Summary
יון ניידות ספקטרומטריית מסה היא המתעוררים גז שלב טכנולוגיה שמפרידה יונים, המבוסס על ההתנגשות שלהם חתך ומסה. השיטה מספקת מידע תלת מימדי על טופולוגיה את הצורה הכוללת של קומפלקסים חלבונים. כאן, אנו המתאר הליך בסיסי לקביעת מכשיר ואופטימיזציה, כיול פעמים להיסחף, ופרשנות של נתונים.
Abstract
יון ניידות (IM) היא שיטה אשר מודד את הזמן שנדרש עבור יון לנסוע דרך תא בלחץ תחת השפעה של שדה חשמלי חלש. המהירות שבה היונים חוצים את האזור להיסחף תלוי בגודל שלהם: יונים גדול יחוו מספר גדול יותר של התנגשויות עם גז אינרטי הרקע (בדרך כלל N 2) וכך לנסוע יותר לאט דרך המכשיר IM מאלו שמרכיבים יונים קטן יותר חתך. באופן כללי, הזמן שלוקח עבור היונים להעביר אף את השלב גז דחוס מפריד אותם, על פי ההתנגשות שלהם חתך (Ω).
לאחרונה, IM ספקטרומטריית היה יחד עם ספקטרומטריית מסה נודדת גל (T-wave) Synapt יון ניידות ספקטרומטר מסה (IM-MS) שוחרר. שילוב ספקטרומטריית מסה עם ניידות יון המאפשרת מימד נוסף של הפרדה מדגם הגדרה, מניב מגוון תלת ממדי (מסה לעת תשלום, עוצמה, ואת להיסחף). טכניקה זו מאפשרת הפרדה חפיפה ספקטרלית לירידה, ומאפשר ברזולוציה של קומפלקסים הטרוגנית עם מסה דומה מאוד, או המסה תשלום יחסי, אבל פעמים להיסחף אחר. יתר על כן, מדידות זמן להיסחף לספק נדבך חשוב של מידע מבניים, כמו Ω קשורה בצורת טופולוגיה הכוללת של יון. המתאם בין זמן הערכים שנמדדו להיסחף Ω מחושב באמצעות עקומת כיול שנוצר חלבונים calibrant עם חתכים מוגדר 1.
כוחה של גישה IM-MS טמונה ביכולתה להגדיר את האריזה למקטע ואת הצורה הכללית של מכלולים החלבון בריכוזים מיקרו, ו-near-פיזיולוגיים תנאים 1. מספר מחקרים IM האחרונות של שני חלבונים בודדים 2,3 ולא קוולנטיים קומפלקסים חלבונים 4-9, הפגינו בהצלחה כי מבנה החלבון הרביעון נשמר בשלב גז, הדגיש את הפוטנציאל של גישה זו במחקר של מכלולים חלבון הגיאומטריה לא ידוע . כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של ניתוח IMS-MS של קומפלקסים חלבונים באמצעות Synapt (quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) מכשיר HDMS (ווטרס בע"מ; רק מכשיר מסחרי IM-MS זמין כרגע) 10. אנו מתארים את השלבים אופטימיזציה בסיסית, כיול של התנגשות חתכים, שיטות לעיבוד נתונים לפרשנות. השלב הסופי של פרוטוקול דן שיטות לחישוב תיאורטי ערכים Ω. באופן כללי, הפרוטוקול אינו מנסה לכסות כל היבט של אפיון IM-MS של מכלולים חלבון, אלא מטרתו היא להציג את ההיבטים המעשיים של שיטת לחוקרים חדשים בתחום.
Protocol
ההליך אנו מתארים מתמקד אך ורק על ניתוח IM-MS של קומפלקסים חלבונים. לכן, אנו ממליצים החוקרים בקיא בתחום MS מבניים מתייחסים הכנת הצעדים מדגם, כיול המכשיר ו-MS ו-MS במקביל הליכי אופטימיזציה המתואר קירשנבאום et al. Http://www.jove.com/index/details 2009. stp? ID = 1954. באופן כללי, פרוטוקול זה כרוך ריכוזים נמוכים של מיקרו מורכבת (10-20 מיקרומטר) ב חיץ נדיפים כגון אמוניום אצטט (0.005-1 M, pH 6-8). בהתחשב בעובדה 1-2 μl נצרכים לכל nanoflow נימי, אנו מציעים 10-20 μl כמו נפח מינימלי, כדי לאפשר אופטימיזציה של תנאי MS.
חלק 1: רכישת ספקטרום יון ניידות ספקטרומטריית מסה
- הגדר את ספקטרומטר מסה על המצבים הבאים של המבצע: ניידות-TOF, רכישת יון חיובי, ו-V-mode.
