イメージングカルシウムのためのテクニック ^{2 +}人間の精子でシグナリング

Summary

刺激誘発の[Ca

Abstract

蛍光灯、Caでロードされた細胞の蛍光顕微鏡

Protocol

通常の精液検査と健康肥沃な男性からの精子は、通常、次のように画像処理のために準備されています。

1. 精液サンプルは最大30分間37℃で保存されています。 1.8のCaCl ₂ · 2H ₂ O、5.37のKCl、0.81のMgSO ₄ · 7H ₂ O、26.2 NaHCO _3を 、1.0のNaH ₂ PO _4：mMの、細胞が補充アールの平衡塩溶液（sEBSSにスイムアップによって精漿から分離されています。 2H ₂ O、0.3％木炭de-lipidated/fatty酸フリーフラクションV BSA（BSAの品質は、精子の正常な受精能獲得のために重要である）を添加した116.4のNaCl、55.6 D -グルコース、2.73のNaピルビン酸、41.8のNa乳酸）。 sEBBS 1 mlを5 mlのチューブのシリーズのそれぞれにピペットでゆっくりと精液の0.3 mlをunderlayeredている。 1時間のインキュベーションの後（37℃、6％CO _2）上位0.7ミリリットルを静かに各チューブから除去し、プールされます。精子懸濁液10μlを、細胞を固定するために1％ホルマリン（v / v）を90μlで希釈され、その後、精子がノイバウアーチャンバ内にカウントされます。懸濁液中の細胞密度は、6万細胞/ mlに（sEBSS付き）調整されます。
2. 受精能獲得を可能にするために5-6時間で、（6％CO ₂ 37 ° C）試料は、その後緩やかに覆われた管とインキュベーションで200μlのアリコートに分割されています。
3. カバースリップ（22x50 mm）は、以前にポリ- D -リジンで処理されています。ポリ- D -リジン溶液（10％w / v）の10μlを、カバースリップの中央に小さな液滴の数として適用されます。ポリ- D -リジンは、空気乾燥されている。これは、加熱されたステージ上に置くことができますし、乾燥を完了するはずです。 、perfusable、専用、密閉ポリカーボネートイメージング室（寸法35ミリメートル× 20ミリメートル× 5ミリメートル、≈180μlの容量）に真空グリースでカバーに取り付けられている。ワーナーRC20チャンバーに似てポリ- D -リジンは、コー​​ティングされたカバースリップは、細胞を倒立顕微鏡上で表示されているチャンバーの基盤を形成し、12 mm径の円形カバースリップは、光の透過を可能に、チャンバーの上面を形成している。
4. オレゴングリーンBAPTA1 - AM（OGB）またはカルシウムグリーン1 - AMは、ラベルのセルに使用されます。 OGBはDMSOに溶解して調製する。プルロン酸F127は、（洗剤）染料の"凝集"を防止するためにDMSOに含まれています。これは、使用直前に、液（0.5mlのDMSO中100 mgのプルロニック）実験室で調製する​​ことができる、または事前に用意された購入することができます。 20μlのOGBの50μgのアリコート（2.5 mg / mlの）に追加されます。バイアルは、凍結し、後で使用するために解凍保存することができます。
5. 精子の受精能獲得後（sEBBSで5〜6時間、37℃、6％CO _2）チューブは、イメージングのために選択され、OGBソリューション1.2μlを添加し、10μMの最終濃度を与える。チューブは、その後、細胞懸濁液を静かにP1000（青）ピペットの先端を持つイメージングチャンバーの流入口に注入された後、さらに40分間インキュベートする。チャンバーは20分間、ダウンインキュベーター、ポリ- D -リジンコートしたカバースリップの側に配置されます。細胞はチャンバーの表面に沿って泳ぐこととポリ- D -リジンでコーティングされた領域に付着する傾向がある。
6. チャンバーは今灌流装置に接続し、約0.5ml /分で灌流、顕微鏡にマウントされています。ローラーポンプ出口ポートからチャンバーとオーバフローに生理食塩水フィードは、トラップと吸引ポンプにより除去される。ルース細胞と細胞外色素がチャンバーの灌流によって削除されるしながら準備は、少なくとも10分間暗所に残されている。温度安定性は、小さな変動が唯一の細胞のCa ^{2 +}恒常性に影響しないことがありますので、決定的に重要であるだけでなく、染料の_K d _に影響_を与える可能性_があります。実験は通常25で行われる℃で、このレベルでは暗い部屋の温度を維持することによって達成した。我々は、必要なレベルで室温を維持する温度制御ステージまたは生理食塩水流入でサーモスタット制御のヒーターを使用するよりも高い温度とフォーカスの安定性を提供することを見出した。
7. 細胞は、対照的に（油浸40倍または60倍）目標とイメージングのためのエリアが選択されている相の下に表示されています。入口ポートの近くにあるポリ- D -リシン被覆面積の部分は、生理食塩水の流れが層流と一致しているところ、好ましい。細胞密度が適切である領域を使用することも重要です（過度の密度は、隣接するセルからの信号のピックアップを介してデータの品質と整合性に影響を与える）と細胞が適切に接続されていますが鞭毛の活動が目に見えるです。位相コントラスト画像が保存されます。顕微鏡、蛍光モード（励起480nmの、発光540nmの）に切り替えられると、露光時間は明確な蛍光画像を（通常は50から200ミリ秒）を取得するために必要な最小限に抑えています。
8. 実験は、時系列画像収集ソフトウエア（IQ）を活性化することによって開始されます。一般的に画像は、0.1 Hzで取得され、照明は、ソフト制を用いて画像取得の期間に限定されています制御シャッターを再。はるかに大きい画像取得レートを使用することができますが、引当金は、漂白し、細胞への光損傷に起因するアーチファクトの世代の問題（説明を参照）ごとに行う必要があります。 IQは（そして他のほとんどの買収のソフトウェアプラットフォーム）実験中に蛍光のリアルタイムのグラフ化が可能になります。
9. 3-5分の持続時間の生理食塩水の成分の操作（そのような[Ca ^{2 +]}の_Oなど）と薬物のアプリケーションの制御周期後に灌流ヘッダー内の生理食塩水の置換によって達成される。各刺激の加算の時間が記載されているので、撮影室に到着のその時は、ここで説明する、レスポンスが遅い（0.1 Hzでサンプリング）の評価のための十分な精度を提供する、計算することができます。より迅速な応答では高い精度は、ワーナーRC20室に設けられた第2流入ポートを介して生理食塩水の流れに直接刺激を加えることによって達成することができます。
10. 画像は、IQを使用してオフラインで分析されています。興味（ROIを）の領域は、各セルの周りに描かれている（または細胞の一部）と、セルの空き領域は、ソフトウェアによる自動バックグラウンド除去のために（選択されています。画像のシリーズは、先体反応を停止したか、受けた細胞を除去するためにチェックされている（その実験中）細胞質色素の損失が続く蛍光の大規模かつ急速な増加として表示され、時系列として解析するときにアーティファクトを引き起こすのに十分な動きを示したもの。
11. 時間の蛍光強度のシリーズは、各ROIのために取得され、これらのデータは、Excelでオフラインで分析されています。最初は蛍光は、式を使用して、制御期間中に得られた平均値に正規化されてR = [（FFの_残り ）/ F _残り ] × 100％は、Rは制御周期に比べて蛍光の％の変化であるときは、F蛍光強度である時刻tとFの_{残りの部分は、}制御期間中に得られたFの少なくとも30測定の平均です。

