Summary
En
Abstract
Distinkta arter av
Protocol
1. Infektion av små djur med transgena Leishmania
1. Parasit linjer
Transgena Leishmania spp.. parasiter uttrycka luciferas genereras med en episomal eller en integrerande vektor som rapporterats. 1 2 klonal linjer är att föredra. Två viktiga punkter:
(A)-luciferas är att föredra framför episomal luciferas, eftersom det i teorin dessa parasiter linjer bör hålla oss till den transgenen i frånvaro av drogen tryck, dvs efter idrifttagandet ett däggdjur. Men även integrerade transgenerna kan gå förlorade vid låga priser, 3 så det är viktigt att behålla selektiva läkemedel trycket på beståndet kulturen. I praktiken Leishmania spp.. ofta behåller episomal element under längre tidsperioder även in vivo, dock med variation i plasmid antal kopior per cell. 4 För båda typerna av transgena parasit, bör de alltid gått in vitro en tid före ympning på djur för att undvika eventuella läkemedelseffekter.
(B) Leishmania spp.. parasiter kan förlora virulens vid in vitro-kultur. Hos vissa arter (t.ex. L. donovani, L. infantum chagasi) denna förlust kan ske snabbt under veckor av kultur. I andra arter (t.ex., L. major, L. mexicana) är virulens kvar längre sikt, till månader till år. Trots det bör klonal transfectants vara skärmad för att identifiera de behåller det fulla virulens för små djur. Många Labs kommer seriellt passera parasiter flera gånger (4 eller mer) genom möss eller hamstrar för att förstärka virulens innan de används i experiment.
2. Beredning av scenen infektiösa metacyclic parasiter för infektion
Det smittsamma formen av Leishmania spp.. som överförs av sand flyga till däggdjur värd är metacyclic promastigote. 5 Därför djur infektioner med denna form av parasiten föredra som en modell för naturlig infektion. Även sand flugor är svåra att underhålla, kommer parasiter odlas in vitro genomgå bekvämt metacyclogenesis. I procent av metacyclics närvarande i en kultur varierar med antalet överfarter sedan isolering från djuret, media kultur och arter parasit och stam.
Metacyclics kan renas genom positiva eller negativa val beroende på art och raden av Leishmania. Förändringar i terminal eller sidokedjan rester kolhydrater i riklig ytan lipophosphoglycan (LPG) av L. stora så att den kan renas med förlust av agglutination med lektin PNA (jordnöt agglutinin). 5,6 Övriga Leishmania arter eller L. stora mutanter som saknar metacyclic gasol kan renas på ett Ficoll steg lutning. 7 IVIS kan utföras med större delen icke-renat kulturer, men det bör vara medveten om att dessa innehåller en blandning av metacyclic och mindre smittsamma former.
Normalt 15-20% av bulk stationär fas L. i. chagasi kulturer återvinns som metacyclics med parasiter som har isolerats inom 3 veckor från en hamster eller mus. Parasiter tvättas genom centrifugering, upphängda till önskad koncentration i buffert (HBSS eller PBS, med eller utan Ca 2 + och Mg 2 +), och upprätthålls vid 4 ° C i upp till 2 timmar före ympning på musen.
3. Val av rutt för ympning av Leishmania spp.. i den mottagande
Den kliniska sjukdomen manifestationerna av mänskliga leishmaniasis varierar beroende på både arter av parasiten och faktorer som värd. Det finns motsvarande skillnader i murina infektion, vilket leder utredarna att använda olika modeller och smittvägar. Till exempel är arter orsakar mänskligt CL (t.ex. L. major, L. mexicana, L. amazonensis) ofta inokuleras i möss subkutant i footpad eller intradermalt i örat. 8,9 arter orsakar mänskligt VL ofta introduceras intravenöst genom en svans ven 10-12 eller intradermalt i örat. har 13 svansvenen infektioner utförts antingen med hamster-derived amastigotes eller promastigotes. Vi infektera rutinmässigt möss med promastigote form av L. i. chagasi, antingen intradermalt i örat eller i sidled böjd regionen 14 eller intravenöst.
4. Förbehandling av möss med narkos
Vildtyp, transgena eller gen knockoutmöss kan användas. Även om inte formellt, kvantifieras, är det troligast att nakna eller albino som BALB / c möss möjliggöra större ljusgenomsläpp genom vävnad jämfört med möss med mörk hud och hår pigment som C57BL / 6.
