Summary
Stimulus-opgeroepen [Ca
Abstract
Fluorescentie microscopie van cellen geladen met tl-licht, Ca
Protocol
Sperma van gezonde vruchtbare mannen, met een normale sperma-analyse, worden meestal bereid voor beeldvorming als volgt.
- Sperma monsters worden bewaard bij 37 ° C voor niet meer dan 30 minuten. Cellen worden geïsoleerd van de zaadplasma door zwemmen tot in aangevuld gebalanceerde zoutoplossing Earle's (sEBSS; mM: 1,8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO 4 0.7 H 2 O, 26,2 NaHCO 3, 1,0 NaH 2 PO 4. 2H 2 O, 116,4 NaCl, 55,6 D-glucose, 2,73 Na pyruvaat, 41.8 Na lactaat), aangevuld met 0,3% houtskool de-lipidated/fatty zuurvrij Fraction V BSA (kwaliteit van de BSA is cruciaal voor een succesvolle capacitation van sperma). 1 ml van sEBBS wordt gepipetteerd in elk van een serie van 5 ml tubes en voorzichtig underlayered met 0,3 ml van sperma. Na incubatie gedurende 1 uur (37 ° C; 6% CO 2) de bovenste 0,7 ml is voorzichtig verwijderd uit elke buis en samengevoegd. 10 pi van het sperma suspensie wordt verdund met 90 ul van 1% (v / v) formaline om de cellen te immobiliseren, dan zaadcellen worden meegeteld in een Neubauer kamer. Celdichtheid in de suspensie wordt dan aangepast (met sEBSS) tot 6 miljoen cellen / ml.
- Het monster wordt vervolgens verdeeld in porties van 200 pl in los-capped buizen en geïncubeerd (37 ° C; 6% CO 2) in voor 5-6 h te capacitation mogelijk te maken.
- Dekglaasjes (22x50 mm) eerder zijn behandeld met poly-D-lysine. 10 ul van poly-D-lysine-oplossing (10% w / v) wordt toegepast als een aantal kleine druppels naar het centrum van het dekglaasje. De poly-D-lysine wordt dan mag aan de lucht drogen. Dit kan op een verwarmd podium en moet worden tot droog te voltooien. Een dekglaasje wordt bevestigd met vacuüm vet om een gesloten, speciaal gebouwde, perfusable, polycarbonaat beeldvorming kamer (afmetingen 35 mm x 20 mm x 5 mm; capaciteit ≈ 180 ul). Gelijkaardig aan de Warner RC20 kamer De poly-D-lysine- gecoat dekglaasje vormt de basis van de kamer wanneer de cellen worden bekeken op een omgekeerde microscoop en een 12 mm diameter ronde dekglaasje vormt de bovenkant van de kamer, waardoor de overdracht van het licht.
- Oregon Green BAPTA1-AM (OGB) of Calcium Green 1-AM worden gebruikt voor het labelen cellen. OGB wordt bereid door het oplossen in DMSO. Pluronic zuur F127 (een detergent) is opgenomen in de DMSO om 'samenklonteren' van de kleurstof te voorkomen. Dit kan worden bereid in het laboratorium (100 mg Pluronic in 0,5 ml DMSO), vlak voor gebruik, of kan worden gekocht pre-voorbereid. 20 ui wordt toegevoegd aan een 50 ug hoeveelheid van OGB (2,5 mg / ml). De flacon kan vervolgens worden opgeslagen, ingevroren en ontdooid voor later gebruik.
- Na capacitation van het sperma (5-6 h in sEBBS, 37 ° C; 6% CO 2) een buis is gekozen voor de beeldvorming en 1,2 ul van OGB-oplossing wordt toegevoegd, zodat een uiteindelijke concentratie van 10 uM. De buis wordt vervolgens geïncubeerd voor een verdere 40 min, waarna de celsuspensie voorzichtig wordt geïnjecteerd in de instroom-poort van de beeldvorming kamer met een P1000 (blauw) pipetpunt. De kamer is geplaatst in de incubator, poly-D-lysine-gecoate dekglaasje kant naar beneden, voor 20 minuten. Cellen hebben de neiging om te zwemmen langs de oppervlakken van de kamer en zal zich houden aan de poly-D-lysine-gecoate gebied.