代表的な結果

図1は、細胞を3μMのプロゲステロンで刺激した実験からの一連の画像を示しています。上段と映画1はグレースケールの蛍光画像と同じ魔術を示す（表の'16_colorsルックアップ擬似カラーで（と映画では2）を以下に示す"イメージJに）、ここで、"クール"色が低い蛍光強度を示し、 "暖かい"色が高い蛍光強度を示している。細胞は、IQのルックアップテーブルを用いて、実験中に擬似カラーで表示できますが、グレースケールを使用すると、一般的に評価するためのより有益です。細胞はよく標識かどうかをすることができます。最初の二つの画像は、0秒と100秒の録音を開始した後に採取した。蛍光が安定しており、後の先体領域と精子の首で最強になる傾向があります。プロゲステロンは、約175秒で撮影室に入り^、3番目と4 ^番目の画像（180秒および220 s）は[Ca ^{2 +]} iの（蛍光）セルの後部頭頸部領域に起因するの急速な増加を示しています。その後の画像は、初期の減衰を示し、290、360、740、990から1440秒にあり[Ca ^{2 +]} iの一過性と二次持続的上昇の開発。図2は、正規化された蛍光の各ROI（制御周期に比べて蛍光の％の変化）のために生の蛍光値を変換し、スプレッドシートの分析を示す図3は、3μMのプロゲステロンに"典型的な"応答を示す3個の細胞のための時間正規化蛍光のプロットを示しています。