Injicerbara anesthestic medel såsom en blandning av ketamin plus xylazin [80-100 mg / kg + 10 mg / kg respektive intraperitoneally (IP)] spätts i koksaltlösning är en metod som föredras, eftersom djuren blir lätt sövd i minst 10 minuter med en enda dos. 100-200ul totala volymen injiceras IP med en 25-30 gauge nål. Djuren manuellt fastspända ordentligt av sin rygg huden med buken uppåt och huvudet pekade nedåt. Nålen skall placeras med fasade upp och något vinklad. Spetsen på nålen bara något tränga in i nedre vänstra kvadranten av bukväggen.
Inhalationsmedel anestesimedel som isofluran kan omväxlande användas, men djur kommer endast stå under narkos så länge de är inhalation av anestesimedel.
5. Infektion av möss med Leishmania spp.. parasiter
När djuren är lätt bedövad, är infektionen sajter rengöras med 70% etanol eller isopropylalkohol. Parasiten arter, dos och smittväg bestäms av prövaren. Injektionsvolymen bör minimeras för att förhindra alltför stora vävnadsskador för intradermal (10 l) eller intramuskulär (25-50 l) smittvägar. Den tillåtna injektionsvolymer på möss kan vara större för intravenös (100-200 l), subkutan (upp till 2 ml) eller intraperitoneal (upp till 2 ml) smittvägar.
Smittvägar och volymer som används i våra experiment inkluderar intradermala i örat ytterörat (10 l), subkutan i flanken (100-200 l), intraperitoneal (100-200 l) eller intravenös (100-200 l). Parasit doser har varierat från 10 Februari - 10 Juli promastigotes.
2. Bioluminescent avbildning av Leishmania använda IVIS (in vivo imaging system)
1. Beredning av D-luciferin för in vivo självlysande imaging
D-luciferin (Bromsok Lifesciences) bereds till en koncentration av 15 mg / ml i Dulbecco är PBS med eller utan Mg 2 + och Ca 2 +, och sprutan filtreras (0,2 mikrometer). Alikvoter är frysta vid -80 ° C fram till användning. Före injektion luciferin värmts till 37 ° C i ett vattenbad.
2. Injektion av D-luciferin
Injektionsstället är rengjorda och luciferin införs i medvetande djur genom en intraperitoneal injektion av 15 mg / ml luciferin lösning i DPBS, vid en dos på 150 mg / kg. Luciferin kan också injiceras i anestesi-behandlade djur, men mareld kinetiken kan variera något.
När injiceras i djur, cirkulerar luciferin snabbt. Det är nyttigt att empiriskt fastställa den optimala tiden att skaffa självlysande data efter luciferin injektion för varje experimentell modell och för olika anatomiska platser på möss, eftersom kinetik luciferin fördelning kan variera. En kinetisk kurva genereras genom att förvärva en sekvens av replikera bilder.
3. Djur är lätt sövd
Inhalant eller Injektionsanestetika kan användas för att avbilda förfarande. Isofluran är enklare att administrera detta skede, eftersom de flesta IVIS system har en bifogad narkos kammare och anestesi noskon fördelaren inne i bildbehandling kammaren. Den anestesi delas mellan den anestesi kammaren och fördelaren inne i bildbehandling kammaren.
Djuren är placerade i tydliga Plexiglas anestesi kammare och lätt sövda med 2,5-3,5% isofluran. Djur är visuellt kontrolleras för att säkerställa en effektiv grad av anestesi har inducerad och att deras andning är obehindrat. Tillräcklig grad av anestesi kontrolleras av brist på uttag från smärtsamma tass tryck. Mängden isofluran kan sänkas till 1,5-2% efter djuren är lätt sövd.
4. Bioluminescent data samlas in
Tillräckligt sövda djur överförs från anestesi kammaren till avbildning kammaren och placeras så att näsan konerna ansluten till grenröret kommer att leverera en kontinuerlig och reglerat flöde av isofluran.