- De kamer is nu gemonteerd op de microscoop, verbonden met de perfusie apparaat en doorbloed op circa 0,5 ml / min. Een roller pomp voedt zoutoplossing in de kamer en overloop van de afrit de haven wordt verwijderd door een zuigpomp met een val. De voorbereiding is nog in het donker voor ten minste 10 minuten terwijl de losse cellen en extracellulaire kleurstof worden verwijderd door perfusie van de kamer. Temperatuurstabiliteit is van cruciaal belang omdat kleine schommelingen kunnen niet alleen van invloed cel Ca 2 + homeostase, maar kunnen ook van invloed K d van de kleurstof. Experimenten worden normaal uitgevoerd bij 25 ° C, bereikt door het handhaven van de temperatuur van de donkere kamer op dit niveau. We hebben gemerkt dat het behoud van kamertemperatuur op het vereiste niveau hoger de temperatuur en focus stabiliteit biedt dan het gebruik van een temperatuur gecontroleerde fase of een thermostatisch verwarming op het zoute instroom.
- Cellen worden bekeken onder fase-contrast (40x of 60x olie-immersie) doelstelling en een ruimte voor de beeldvorming is geselecteerd. Het gedeelte van de poly-D-lysine gecoate gebied dat ligt vlak bij de inlaat-poort heeft de voorkeur, waar de zoute stroming laminair en consistent. Het is ook belangrijk om een gebied waar celdichtheid is geschikt (te veel dichtheid van invloed op de kwaliteit en integriteit van gegevens door middel van pick-up van het signaal van aangrenzende cellen) en waar de cellen voldoende zijn bevestigd, maar flagellaire activiteit is waarneembaar. Een fase contrast beeld wordt opgeslagen. De microscoop wordt dan overgeschakeld naar fluorescentie-modus (excitatie 480 nm; emissie 540 nm) en de blootstelling tijd is teruggebracht tot het minimum dat nodig is om een duidelijk fluorescentie beeld (meestal 50 tot 200 ms) te verkrijgen.
- Het experiment wordt gestart door het activeren van de time-series beeldacquisitie software (IQ). Typisch de beelden werden bij 0,1 Hz en verlichting is beperkt tot de periodes van het beeld overname alleen met behulp van een Softwaopnieuw gecontroleerd sluiter. Veel groter beeldacquisitie tarieven kunnen worden gebruikt, maar rekening moet worden gehouden voor de problemen van het bleken en het genereren van artefacten als gevolg van foto-schade aan de cellen (zie discussie). IQ (en de meeste andere acquisitie software platforms) zal real-time grafiek van fluorescentie tijdens het experiment.
- Na een controle periode van 3-5 minuten duur manipulatie van een zoutoplossing bestanddelen (zoals [Ca 2 +] o), en de toepassing van geneesmiddelen wordt bereikt door vervanging van een zoutoplossing in de perfusie header. Tijd van de toevoeging van elke stimulus wordt opgemerkt zodat de tijd van aankomst in de beeldvorming kamer kan worden berekend, met voldoende nauwkeurigheid voor de beoordeling van de trage reacties hier beschreven (bemonsterd op 0,1 Hz). Voor meer snelle reacties grotere nauwkeurigheid kan worden bereikt door het toevoegen van prikkels rechtstreeks aan de zoute stromen door een tweede instroom poort zoals voorzien in de Warner RC20 kamer.
- Afbeeldingen worden geanalyseerd offline met IQ. Regio's van belang (ROI) zijn opgesteld rond elke cel (of een deel van de cel) en ook een cel vrije ruimte is geselecteerd (voor automatische achtergrond aftrek door de software. Het beeld-serie is vervolgens gecontroleerd naar cellen die gestorven of onderging acrosome reactie te verwijderen ( die wordt weergegeven als een grote en snelle toename van fluorescentie, gevolgd door het verlies van cytoplasmatische kleurstof) tijdens het experiment en die voldoende beweging artefacten veroorzaken wanneer geanalyseerd als een tijdreeks zien.