- הפעל את כל הגזים (API, מלכודת ו-IMS). אנו משתמשים N 2 להפרדה IM, ו - אר עבור מלכודת / העברה. הערכים ההתחלתיים אינם מומלצים 1.5 mL / min לאזור מלכודת, ואת זרימת הגז של 24 מ"ל / דקה עבור המכשיר IMS.
- הגדר את טווח m / z הרכישה. לקבלת מורכבות חלבון ידוע, אנו ממליצים להשתמש הראשונית של מגוון רחב המונית, אשר לאחר מכן ניתן לצמצם את הערכים הרצויים. במקביל, להתאים את פרופיל MS יעילות שידור מקסימלית. עבור קומפלקסים גדולים, טווח המוני הרכישה צריך להיות מוגדר מ 1,000 - 32,000 מ '/ z, ואת פרופיל MS אוטומטית. אחרת, הפרופיל ניתן להגדיר, על פי הטבלה הבאה:
מ '/ z לשכון (%) כבש (%) 960 10 20 3200 30 40 10667 - בדוק את הגדרת RF, ואם יש צורך, להתאים את הערכים המתאימים קומפלקסים חלבונים גדולים, כך:
מקור מלכודת IMS להעביר RF אופסט 450 380 380 380 RF Gain 0 0 0 0 הגבל RF 450 380 380 380 - החל מתח נימי (1,050-1,400 V) ולחץ nanoflow נמוכה (0.00-0.03 בר). לאחר הריסוס הוא יזם, מנסה להפחית את הלחץ nanoflow ערך מינימלית. בנוסף, להתאים את המיקום של נימי, ביחס חרוט.
- כוונו את הפרמטרים רכישת MS, לרכוש ספקטרום היטב לפתור MS: שיפוע הלחץ לאורך המכשיר, ואת חרוט דגימה וכן חרוט החילוץ, הטיה מלכודת והעברת ההגדרות פוטנציאל, צריכים להיות מותאם (המפורטים הקשורים יופיטר פרוטוקול קירשנבאום et al. http://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954 2009). אף על פי הפרמטרים האלה הם מדגם תלויי, התנאים השתמשנו לרכישת ספקטרום MS של ההמונים יונים שונים, החל פפטיד קומפלקסים חלבונים, המפורטות בטבלה 1, (ראה גם איור. 1). כדי למזער את הפעלת לנסות את מורכבות להפחית בהדרגה (בקפיצות של ~ 10 V) מתחי את הגביע המדגם, מלכודת ועל משוא פנים מבלי לשנות את מיקום השיא.
- לאחר הקשת מסה האופטימלי מתקבל פרופיל הזמן להיסחף צריך להיות מותאם. כאשר מנתחים אסיפות חלבון, תנאים אופטימליים המונית והן מדידות ניידות הם לעתים קרובות לא תואם, ולכן חשוב למצוא את האיזון הנכון בין השניים. בסך הכל, העלילה ניידות יון צריך להיות מותאם כך הפסגות מופצים על מגוון להיסחף כל הזמן, את הפרופיל שיא חלקה, מתקרב הפצה גאוס (איור 2A, 2B). שיא אסימטריה משמעותית יכולה להיות קשורה הפרדה לקויה של תצורות מרובות.
- ככלל, שלושת הפרמטרים, T-מהירות הגל, T-גל גובה זרימת IMS שיעור הגז יכול להיות מכוון כדי לייעל את ההפרדה ניידות. הגדלת מהירות T-גל יגדיל את הזמן להיסחף פרופיל הפצה, תוך עלייה T-גל ערכי גובה תצמצם אותו. באופן דומה, להגדיל את זרימת הגז IMS יעבור את הפרופיל הזמן להיסחף לכיוון ערכים גבוהים יותר (זרימת גז מינימלית IMS צריך להיות 10 mL / min). אנו ממליצים להשאיר שניים משלושת המשתנים זמין קבועה, ואופטימיזציה השלישי עד הספקטרום IM היטב נפתר (איור 2B). לשם כך, קבע את מהירות T-גל ואת זרימת הגז 250 m / s ו - 24 mL / min, מחדשspectively. ואז, כנקודת מוצא, לקבוע את גובה T-V גל ו 3, באופן הדרגתי, להגדיל אותו ב 1 במרווחים V. באופן כללי, יונים גדול ידרוש גובה הגלים גבוהים יותר. בדרך כלל, אין צורך לשנות את הלחץ IMS, עם זאת, מתח גבוה, כאשר ההטיה נדרשים עבור כוונון, הפחתת גז IMS תאפשר ירידה בשווי מתח הטיה, וכתוצאה מכך צמצום הפעלת חלבון מורכב. בסך הכל, ברזולוציה מקסימלית של 10-12 t / Δt ניתן להגיע.