The Living Image programvara (klave Life Sciences) öppnas och IVIS initieras. För våra experiment använder vi Xenogen IVIS 200-systemet (klave Life Sciences). Den CCD-kamera automatiskt kylas och underhållas på lämplig temperatur efter initieras IVIS. Kameran systeminställningsprogrammet och bild parametrar förvärv sätts i IVIS System Control Panel. Förvärvet parametrar är till stor del baseras på antalet djur och intensiteten i mareld. Viktiga parametrar är: imaging läge (självlysande eller lysrör), exponeringstid (tid som slutaren är öppen), binning (bestämmer pixelstorlek på CCD), fokus och med förbehåll höjd (fokalplan), f / stop (maskstorlek) och synfält (FOV). Den förinställda FOVs (kvadratisk bild regioner) för IVIS Imaging System 200-serien är 4, 6,5, 13, 20 och 25 cm (bredd FOV).
Genom att trycka förvärva eller förvärvar kontinuerlig bilder i IVIS System Control-fönstret initierar bild och datainsamling på IVIS. Förvärv tider kan variera från några sekunder upp till flera minuter. För våra experiment använder vi 60 andra inställningen standard exponering.
En närbild bild (små FOV) kan ge högre upplösning, men inte nödvändigtvis ökad känslighet jämfört med en tagen bild med hjälp av en större FOV.
Efter bildbehandling förfarandet är djur bort från avbildning kammare, återvände till sina burar och övervakas tills de återhämta sig från narkosen.
7. Dataanalys
Den luminiscens data analyseras med programmet Living Image (Xenogen) och motsvarar ljusstyrkan uttryckt som antalet fotoner detekteras av CCD-kameran. Dessa data representeras av en pseudo-färgbild som överlagras på ett svartvitt fotografi av djuren. Särskilda områden av bilden kan analyseras genom att skapa regioner av intresse (ROI). The Living bildbehandlingsprogram ger en rad olika alternativ utdata. Ett av de enklaste sätten att analysera data är att välja en region av intresse (ROI) och mäta den genomsnittliga # av fotoner / sekund som upptäcks. Dessa data kan sedan exporteras till ett kalkylark som Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation). GraphPad Prism (GraphPad Software) senare användas för att generera diagram för detta manuskript.
3. Representativa resultat
Sammanfattning:
IVIS tekniken möjliggör visualisering av luciferas som uttrycker Leishmania spp.. parasiter i levande sövda BALB / c möss i realtid. När substratet luciferin distribuerar genom vävnaderna, orsakar en snabb oxidation av D-luciferin av luciferas uttrycks av transgena parasiter ljus avges. De fotoner som inte absorberas av vävnaden upptäcks på ytan av de animaliska CCD kamera av IVIS bildteknik.
1. Modeller av infektion med parasiter som orsakar mänskliga viscerala kontra mänskliga kutan leishmaniasis.
Musmodeller av visceral leishmaniasis är mer problematiskt än modeller av kutan leishmaniasis, eftersom utvecklingen av infektion kräver dödshjälp av grupper av möss i varje bedömas tidpunkt. En begränsning av IVIS är att ljuset utsläppen är släckt i olika grad i olika viscerala vävnader och vävnader med högt blodflöde såsom lever och mjälte kan vara mer problematiskt än hud. Därför kan IVIS inte vara så känsliga för detektion av luciferas-uttryckande parasiter i lever och mjälte som i huden. Det är också tillrådligt att parasit belastning inte bör jämföras mellan vävnad platser. Ändå kan parasit belastningar i samma vävnader jämföras mellan åldersmatchade infekterade möss av samma stam.
Den luciferas signalen lätt detekteras i inre organ i våra experiment, att underlätta jämförelse av infektioner mellan djur. Ett exempel på en 5-veckors infektion med en luciferas-uttryckande parasiten orsakar mänskligt visceral leishmaniasis, Li. chagasi SSU/IR1SAT-LUC (A), visas i figur 1. Efter 5 veckor på infektion, kan visceralized parasiter påvisas i levern hos alla möss och i mjälte hos möss 1 och 2. Figur 2 visar en dostitrering med samma parasit linje, en timme efter införandet av parasiten. Ett exempel på ett längsgående infektion med parasiter som orsakar mänskligt kutan leishmaniasis, L. Mexicana SSU/IR1SAT-LUC (A), visas i figur 3.