- Een time-fluorescentie-intensiteit serie wordt dan verkregen voor elk ROI en deze gegevens worden geanalyseerd offline in Excel. In eerste instantie fluorescentie is genormaliseerd naar de gemiddelde waarde verkregen tijdens de controle periode, met behulp van de vergelijking R = [(FF rest) / F rest] x 100%, waarbij R% verandering in de fluorescentie ten opzichte van de controleperiode,, F is fluorescentie-intensiteit op een tijdstip t en F rest is het gemiddelde van ten minste 30 bepalingen van F verkregen tijdens de controle periode.
Representatieve resultaten
Figuur 1 toont een serie beelden uit een experiment waarin de cellen werden gestimuleerd met 3 uM progesteron. De bovenste rij en film 1 tonen de fluorescentie beelden in grijs-schaal en op dezelfde mages worden hieronder weergegeven (en in de film 2) in pseudocolor (opzoektabel '16_colors 'in Afbeelding J), waar de' cool 'kleuren geven een lage fluorescentie-intensiteit en 'warme' kleuren geven een hoge fluorescentie-intensiteit. Cellen kunnen worden bekeken in pseudocolor tijdens het experiment, met behulp van lookup tabellen in IQ, maar het gebruik van grijstinten is over het algemeen meer informatief voor de beoordeling. Of de cellen zijn goed gelabeld. De eerste twee foto's werden verzameld bij 0 s en 100 s na het begin van de opname. Fluorescentie moet stabiel en heeft de neiging het sterkst in de post acrosomal gebied en sperma nek. Progesteron ging de beeldvorming kamer op ongeveer 175 s en de 3 e en 4 e foto's (180 s en 220 s) toont een snelle toename van [Ca 2 +] i (fluorescentie) van oorsprong uit posterior hoofd-halsgebied van de cel. Latere beelden worden op 290, 360, 740, 990 en 1440 s, waarin het verval van de initiële [Ca 2 +] i van voorbijgaande aard en de ontwikkeling van een secundaire aanhoudende verhoging. Figuur 2 toont een spreadsheet analyse, het omzetten van ruwe fluorescentie waarden voor elke ROI de genormaliseerde fluorescentie (% verandering in de fluorescentie ten opzichte van de controleperiode) Figuur 3 toont de tijd-genormaliseerde fluorescentie plots voor de drie cellen met 'typische' reacties op 3 uM progesteron.
Figuur 1. Voorbeeld van gegevens van een cel gestimuleerd met progesteron. Een reeks fluorescentie afbeeldingen in grijstinten (bovenste rij) en pseudocolor (onderste rij) worden weergegeven. Tijdstippen zijn 0, 180, 220, 290, 360 en 990s. 3 uM progesteron ging de beeldvorming kamer op 175 s. ROI staan in het eerste paneel.
Figuur 2. Analyse van enkele cel fluorescentie data in Excel. De cijfers in het zwart zijn tijdreeksen van fluorescentie data, verticaal opgesteld. Cijfers in het rood (onder) worden genormaliseerd data verkregen met behulp van de vergelijking in de tekst. Grafiek laat zien genormaliseerde fluorescentie-time plot voor de cel 64 in dit experiment waarbij, na stimulatie, toont een tijdelijke stijging van de fluorescentie, gevolgd door een langzame stijging en series van kleine oscillaties.
Figuur 3. Fluorescentie-time sporen voor de drie individuele cellen, uitgedrukt als% verandering ten opzichte van de waarde controle .. 3 uM progesteron werd toegevoegd op het moment gemarkeerd door de pijl. Stippellijn toont de gemiddelde controle fluorescentie.
Discussion
Bij het succesvol zijn uitgevoerd, deze techniek maakt het opnemen van de distributie en de kinetiek van spontane en geïnduceerde Ca 2 +-signalen in het menselijk sperma. Reacties kunnen worden verkregen uit een groot aantal cellen (tot 200), dat is belangrijk omdat het menselijk sperma kan veel variatie vertonen in hun spontane en gestimuleerd Ca 2 +-signalen. Succesvolle etikettering en overleving van de cellen tijdens de opname zijn sterk afhankelijk van sample kwaliteit. Slechte monsters leveren slechte etikettering, slechte reacties en cellen kunnen sterven tijdens het opnemen.