- כאשר התנאים לא מותאמים (גובה נמוך T-גל או מהירות גבוהה T-גל ו / או בלחץ גבוה IM), היונים לא לעבור דרך המכשיר IM ביעילות, והמסע שלהם עלול לקחת זמן רב יותר מאשר הזמן הדרוש יון הבא מנות להשתחרר לתוך התא ניידות. כתוצאה מכך, מנות יון חדש ישוחררו מאזור מלכודת לפני המנה הקודמת נמסרה באזור הסמים. זה יוביל לאפקט 'רול מעל ", שבו שיא נצפו בחלק הראשון של הספקטרום הזמן להיסחף זהה לזה של יונים בקצה עוקב (איור 2C). ממצא זה ניתן למנוע על ידי הגדלת גובה T-גל, ולהפחית טי גל מהירות ולחץ IMS. בנוסף, הזמן לשחרר מלכודת יכול להיות מותאם. יתר על כן, חשוב לוודא כי גובה T-גל העברת מוגדר לפחות 5 V. כדי למנוע דליפה של יוני כלפי התא IMS, אנו ממליצים כי גובה מלכודת ניידות להישמר ברמות היותר (30 V).
- מהירות נמוכה משרעת גבוהה של העברת T-גלי עלול להוביל את "גלי" של הפרופיל זמן הפצה להיסחף (איור 2 ד). ממצא זה מתרחש כאשר ההפרדה ניידות של יונים (יון זמן ההגעה / להיסחף) לא נשמר באמצעות העברת ואזורים תוף, בגלל הסנכרון בין חלקי התדר דחפן ואת מהירות העברת גל טי. כדי לחסל את האפקט הזה, או את הזמן או דוחף את מהירות העברת גל T-צריך להיות מותאם. מאז תדירות דחפן קשורה בטווח המוני, ממצא זה עשוי להופיע שוב כאשר פרמטר זה השתנה. T-גל גובה מפעיל השפעה משנית, אם כי הפחתה שלה עשוי גם לעזור לחסל את האדוות.
- לאחר הפרמטרים הנ"ל מותאמים, IM-MS הנתונים ניתן לרכוש.
חלק 2: הקרנת תנאי הניסוי כדי להבטיח ניידות מדידות של מבנים מקומיים
כדי להשיג פתרון מאוד פסגות MS, קומפלקסים חלבונים מופעלים לעתים קרובות בתוך ספקטרומטר מסה, כדי לקדם את הפשטת מים שיורית ורכיבים חיץ 11. עם זאת, אם את אנרגיית הפעלה מוגברת מעבר לערך סף, חלקי התגלגלות יכול להיגרם להרכיב מדינות ביניים מספר 12, אשר צפויים להתאים את מבנה יליד פתרון של מדינה, (איור 3A-C). כתוצאה מכך, שיא הזמן להיסחף יכול להיות מוזז והרחיב, המשקף את האוכלוסייה הטרוגנית של פרש מבנים.
על מנת לקבל זמן להיסחף נתונים בקנה אחד עם פתרון שלב מבנים, חיוני בזהירות לשלוט במתחים המשמשים מאיץ יונים, לפני ההפרדה IM. יתר על כן, עבור MS רזולוציה גבוהה עדיף להגדיל את העברה ולא מתח מלכודת. כאשר המכשיר ממוקם IM, הראשון, ואחריו האזור העברת מנתח TOF, ומכאן, הפעלת כדלקמן המדידה צ'אט יונים נותר ללא פגע, ואילו דיוק MS יכול להיות מוגברת.
כדי לאמת כי רכישת נתונים מתבצעת בתנאים לשמור על מבנה הילידים של המתחם, מומלץ כי הנתונים שיירשמו על פני טווח של תנאי הניסוי פתרון, ולא על פי אחד, ערכה אופטימיזציה של פרמטרים:
- הגדלת מתח נימי קונוס באופן הדרגתי, תוך מעקב אחר ההשפעה על הספקטרום הזמן להיסחף.
- כמו שלב 1, להגביר את המתח התנגשות מלכודת באופן הדרגתי, ולרכוש נתונים על 10 מרווחי V.
- כדי לזהות את תצורות פרש ולהעריך את הנתונים רכשה, באופן ידני לגרום דיסוציאציה של הקומפלקס חלבון ידי titrating המדגם עם חומצה אצטית על פני טווח ה-pH של 2-7, ולהקליט את הנתונים (איור 3B).