2. Kinetiken av luciferas upptäckt.
Preliminära kinetiska studier är nödvändiga för att maximera detektering av fotoner som avges från den självlysande parasiter. Det är viktigt att bestämma detta empiriskt, eftersom den optimala avbildning tiden kommer sannolikt att variera beroende på antalet och ljusstyrka av parasiten isolera och på anatomiska lokalisering av självlysande mikroorganismer i möss. Den kinetiska studier är beroende av graden av luciferin spridning i vävnaderna, musen vävnaden hyser luciferas-uttryckande Leishmania, och effektiviteten i luciferas uttryck / enzymaktivitet i varje parasit isolera. Möss är smittade och inokuleras med luciferin som beskrivits ovan, och en sekvens av bilder samlas varje 2 minuter efter luciferin injektion. Omfattningen av utsända ljuset är kvantifierad och diagram för att bestämma den maximala upptäckt punkt (se exempel i Figur 1B). När tiden för maximalt ljus upptäckt bestäms bör alla bilder i försöket använder samma tidpunkt avbildning efter ympning av luciferin, som i Figur 1A. Vår kinetiska studiervisade en topp luciferas signal från levern hos möss infekterade IV med L. i. chagasi mellan 10 och 25 minuter efter ip luciferin inokulering (Figur 1B).
3. Bedöma effektiviteten hos parasiten inokulationen.
IVIS kan användas för att uppskatta konsekvens och effektivitet i första infektionen med luciferas-uttryckande Leishmania spp.. Så länge samma rutt används för varje djur kan avges fotoner kan användas som en grov uppskattning av ympning effekt. Ett exempel visas i figur 2, där BALB / c möss inokulerat med angivna antalet metacyclic L. i. chagasi promastigotes, en visceralizing art av Leishmania. En timme efter infektion möss inokulerades med luciferin IP, och efter 20 minuter bilder togs. Figuren visar svartvit bild ensam (figur 2A) och bilden överdrog med pseudo-färgade luminiscens (Figur 2B). Figur 2c visar antalet fotoner som avges från utvalda områden av intresse (ROI) från musen bilder.
Exemplet i figur 2 visar att infektionen dosen är direkt proportionell mot gradering av fotoner som avges med allt fler parasiter. Uppgifterna visar att, i likhet med L. stora och L. Mexicana, avbildning av kutana infektioner med Leishmania spp.. är mycket känslig, vilket gör att färre än 10 4 parasiter att tydligt visualiseras. Uppgifter som dessa kan användas för att kvantifiera infektion intensitet. I exemplet som visas i figur 2B finns det cirka 1 fotoner / sek / parasit.
4. Övervakning loppet av infektion hos möss.
Musmodeller av kutan leishmaniasis använda karakteristiskt lesion storlek som en åtgärd för att följa infektioner longitudinellt. Även en god uppskattning av sjukdomsprogression är lesion storlek påverkas av graden av inflammatorisk respons förutom graden av parasiten replikering i vävnader. Möss måste avlivas i slutet av försöket att faktiskt mäta parasit belastning. IVIS kan användas för att uppskatta utvecklingen av parasiten laster längsgående i kutan vävnad av möss infekterade med Leishmania arter som orsakar kutan leishmaniasis. Visats i figur 3, var BALB / c möss inokuleras subkutant dag 0 med 10 5 L. Mexicana uttrycka luciferas och avbildat på den sekventiella veckor efter smittotillfället. Figur 3A visar representativa bilder på 10-31 veckor efter smittotillfället. Samma data visas i kvantitativ form i figur 3B. Viktigare, kan antalet parasiter på infektionsplatsen kvantifieras genom IVIS innan en skada kan upptäckas med andra metoder.
Med tiden motsvarar progressiv ökning av mareld till en ökning av parasit antal. Signalstyrkan, dvs fotoner / parasit / sekund, kan variera som en funktion av parasit nummer, vävnad plats, tillväxtfas och parasit hälsa in vivo. Det är därför viktigt att kalibrera relationen mellan parasiter och luminiscens innan förutsatt att bioluminescens är direkt proportionell mot parasit nummer. Vid L. stora 15 eller L. Mexicana, 16 verkar vara relativt liten dämpning av mareld i amastigotes inom footpad lesioner i förhållande till promastigotes. Preliminära data tyder på att dämpningen kan bli djupare för L. chagasi infantum 17 eller L. braziliensis. 15
Figur 1. Kinetiken av luciferas upptäckt. Kinetisk analys av luciferin distributionen utfördes för att fastställa den optimala tiden för avbildning Leishmania-infektion i levern. Möss infekterade IV med 10 7 L. i. chagasi pIR1SAT-Luc (A). A) Fyra infekterade möss avbildade tillsammans med en oinfekterade musen efter 5 veckors infektion. Luciferin injicerades ip i alla fem möss och bilder samlades in varannan minut i 24 minuter. ROI valdes ut och luminiscens mättes och kvantifieras (B).
