Summary
このビデオでは、後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、フラ-2を使用してカルシウム濃度の神経突起伸長とイメージングを示す。
Abstract
このビデオでは、我々は後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。手順は蛹殻形成後70〜78時間で動物からの脳の除去から始まります。分離された脳は、無血清増殖培地で数回の洗浄に続いて、パパインで短いインキュベーションの後に表示されます。カバースリップ上のメディアの5μlのドロップで各脳の機械的解離のプロセスが図示されている。有糸分裂後のニューロンの軸索と樹状突起は、解離中に相馬の近くにオフsheeredしかしニューロンは、メッキの数時間内のプロセスを再生成を開始されています。画像は2日間でライブの文化を示しています。神経細胞は、培養中の最初の週の間にプロセスを詳しく説明し続ける。特定の神経集団は、GFPやRFPなどの蛍光マーカーの組織特異的発現を駆動するためにGAL4ラインを使用して文化の中で識別することができます。全セルの録音は、機能的、自発的にアクティブなコリン作動性およびGABA作動性シナプスを形成する培養神経細胞を実証している。短いビデオセグメントは、培養神経細胞の皿で自発的カルシウムトランジェントとニコチン誘発カルシウム応答を監視するためにカルシウム指示薬としてフラ-2を用いて培養神経細胞でのカルシウム動態を示しています。これらの蛹の脳の文化は遺伝的および薬理学的ツールは、中央のシナプスの形成と機能に影響を与える内因性および外因性の要因を識別するために使用できる有用なモデルシステムです。
Protocol
培養の一日前の準備：
- 無菌解剖ソリューションとなります。
- 滅菌DMEMを作成し、2週間に4℃で10mlのアリコートにしてください。
- 1ヶ月に50または100μlアリコートで滅菌DDM2サプリメントや凍結を行います。
- 錯那/ラミニンください。
- コートのカバースリップ。
オプション：最大4ヶ月間冷凍無菌CNBMや店舗を作る。
培養の日に
I.は、層流フードで酵素液（ES）を準備
- 15 ml遠心チューブに溶液（DS）の解剖を5mlを入れてください。
- 0.6ミリリットルエッペンドルフのL -システインの0.8 mgを秤量し、DSを150μlを加える。結晶がなくなるまで、最大ピペッティングしてダウン。
- 5mlのDSにDS /システインの150mlを加え、よく混ぜる。
- パパインの50 U（ユニット）を追加します。
- 0.1 NのNa OH 7 mlを加え、よく混ぜる。解決策は、30分以内にクリアされます。アクティブになったとき。
- 滅菌済み1.5 mLスクリューキャップマイクロチューブに0.2 mmのシリンジフィルターとフィルター酵素溶液
パパイン：5 mlのDSで50 Uが欲しい。各バッチはわずかに異なっているので、どれだけ計算する必要があります。
37.3 mg / mlのおよび28.3 U / mgの
37.3 X 28.3 = 1055.59 U / mlの（1000 ml）を
50 U = 47.4ミリリットル
II。 DDM2メディアを作る
培養の当日：DDM2を作るために、以下のサプリメントを追加する
にDMEMを10mlだけ培養する前に、サプリメントを追加します。
- 100μlのトランスフェリン
- 100μlのプトレシン
- 100μlのセレン
- 100μlのプロゲステロン
- 50μlのインスリン
- 10μlの20 - ヒドロキシ
注 ：計画、すべての文化のために十分なDDM2確認（各脳は個々の35ミリメートルペトリ皿、メディア/文化の1.5ミリで、単一のカバースリップ上に播種）
ステップは、III - VIは行わ非無菌実験台にすることができ、45分以内で完了する必要があります。
III。蛹コレクション
- 解剖顕微鏡下でバイアルの側面10から15サナギを選択します。
- 乾燥35ミリメートルのペトリ皿の蓋で蛹を置きます。
注 ：我々は一般的に蛹殻形成（APF）の後に55〜78時間の間に蛹から脳を使う。頭部カプセルが崩壊する傾向があるので、神経突起伸長の全体的なレベルは、最古のサナギからわずかに低くなっている間は、若い蛹から脳を解剖することが少し難しくなります。カントン- S野生型株では、これらのステージは別の場所で少し顔料で、やや赤みを帯びた茶色に軽い色素沈着の目で認識されます。
IV。解剖顕微鏡下で断頭
- 蛹の横の場所ペトリ皿の蓋で滅菌解剖ソリューションの2滴を、。