חלק 3: בדיקת ההתאמה בין ערכי הזמן להיסחף חתך אזורי
בניגוד למדידות IM הקונבנציונלית, שבה הזמן נמדד בערכים להיסחף קשורים באופן ליניארי על Ω, במערכת IMS T-גל, באזור החתך לחצות מוגדר על ידי גישה כיול. כך, במקום מדידה מוחלטת, מתאם מעריכי היחסי שנוצר בין הזמנים להיסחף נמדד Ω 1,13: 
כאשר t D זה הזמן להיסחף נמדדת, ו-X הוא קבוע פרופורציה כי ניתן להפיק עקומת כיול. כיול היא לבצעעורך ידי מדידת הזמנים סחיפה של יונים עם Ω ידוע (נמדד מניסויים IM קונבנציונלי).
- זמן המדידות מכוילים הסחף באמצעות מפוגל חלבונים סוסים ציטוכרום C, לב מיוגלובין סוס שור היוביקוויטין ידוע התנגשות עם חתכים. לשם כך, פתרונות של 10 מיקרומטר 49/49/2, יחס נפח, מים / מתנול / חומצה אצטית צריכים להיות מוכנים (ריאגנטים בשימוש המפורטות טבלה 3).
- IM-MS רוכשת את הנתונים עבור חלבונים calibrant תחת בדיוק את התנאים מכשיר אותו לשמש חלבון מטרה או חלבון מורכב:
(חלק 1). כל המתחים ואת הערכים הלחץ צריך להיות זהה, כדי לשמר את ההגדרות ההפרדה IM. - עבור כל מדינה אחראית על החלבונים calibrant לחלץ את להיסחף ניסיוני זמן ערך (t ד) (המתואר בפרק 4).
- נכון בכל הפעמים להיסחף calibrant (t ד) (טבלה 2) באמצעות המשוואה הבאה:
, כאשר m / z הוא היחס בין מסת אל הממונה על יון ציין, ו-c היא עומס עבודה משופרת (EDC) מקדם עיכוב 1. הערך שלה, בדרך כלל בין 1.4 ו - 1.6, הוא מכשיר תלויי. ערך EDC מצוין בתוך מערכת | הגדרות רכישה | הגדרת הכרטיסייה רכישה. - באמצעות חתך של פרופ 'דוד Clemmer מסד נתונים:
http://www.indiana.edu/ ~ clemmer / מחקר / לחצות 20section%% 20database/Proteins/protein_cs.htm 14 לתקן כל אחד calibrant חתך למדינה הן תשלום יונים מסה מופחתת.
שם Ω C הוא תיקן חתך, Ω הוא ספרות חתך, z היא המדינה הממונה יון, m הוא משקל מולקולרי של יון calibrant, G ו-M הוא המשקל מולקולרי של הגז רקע IM (בדרך כלל N 2). - העלילה (t ד ') נגד ב (Ω ג) (איור 4 א).
- עקומת כתוצאה המתאים המשוואה הבאה:
X הפרמטרים ניתן לחלץ באמצעות הולם את העלילה יחסים ליניארי. X שיפוע מתאים גורם פרופורציה מעריכי ו מייצג את בכושר-נחוש מתמיד. - חשב את מקדם המתאם מתאים r 2, באמצעות המשוואה של פירסון:
. ערכים מקובלים עבור R 2 הם יותר מ 0.95 (איור 4 ב). מקדם קורלציה נמוכה ערך יכול להיות בגלל: - הושלמה התגלגלות של calibrants חלבון. זה יוביל שיא הרחבת בשל הרכבה ביניים הטרוגנית של מצבים.
- מניסיוננו, מדגם בגילאי יכול להתדרדר את הספקטרום IM.
- תנאים ניסויים שונים המשמשים את החלבונים calibrant שונים. במקרה זה, זוממים את הנתונים עבור כל חלבון בנפרד צריך ליצור מקדמי המתאם מגוונות, אם כי כל אחד מהם צריך להיות גבוה מ 0.95.
- נתונים רועש שגוי החלקה מרכוז של חלוקת הזמן להיסחף.
- חישוב השגיאה.
- Recorrect הזמן להיסחף calibrant באמצעות גורם מעריכי נקבע, X, נגזר בשלב 7:
- כצעד אימות, replot Ω C לעומת
ולהגדיר את מקדם המתאם. ערכים גבוהים יותר מאשר 0.95 יש לצפות. - על פי הנוהל המתואר בשלב 4, לתקן את הזמן להיסחף מדודה של חלבון המטרה או חלבון מורכב:
- כיול הזמן להיסחף של המתחם יעד חלבון / חלבון באמצעות גורם מעריכי, X, המוגדר שלב 7:
- חישוב Ω של המתחם יעד חלבון / חלבון באמצעות התאמה שנקבע קבוע, מוגדר שלב 7:
. - עבור כל תנאי הניסוי, שלבים 2-13 יש לחזור. כאשר הגדרת שטח חתך רוחב של חלבון לא ידוע או מורכב חלבון, אנו ממליצים כי כל הניסוי יש לחזור לפחות שלוש פעמים, ואת סטיית התקן של מדידות אלה נקבע בשלושה עותקים.