Figur 2. Bedöma effektiviteten hos parasiten inokulationen. Och Imaging kvantifiera självlysande Leishmania parasiter vid infektion med IVIS. Vildtyp BALB / c möss injiceras intradermalt i det nedre högra flanken med HBSS (håna) eller transgena Leishmania i. chagasi L. i. chagasi pIR1SAT-Luc (A). Mössen har sedan analyserats med IVIS bildteknik en timme efter ympningen. A) Ett svartvitt fotografi av mössen togs omedelbart före självlysande signalen (ljusintensitet) mättes. Röda pilarna pekar på injektionsstället vid varjedjur. B) pseudo-färgbild av luminiscens var överlagrade på fotografiet. C) Regioner av intresse (ROI) valdes ut (röda cirklar) och luminiscens kvantifierades i varje ROI. De data som representerar nätet ljusflöde av infekterade ROI minus ROI för mock smittade.
Figur 3. Långvarig infektion med parasiten orsakar mänskligt kutan leishmaniasis. Tidsförloppet utvärdering av parasitära börda hos ett enskilt djur injiceras med självlysande Leishmania mexicana pIR1SAT-Luc (A). En vild-typ BALB / c mus injicerades subkutant i hasen med 100.000 stationär fas transgena Leishmania mexicana pIR1SAT-Luc (A). IVIS Uppgifterna samlades in från den infekterade musen på angivet antal veckor efter infektion. A) Pseudo-färgade bilder av luminiscens var överlagras på svart-vita fotografier från motsvarande tidpunkter. B) netto avkastning bestämdes genom att mäta luminiscens i den infekterade hasen och subtrahera bakgrunden ROI från kontralaterala oinfekterade hasen var plottas. I punktdiagram representerar netto avkastning vid olika tidpunkter efter infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo imaging-system (IVIS) ger en metod för hela djuret avbildning eller in vivo imaging experimentell infektion modeller av olika former av leishmaniasis. 18,16 Den Leishmania spp.. parasiter kan vara konstruerad för att uttrycka eldfluga luciferas på en nivå som upptäcks in vivo med IVIS bildteknik. En av de stora fördelarna med denna metod är att det tillåter icke-invasiv visualisering av Leishmania spp.. inuti levande djur värd. Denna metod har tillämpats på andra smittsamma sjukdomar modeller med hjälp av smittämnen som kan uttrycka transgener. 19 20 Dessutom har IVIS använts som modell för att utvärdera läkemedelsbehandling av Leishmania stor infektion i huden av C57BL / 6 möss. 16,21
Det finns några viktiga förbehåll och begränsningar av denna metod. Styrkan i ljussignal som upptäckts av CCD-kameran kan påverkas av placeringen av parasiter i däggdjur värd, av styrkan i luciferas uttryck i parasiter, av tillgången på co-faktorer för oxidation reaktion av D-luciferin och genom absorption av ljus genom överliggande vävnader. Dessutom är signalstyrkan i lever och mjälte svagare i nivå med fotoner per parasit per sekund än signalen i huden, sannolikt på grund av härdning av lokala blodtillförseln och vävnader överliggande. Kvantifiering av den utsända fotoner kan användas för att jämföra progressiv infektion hos ett enskilt djur över tid, eller i samma vävnad mellan djur. Men 16 tills vidare optimeras, kommer dessa varningar begränsa känsligheten och därmed nyttan av metoden för kvantitativ bedömning av djupa infektioner med visceralizing Leishmania spp.. Slutligen, bilder kommer sannolikt att vara svagare i svart (t.ex. C57BL / 6) möss än i vitt (t.ex. BALB / c) möss. Rakning hud hår från överliggande området av intresse kan vara till hjälp för att upptäcka signalen från svarta möss.
