפל היו בשימוש.
הניסוי שלנו עולה באופן משמעותי (p <0.05) רמות גבוהות יותר של תמליל AP PERI1-ברקמת midgut (איור 3) בהשוואה לרקמות אחרות assayed. במהלך הפיתוח בשלבים האכלה (כלומר instars הזחל והמבוגר) היו באופן משמעותי (p <0.05) גבוה יותר מאשר במדגם prepupae (איור 4). רמות ה-mRNA לפחות חושבו לציפורן ו prepupae (איורים 3 ו -4). בהתחשב בכך peritrophins הם מרכיב בלתי נפרד של midgut החרק התוצאות שלנו לאשש ממצאים קודמים של מינים חרקים אחרים (Mittapalli et al. 2007). הדפוסים שנצפו במהלך שלבי התפתחות נוספת לאשר את הפונקציה של AP-PER1 ב העיכול תהליכים הקשורים. Thuringiensis בשימוש נרחב בצילוס (Bt) רעלנים בצמחים היבול אכן היעד לשבש את PM ב חרקים (Pauchet et al. 2009). לפיכך, התוצאות שהתקבלו במחקר זה לא רק לחשוף את מטרות הבקרה פוטנציאל EAB אלא גם לספק ידע בסיסי לגבי איך מינים פולשניים חרקים להסתגל לסביבות החדש שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מכירים את העזרה המסופק על ידי דלתא לורדס Arrueta Antequera (המחלקה לאנטומולוגיה, אוהיו סטייט / OARDC, ווסטר, OH) של ההתקנה של הניסויים. אנו מודים ד"ר תרז פולין (USDA, שירותי יער, NRS) עבור לשלוח דגימות EAB הזחל. עזרה מסופק על ידי ד"ר לואיס סימון קאניאס ו נוריס M אקוסטה עם ההתקנה מיקרוסקופ מוערכת. המימון לפרויקט זה סופק על ידי קרנות המדינה הפדרלי השתלט על החקלאי אוהיו מרכז מחקר ופיתוח, אוניברסיטת מדינת אוהיו.
References
- Lehane, M. J. Peritrophic matrix structure and function. Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).
- Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say]. Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).
- Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol. 39, 403-413 (2009).
- Pfaffl, W. M. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).
- Tellam, R. L. Biology of the Insect Midgut. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).