(חלק 1). כל המתחים ואת הערכים הלחץ צריך להיות זהה, כדי לשמר את ההגדרות ההפרדה IM. 
, כאשר m / z הוא היחס בין מסת אל הממונה על יון ציין, ו-c היא עומס עבודה משופרת (EDC) מקדם עיכוב 1. הערך שלה, בדרך כלל בין 1.4 ו - 1.6, הוא מכשיר תלויי. ערך EDC מצוין בתוך מערכת | הגדרות רכישה | הגדרת הכרטיסייה רכישה. 
X הפרמטרים ניתן לחלץ באמצעות הולם את העלילה יחסים ליניארי. X שיפוע מתאים גורם פרופורציה מעריכי ו מייצג את בכושר-נחוש מתמיד. 
. ערכים מקובלים עבור R 2 הם יותר מ 0.95 (איור 4 ב). מקדם קורלציה נמוכה ערך יכול להיות בגלל: 
ולהגדיר את מקדם המתאם. ערכים גבוהים יותר מאשר 0.95 יש לצפות. 
. חלק 4: הגדרת זמן ערכים להיסחף
תוכנה דרושה: MassLynx ו Driftscope (ווטרס).
- פתח את ספקטרום IM-MS באמצעות תוכנת Driftscope.
- מתוך התפריט הראשי, בחר ויEW ו Chromatogram בטל, זמן הסחף ואת ספקטרום (אופציונלי), עוזב פעיל רק את המפה 2D הצגת הזמן להיסחף לעומת m / z.
- מתוך שורת התפריטים, לבחור תצוגה | אפשרויות | לוח תצוגה עורך ולהתאים את ערכי סף עוצמה כדי למזער את רעש הרקע (ברוב המקרים, הגדרה זו יכולה להיות מוגדרת כ 30-40% = מינימום ומקס 100 = ספירת%).
- בחר תצוגה | סולם 2D אינטנסיביות מפה, ואת שלוש אפשרויות יופיעו: קנה המידה הלינארי, התחבר קנה מידה סולם השורש הריבועי. הבחירה של סולם התחבר (נתונים לוגריתמי לשנות) יהיה לדחוס את קוד צבע אינטנסיביות, ולאפשר את המראה בו זמנית של מגוון רחב של עוצמות (להבדיל האפשרויות שורש ליניארי רבועים, עם אשר רק הפסגות אינטנסיבית ביותר יהיה נראה לעין) .
- מלוח סרגל כלים, שימוש בכלי כפתור בחירה. אפשרות זו תפעיל את אפשרויות בחירה שונות, לאפשר בחירה של האזור הרלוונטי בתוך הספקטרום. הכלי המדויק ביותר הוא הפיכת אזור של בחירות ריבית, שבאמצעותו גבול עלול להיגרר סביב האזור של עניין, ובכך להוציא את כל הנתונים מיותר פסגות רעש. כמו כן, אפשרויות בחירה אורתוגונלית ו - בנד שימושיים, כאשר אזור של אינטרס אינו מוקף בפסגות מיותר.
- לאחר באזור של עניין נבחרה, השתמש קבל פקודה הנבחר הנוכחי כדי להסיר מידע מיותר.
- לייצא את הנתונים MassLynx, תוך שמירה על מידע זמן להיסחף.
- בתוך MassLynx, פתח את chromatogram של הספקטרום נשמר זמן להיסחף, ולשלב פחי זמן. הספקטרום המונית המקביל ייפתח באופן אוטומטי.
- החל מנקה את הפונקציה על ידי הגדרת גודל החלון ומספר פרמטרים חלקה (צריך להיות מכוון במיוחד עבור כל קשת, באמצעות ערכי מינימלי).
- החל המחקר חיסור, במידת הצורך.
- במרכז הקשת ו למדוד את המסה, כדי לאמת את זהות החלבון ואת הדיוק המונית.
- עבור כל מדינה אחראי, לשלב את מגוון m / z. הספקטרום המקביל זמן להיסחף יופיעו באופן אוטומטי. חלקה במרכז זמן פרופיל להיסחף, ולהגדיר את ערך הזמן להיסחף על ידי המציין את centroid שיא של כל אחד.