Menselijk sperma zijn zeer gevoelig voor foto-schade en we daarom gebruik maken van de minimale noodzakelijke verlichting (zowel de intensiteit en belichtingstijd) om overleving van de cel te maximaliseren en het minimaliseren van artefacten als gevolg van celdood. Een zeer gevoelige camera (het toelaat gebruik van lage-intensiteit verlichting) is een groot voordeel omdat de camera pikt een zwakke fluorescentie. Back-verlicht, EM-CCD-camera's zijn bijzonder geschikt, maar erg duur. LED-verlichting (in plaats van het gebruik van een xenon-of kwiklamp met excitatie filter verbetert ook de overleving van de cel (Nishigaki et al., 2006).
Wij gebruiken geen Fura-2, ondanks de duidelijke voordelen van de ratio-metrische beeldvorming, want Fura vereist excitatie met UV-licht en omdat het noodzakelijk is om twee foto's te nemen voor elke ratio. Voor de gegevens verkregen met enkele golflengte, zichtbaar licht kleurstoffen, normalisering van de fluorescentie-intensiteit grotendeels compenseert het verschil in dye laden tussen de cellen, maar niet voor dye distributie binnen een individuele cel, en dit moet rekening worden gehouden. Hoewel enkele golflengte kleurstoffen kunnen in principe worden gekalibreerd, de nauwkeurigheid van de techniek is slecht en we doen geen poging om dit te doen.
Overwegende dat de verhouding tussen gegevens, verkregen met Fura-2 (of de emissie-ratio kleurstof indo), zelfs zonder calibratie, geven een aanvaardbare getrouwe weergave van de relatieve veranderingen in [Ca 2 +] i, de fluorescentie-intensiteit van de interne golflengte kleurstoffen is verre van lineair met betrekking tot [Ca 2 +] i. Over de meest bruikbare deel van de curve verzadiging van de relatie voor enkele golflengte kleurstoffen benadert meestal logaritmische. We gebruiken momenteel Oregon Green BAPTA-1 (figuur 4), omdat het gevoelig is voor kleine veranderingen in [Ca 2 +] i dicht bij de rust niveau s (50-100 nM). Wanneer [Ca 2 +] i stijgt tot boven 1 uM reacties zullen ondervertegenwoordigd zijn in termen van fluorescentie veranderen en de kleurstof kan verzadigen. Een optie voor verbetering van de techniek zonder toevlucht te nemen tot UV-excitatie is om te laden cellen verdubbelen met een kleurstof, zoals TL-3 en Fura rood. Beide kunnen worden opgewekt bij 488 nm, maar gelijktijdig hun reacties zijn zeer verschillend. Opname van emissie bij 540 en 650 nM biedt een ratio die een betere methode voor nauwkeurige controle van de kan [Ca 2 +] i (Haughland, 2002) en van toepassing kunnen zijn op sperma (Nisigaki et al., 2006).
Figuur 4. Relatie tussen vrije [Ca 2 +] (nM) en fluorescentie-emissie bij piek golflengte (ca. 525 nm) voor de Oregon Green BAPTA-1 en Oregon Green BAPTA-2. OGB1 geeft een hogere fluorescentie bij rust [Ca 2 +], maar verzadigt op lagere niveaus en heeft dus een kleinere bruikbare bereik. Gegevens voor deze percelen werden verkregen van de Molecular Probes handboek (Haughland, 2002).
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door de Wellcome Trust, de Medical Research Council, The Royal Society, Birmingham Science City en The Onvruchtbaarheid Research Trust. We willen graag aan de deskundige hulp van Cairn Research erkennen in de bouw en integratie van de beeldvorming rigs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low light level Camera | QImaging | Rolera XR | |
| Oregon Green BAPTA-1 | Invitrogen | 06807 | |
| Imaging Software | Andor | IQ | |
| Imaging Software | National Institutes of Health | Image J | Public domain software |
| LED illumination system | Cairn Research | Opto LED | |
| Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) | Invitrogen | P3000MP |
References
- Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).
- Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging. Biotechniques. 41, 191-197 (2006).