プロゲステロンで刺激した細胞から図1の例のデータ。グレースケール（上段）と擬似カラー（下段）の蛍光画像のシリーズが表示されます。タイムポイントは0、180、220、290、360、990sです。 3μMのプロゲステロンは175秒で撮影室に入りましたROIは最初のパネルに表示されます。

図2 Excelでの単一細胞の蛍光のデータの分析。黒内の数値は、垂直に配置された蛍光データの時系列です。赤色の数字は（下）テキストで与えられた式を用いて得られる正規化されたデータです。グラフには、刺激により、小さな振動の遅い立ち上がりと続く一連の蛍光の一過性上昇を示し、この実験ではセル64の正規化蛍光リアルタイムプロットを示しています。

値を制御する点で％の変化として表現される3個々のセルについては、 図3。蛍光リアルタイムトレース、.. 3μMのプロゲステロンは、矢印でマークされた時に追加されました。破線で示すには、コントロールの蛍光を意味する。

Discussion

正常に実行する場合は、この手法により、ヒトの精子における自発的および誘導のCa ^{2 +}シグナルの分布と動態の記録。レスポンスは、人間の精子が自分の自発的な刺激のCa ^{2 +}シグナルの変動の多くを示すことができるので重要である細胞（最大200）の多数から得ることができる。成功したラベルと記録中の細胞の生存は、サンプルの品質に大きく依存しています。悪いサンプルは貧しいラベル付け、不良反応と細胞が録音中に死ぬ可能性を与える。

ヒト精子の写真損傷に非常に敏感であり、それゆえ我々は細胞の生存を最大化し、細胞死に起因するアーチファクトを最小限に抑えるために最低限必要な照度を（強度と露光時間の両方）を使用します。高感度カメラは、（低輝度照明の使用を許可する）カメラが弱い蛍光をピックアップするので大きなメリットです。裏面照射型、EM - CCDカメラは、非常に高価なのに、特に適しています。代わりに、励起フィルターとキセノンや水銀ランプを使用してのLED照明は、（また、細胞の生存（西垣ら、2006）が向上します。

フラは、UV光で励起する必要があるため、それがそれぞれの比率の2つの画像を撮影する必要があるので、私たちは、レシオメトリックイメージングの明白な利点にもかかわらず、フラ-2を使用しないでください。単一波長、可視光の染料、蛍光強度の正規化で得られたデータについては、主に細胞間の色素ローディングの違いのためではなく、個々のセル内の色素分布を補正し、これは留意する必要があります。単一波長の色素は、原則として、キャリブレーションすることができますが、技術の精度が悪く、我々はこれを行うにはしないでください。

さらにキャリブレーションなしフラ-2（または放出比染料インド）、、で得られた比のデータが[Ca ^{2 +]} iの相対的な変化の許容忠実な表現を与えるのに対し、単一波長の色素の蛍光強度が直線的にはほど遠いです。の[Ca ^{2 +]} iに関連して飽和曲線の最も有用な部分を介して単一波長の色素の関係は、通常、対数に近似している。我々は現在使用オレゴングリーンBAPTA - 1（図4）それは小さな変化に敏感であるための[Ca ^{2 +]} iは近いレベルの（50 nM）を休憩する。するときの[Ca ^{2 +]} iは1μMの応答は蛍光変化の観点から過少表現され、染料が飽和する可能性を超えて上昇。 UV励起に頼ることなく、技術の向上のためのオプションは、このようにみたFluo - 3、フラ赤などの染料でロードセルを2倍にすること。両方は、488 nmで励起が同時に彼らの反応は非常に異なっていることができます。 540と650 nmでの発光の記録は^、[+のCa ^2] iの（Haughland、2002）と精子（Nisigakiら、2006）に適用される可能性があるの正確なモニタリングのためのより良い方法を提供することができます比を提供します。

図4。オレゴングリーンBAPTA - 1およびオレゴングリーンBAPTA - 2用のフリーの[Ca ^{2 +]（nM）}およびピーク波長（約525nmの）での蛍光発光との関係。 OGB1は〔Ca ^{2 +]}が、より低いレベルで飽和し、その結果、より小さい使用可能な範囲を持って休んでより高い蛍光を示します。これらのプロットのデータは、Molecular Probes社ハンドブック（Haughland、2002）から得た。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low light level Camera	QImaging	Rolera XR
Oregon Green BAPTA-1	Invitrogen	06807
Imaging Software	Andor	IQ
Imaging Software	National Institutes of Health	Image J	Public domain software
LED illumination system	Cairn Research	Opto LED
Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)	Invitrogen	P3000MP