חלק 5: תוצאות נציג
באיור 1. ייצוג סכמטי של המכשיר Synapt HDMS המציין את הפרמטרים העיקריים של הרכישה מתכונן IMS-MS. פרמטרים ניסיוני המשמש IM-MS מדידות מסומנים בהתאם למיקום שלהם בתוך המכשיר. אלומת יונים היא בצבע אדום, ואת הלחץ בכל אזור המיועד בעזרת קוד צבע. הפאנל בתחתית ממחיש את הפוטנציאל שיפוע לאורך המכשיר ואת ההבדלים פוטנציאל להגדיר את מלכודת התנגשות העברת אנרגיות, כמו גם את הפוטנציאל הטיה. כל פוטנציאלים לקריאה הגב מפנה למתח קיזוז סטטי אשר מוגדר בדרך כלל 120V.
איור 2. הגעת ניידות יון זמן הפצות לחלבון Gβυ.
א מהירות גבוהה T-מוביל גל הפצה צר של הפרופיל הזמן להיסחף. העלילה מתאר את זמן ההגעה ההפצה של 16 + (אדום), 15 + (ירוק), 14 + (כחול), ו - 13 + (מג'נטה) קובע תשלום, כמו גם את הפרופיל הזמן הכולל סחיפה (בשחור) של חלבון G βυ.
ב להיסחף אופטימיזציה זמן ספקטרום עם צורה גאוס חלקה שיא. צבע תוויות דומות כמו.
ג 'רול על "אפקט, אשר מתרחשת כאשר הפעם נלקח יונים לעבור את התא הניידות היא איטית יותר מאשר המרווח בין הזרקות של מנות חדשות יון לתוך המכשיר. כתוצאה מכך, השיא המורחבת זמן להיסחף מופיע בתחילת הספקטרום. אפקט זה ניתן למנוע על ידי הגדלת גובה T-גל, ולהפחית טי גל מהירות ולחץ IMS.
"אדוות" ד מלאכותית נגרמות כאשר גל ה-T העברת מהירות ותדירות דחפן מסונכרנים באופן חלקי. השפעה זו ניתן להתגבר על ידי התאמת או תדירות דחפן או טי גל מהירות העברה.
איור 3. ההשפעה של הפעלת יון ותנאי denaturing חלקית על ספקטרום IM-MS של המוגלובין. מגרש הזמן להיסחף לעומת m / z עבור המתחם המוגלובין tetrameric, באמצעות בתמיסה מימית של 10 mM אמוניום אצטט (pH = 7.6) (A, C) ועל תוספת של חומצה אצטית 0.1% (B). נתונים רכשה באמצעות התנגשות מלכודת אנרגיה מתח של 13 V (A, B) ו - 35 וולט (ג) על אף בכל שלושת הפאנלים ספקטרום המונית (מוקרן על החלק העליון) נראה דומה, עם סדרה תשלום tetrameric מרוכז ב 4000 מ '/ z, הזמן להיסחף פרופיל (מוקרן על שני הצדדים) שונה (חלוקת סך הזמן להיסחף הואבשחור, פרופיל 16 + הוא בצבע אדום). בפעם להיסחף יותר של המדגם מפוגל חלקית, שהושגו B, הגז שלב יונים מופעל, שהושג ב-C, מעיד על מידה מסוימת של התגלגלות. תצפית זו ממחישה כי למרות המוני נמדד מתאים מורכב שלם, מבנה הפתרון שלה מופרת. כתוצאה מכך, בקרה קפדנית של תנאי הניסוי הנדרש.
איור 4. על ידי יצירת עקומת כיול, מדידות להיסחף זמן ההתנגשות בחתכים יכול להיות מתואמים.
א נמדד הזמן להיסחף הערכים של מדינות תשלום מרובות של סוסים ציטוכרום C (עיגולים), הלב סוס מיוגלובין (משולשים) ו שור היוביקוויטין (ריבועים) היו זממו נגד ערכי הספרות Ω תיקנה המדינה הן יון תשלום מסה מופחתת. מתאים התשואות פונקציה לינארית המתאים: ln (Ω C) = Xln (t ד ') + A. גורם מעריכי נקבע (X), מתאים שנקבע קבוע (א), מקדם המתאם מוצגים על המגרש שנרכש עבור נתונים במהירות T-גל של 350 m / s, וגובה הגלים סטטי של 11 ו-B. היסטוגרמה של הפצות מקדם המתאם המתקבל 10 ניסויים כיול רצופים.