Ytterligare överväganden är behovet av att validera IVIS som ett kvantitativt mått på parasit belastningar. Jämförelser mellan mikroskopi, qPCR och IVIS har gjorts i några fall, men det skulle behövas med varje system för att validera användningen av metoden som ett mått på sjukdomens progression. 22 16 Nya metoder för diagnostik växer fram, vilket kan kopplas till bioluminescence bilder. 16 Förutom transgena parasiter, kan djuret värdar vara konstruerad för att uttrycka självlysande eller fluorescerande molekyler. Framtida studier med denna teknik skulle kunna omfatta djur som uttrycker transgener i specifika cellulära fack för att upptäcka värd faktorer i patogenes och parasiter samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats delvis av en Merit Review bidrag från Department of Veterans Affairs, genom NIH anslag AI045540, AI067874, AI076233-01 och AI080801 (MEW), och genom AI29646 (SMB). Arbetet utfördes delvis under finansiering av CT och JG genom NIH T32 AI07511.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin Potassium Salt | Reagent |  Caliper Life Sciences |
122796 | |
| IVIS Imaging System 200 Series | Equipment | Caliper Life Sciences |
Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum. |
References
- Capul, A. A., Barron, T., Dobson, D. E., Turco, S. J., Beverley, S. M. Two functionally divergent UDP-Gal nucleotide sugar transporters participate in phosphoglycan synthesis in Leishmania major. J Biol Chem. 282, 14006-14017 (2007).
- LeBowitz, J. H., Coburn, C. M., McMahon-Pratt, D., Beverley, S. M. Development of a stable Leishmania expression vector and application to the study of parasite surface antigen genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9736-9740 (1990).
- Mureev, S., Kushnir, S., Kolesnikov, A. A., Breitling, R., Alexandrov, K. Construction and analysis of Leishmania tarentolae transgenic strains free of selection markers. Mol Biochem Parasitol. 155, 71-83 (2007).
- Chakkalath, H. R. Priming of a beta-galactosidase (beta-GAL)-specific type 1 response in BALB/c mice infected with beta-GAL-transfected Leishmania major. Infect Immun. 68, 809-814 (2000).
- Sacks, D. L., Perkins, P. V. Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes. Science. 223, 1417-1419 (1984).
- da Silva, R., Sacks, D. L. Metacyclogenesis is a major determinant of Leishmania promastigote virulence and attenuation. Infect Immun. 55, 2802-2806 (1987).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99, 97-103 (2001).
- Scott, P., Caspar, P., Sher, A. Protection against Leishmania major in BALB/c mice by adoptive transfer of a T cell clone recognizing a low molecular weight antigen released by promastigotes. J Immunol. 144, 1075-1079 (1990).
- Belkaid, Y. The role of interleukin (IL)-10 in the persistence of Leishmania major in the skin after healing and the therapeutic potential of anti-IL-10 receptor antibody for sterile cure. J Exp Med. 194, 1497-1506 (2001).
- Wilson, M. E. Local suppression of IFN-gamma in hepatic granulomas correlates with tissue-specific replication of Leishmania chagasi. J Immunol. 156, 2231-2239 (1996).
- McElrath, M. J., Murray, H. W., Cohn, Z. A. The dynamics of granuloma formation in experimental visceral leishmaniasis. J Exp Med. 167, 1927-1937 (1988).
- Ato, M. Loss of dendritic cell migration and impaired resistance to Leishmania donovani infection in mice deficient in CCL19 and CCL21. J Immunol. 176, 5486-5493 (2006).
- Ahmed, S. Intradermal infection model for pathogenesis and vaccine studies of murine visceral leishmaniasis. Infect Immun. 71, 401-410 (2003).
- Kamala, T. Hock immunization: a humane alternative to mouse footpad injections. J Immunol Methods. 328, 204-214 (2007).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cell Microbiol. 7, 383-392 (2005).
- Brittingham, A., Miller, M. A., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Regulation of GP63 mRNA stability in promastigotes of virulent and attenuated Leishmania chagasi. Mol Biochem Parasitol. 112, 51-59 (2001).
- Roy, G. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Mol Biochem Parasitol. 110, 195-206 (2000).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Hardy, J., Margolis, J. J., Contag, C. H. Induced Biliary Excretion of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 74, 1819-1827 (2006).
- Lecoeur, H. Optimization of Topical Therapy for Leishmania major Localized Cutaneous Leishmaniasis Using a Reliable C57BL/6 Model. PLoS Negl Trop Dis. 1, e34-e34 (2007).
- Lang, T., Lecoeur, H., Prina, E. Imaging Leishmania development in their host cells. Trends Parasitol. 25, 464-473 (2009).