| חלבון מדגם / פרמטרים טכניים | GluFibrino- פפטיד מונומר 1.6 kDa | מיוגלובין מונומר 17 kDa | המוגלובין tetramer 67 kDa | Transferrin מונומר 80 kDa | GroEL 14-mer 801 kDa |
| לחץ גיבוי, mbar | 4.4 | 5.0 | 5.1 | 5.1 | 6.5 |
| לחץ מלכודת, mbar | 1.6x10 -2 | 2.4x10 -2 | 2.4x10 -2 | 2.6x10 -2 | 2.8x10 -2 |
| לחץ IMS, mbar | 4.4x10 -1 | 4.4x10 -1 | 4.4x10 -1 | 4.4x10 -1 | 4.2x10 -1 |
| קונוס מתח דגימה, V | 46 | 80 | 80 | 80 | 118 |
| הפקת מתח חרוט, V | 1.7 | 1 | 1 | 1 | 3 |
| הטיה מתח, V | 20 | 20 | 25 | 25 | 50 |
| התנגשות אנרגיה מלכודת, V | 20 | 15 | 15 | 15 | 80 |
| התנגשות העברת אנרגיה, V | 5 | 12 | 12 | 12 | 15 |
טבלה 1. תנאי הניסוי בשימוש לניתוח מקרומולקולות.
| תקן חלבון | Mass מולקולרית (מ) | חיובים (z) | מ '/ z | התנגשות חתך (ב 2) |
| ציטוכרום C | 12213 | 10 | 1222.3 | 2226 |
| 11 | 1111.3 | 2303 | ||
| 12 | 1018.8 | 2335 | ||
| 13 | 940.5 | 2391 | ||
| 14 | 873.4 | 2473 | ||
| 15 | 815.2 | 2579 | ||
| 16 | 764.3 | 2679 | ||
| 17 | 719.4 | 2723 | ||
| 18 | 679.5 | 2766 | ||
| מיוגלובין | 16952 | 11 | 1542.1 | 2942 |
| 12 | 1413.7 | 3044 | ||
| 13 | 1305.0 | 3136 | ||
| 14 | 1211.9 | 3143 | ||
| 15 | 1131.1 | 3230 | ||
| 16 | 1060.5 | 3313 | ||
| 17 | 998.2 | 3384 | ||
| 18 | 942.8 | 3489 | ||
| 19 | 893.2 | 3570 | ||
| 20 | 848.6 | 3682 | ||
| 21 | 808.2 | 3792 | ||
| 22 | 771.6 | 3815 | ||
| היוביקוויטין | 8565 | 8 | 1071.6 | 1442 |
| 8 | 1071.6 | 1622 | ||
| 9 | 952.7 | 1649 | ||
| 10 | 857.5 | 1732 | ||
| 11 | 779.6 | 1802 | ||
טבלה 2. חלבונים Calibrant ולחצות התנגשות הערכים שלהם הסעיפים נקבע על ידי קונבנציונאלי measurments IMS 14.
| התקנים | חברה | מספר קטלוגי |
| Synapt HDMS-32K RF גנרטור | ווטרס בע"מ | |
| P-97-Flaming בראון micropipette חולץ | סאטר מכשירים | P-97 |
| גמגום coater | מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים | EMS550 |
| המשקפת מיקרוסקופ | ניקון | |
| ריאגנטים | חברה | מספר קטלוגי |
| אמוניום אצטט | סיגמא אולדריץ | סיגמא, A2706 |
| CSI 99.999% | סיגמא אולדריץ | אולדריץ', 203033 |
| מתנול | סיגמא אולדריץ | Fluka, 34966 |
| חומצה אצטית | פישר סיינטיפיק | AC12404 |
| סוסים מיוגלובין (מהלב סוס) | סיגמא אולדריץ | M1882 |
| סוסים ציטוכרום C (מהלב סוס) | סיגמא אולדריץ | C-2506 |
| שור היוביקוויטין (מתאי דם אדומים) | סיגמא אולדריץ | U6253 |
| המוגלובין | סיגמא אולדריץ | H2625 |
| גז | תגובות | |
| חנקן, 99.999% טהור | 8 מטר מעוקב גליל | |
| ארגון, 99.999% טהור | 8.8 מעוקב meterscylinder | |
לוח 3. ריאגנטים וציוד.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר להגדיר את לחצות קטע ההתנגשות של חלבונים או קומפלקסים חלבונים עם מבנה בעל שלוש ידועים ממדי, במטרה לספק מידע על הצורה הכללית שלהם, אריזה למקטע ו טופולוגיה. לשם כך פעם לחצות התנגשות ערכים סעיף מתוארים יש צורך להמיר את הערכים הללו כדי פרטים מבניים. תהליך זה דורש מאמצים נוספים ניסיוניים כמו גם ניתוח חישובית, אשר דנו בקצרה להלן.
ראשית, מומלץ לנתח חלבונים או קומפלקסים חלבונים עם מבנים ידועים. מדידות אלה יכולים לספק בקרת איכות שימושי של המתודולוגיה ויאפשר הערכת הדיוק של הפרמטרים הרכישה על ידי השוואת התיאורטי נמדד בערכים Ω. אזורים התיאורטי חתך צלב ניתן לחשב מתוך המבנה הגבישי קואורדינטות באמצעות תוכנת MOBCAL 15,16, המהווה מקור פתוח תוכנה FORTRAN מבוסס קוד המאפשר עריכת בהתאם לצרכי המפעיל. עבור מפעיל חישובים כאלה הוא נדרש לשנות את התוכנית כך שמספר איטרטיבי חישובים שבוצעו לכל מבנה קלט הוא גדל וזה לתאם קבצים המכילים מספר גדול של אטומים מתקבלים 1.
אסטרטגיה IM-MS להגדרת הסדרים טופולוגי של יחידות משנה בתוך multicomponent אסיפות הוצע לאחרונה 4,6. השיטה כרוכה ניטור של המסלולים דיסוציאציה של מכלולים חלבון לרכיבים קטנים יותר. דיסוציאציה זו מושגת באמצעות התאמה מבוקרת של התנאים שלב פתרון, אשר מעורר הפצה של subcomplexes רעיוני של "אבני הבניין" של מכלולים. מדידה בו זמנית של ערכים Ω של המתחם שניהם שלמים ומוצרי פירוק יוצרת מגבלות מבניות אשר משמשים לחישוב המודלים טופולוגי של קומפלקסים חלבונים. הנחת היסוד הבסיסית במתודולוגיה זו היא כי subcomplexes שנוצר לשמור אישורים מקומיים כמו שלהם, ואכן מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המבנה פתרון של מוצרי פירוק נשמרת ואין התארגנות מרכזי פתרון או שלבים גז התרחשו 4,6.
השלב האחרון במשימה של מבנה הרביעון לגז שלב יונים חלבון מורכב מתאים הצלב התנגשות ערכים סעיף מודלים מחשב. גישות מידול מועסקים על מנת לחקור את הסדרים שונים טופולוגי אפשרית של יחידות משנה שלהם ואת הערכים סיליקו Ω מחושבים לעומת אלה ניסיוני. נכון לעכשיו רק גישות חישוביות כמה משמשים, כמו שיטת גס גרגר spheretype המדמה את הקוטר של יחידות משנה 1,8. ככלל, תחום זה נמצא עדיין בשנים הראשונות שלה התפתחות נוספת נדרשת כדי להפוך את הגישה הזו גנריות, והיא חלה על מגוון רחב של קומפלקסים.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מודים לחברי הקבוצה שרון סקירה ביקורתית שלהם, על תרומתם כתב היד. אנו אסירי תודה על התמיכה של תוכניות מורשה ו ביכורה, הקרן הלאומית למדע (מענק מס '1823-1807 ו - 378/08), יוסף כהן מרכז מינרבה לחקר Biomembrane, עמיתי משפחת צ'ייס תכנית מדענים בניו, אברהם וסוניה Rochlin קרן; האמון משפחת וולפסון הצדקה; הלן מילטון א קימלמן המרכז מבנה Biomolecular ו העצרת; הנדל"ן של שלמה סבין Beirzwinsky; Meil דה בוטון Aynsley, וקארן סיאם, בריטניה.
References
- Ruotolo, B. T. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes. Nat Protoc. 3 (7), 1139-1152 (2008).
- Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements. Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (20), 3297-3304 (2008).
- Smith, D. P. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15 (2), 113-130 (2009).
- Leary, J. A. Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors. J Am Soc Mass Spectrom. 20 (9), 1699-1706 (2009).
- Lorenzen, K. Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly. J Mol Biol. 379 (2), 385-396 (2008).
- Pukala, T. L. Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements. Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).
- van Duijn, E. Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry. J Am Chem Soc. 131 (4), 1452-1459 (2009).
- Ruotolo, B. T. Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water. Science. 310 (5754), 1658-1661 (2005).
- Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. Aspects of native proteins are retained in vacuum. Curr Opin Chem Biol. 10 (5), 402-408 (2006).
- Giles, K. Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (20), 2401-2414 (2004).
- McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes. J Am Chem Soc. 128 (35), 11433-11442 (2006).
- Ruotolo, B. T. Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes. Angew Chem Int Ed Engl. 46 (42), 8001-8004 (2007).
- Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).
- Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections. J Am Soc Mass Spectrom. 10 (11), 1188-1211 (1999).
- Mesleh, M. F. Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential. J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).
- Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).