- そっと左手で細かい鉗子を持つ単一の蛹を保持し、蛹の前端でキューティクルを削除するには右側に1 ccシリンジに接続された27ゲージの注射針を使用してください。
- 鉗子で少し蛹をつまんで、頭が現れるように首を切断するために27ゲージの針を使用してください。
- 針や鉗子の先端で、ソリューションを解剖からドロップする頭を転送する。
- 単一のドロップの10〜15頭になるまで繰り返します。
解剖顕微鏡下で頭部から脳のV.除去
- それぞれの手に27ゲージの針を1 ccシリンジを保持する。
- 口吻が手前になると頭の背側表面が北になるようなソリューションを解剖のドロップでフライヘッドを配置するためにこれらを使用してください。
- 頭を突き止めると、腹側から背側表面に行く右目にスリットを行う権利針を使用して口吻に左針を挿入します。
- 口吻の領域で左の近くに右の針を挿入し、ゆっくりと右眼のスリットに向かって脳を押すと、左眼上のキューティクルを抑制するために左針を使用してください。脳は多くの場合、光LOの両方で、相対的に無傷の、右側のスリットから出てくるはずBESは同様にまだ取り付けられており、場合によっては色素性眼組織。
- 針と新しい滅菌は35mmシャーレ内滅菌解剖生理食塩水の低下への転送の後ろに脳をプッシュします。
- 各遺伝子型10-15脳を収集する。
VI。光のローブと酵素処理の除去
- それぞれの手に27ゲージの針で1 ccシリンジを保持し、解剖溶液の液滴の小さな領域内のすべての脳を収集するためにこれらを使用して
- 文化のために残っている組織は、中央の脳の領域であるように、各脳から光のローブを削除するには、切削工具としてシリンジを使用してください。
- 無菌パパイン溶液1mlを含むエッペンドルフチューブに、単一の遺伝子型のすべての脳を転送するために、5μlの時に設定を20μlpipetmanを、使用してください。
- 脳は60 rpmで回転体セットで10-15分間パパインでインキュベート。
- 3分間3000rpmで遠心する。
無菌層流フードの内側 - 組織が空気にさらされているすべての手順の残りの手順のために層流フードで行う必要があります。
VII。洗浄
- 酵素溶液を除去し、無菌解離溶液を交換してください。
- 3分間3000rpmで遠心する。
- 無菌解離液で3回の合計を洗ってください。
- 解剖生理食塩水を削除するとDDM2を交換してください。
- DDM2で2回の合計を遠心して洗浄。
- 滅菌35ミリメートルシャーレに脳とメディアを転送する。
VIII。解剖顕微鏡下で粉砕し、めっき
- カバーの中央にDDM25μlのを置きます。
- 黄色の先端とDDM2のこのドロップを1脳を転送する。
- 顕微鏡下で、小さな断片（<1分を取るべきである）に脳をダイシングするために27ゲージの針を使用してください。
- 視覚的な指導の下で、大きな断片が静かにピペットの先端に吸い込まや培地中に戻って追放することができるように細かい点に引かれているガラスピペットの先端を破る。我々は、100μlのヘマトクリット毛細管ガラスが標準装備されて口の吸引管を使用。
注意 ：メディアの気泡を取得しないように注意してください、あなたは経験的に使用する最適なサイズのピペットを決定する必要があります。良いものは、約30秒/脳の中で、いくつかの個々のセルとまだいくつかの大きな塊で脳を解離することができます。あなたがより高い電力でこれらを見たとき、ニューロンの約10〜20％は、まだいくつかのプロセスが残っているはずですし、まだいくつかの大きな塊があるでしょう。あなたはあまり解離の場合は、すべての細胞が円形になり、彼らは生き残ることはありませんので、多くの被害を被っているでしょう。このステップでは、練習を取り、迅速に変更できる大きな表面積対体積の比とDDM2のドロップの浸透圧やpHがあるので、迅速に行う必要があります。組織は、可能な限り迅速にCO 2インキュベーター内に配置する必要があります。 - "遺伝子型、日付と時刻"：ペトリ皿の蓋に書いてください。
- 100ミリメートルペトリ皿（ウェットキムワイプを使用）が35ミリメートルのペトリ皿を置き、30分間CO 2インキュベーター内で解決しましょう。
- DDM2 1.5 mlの35 mmディッシュをあふれさせる。
- 5％CO 2インキュベーター（23℃）でのインキュベーターで培養してください。
注意 ：冷却CO 2インキュベーターへのアクセス権がない場合は、標準的な哺乳動物の組織培養インキュベーターを使用し、どちら° C、または研究室に入れ、温度をオフにし、使用する23に涼しい部屋と暑さの中に入れ周囲の周囲温度を調節するためにインキュベーターの下部にあるトレイに氷。
IX。摂食細胞
- CNBM/B27：1日目（翌日）に、3:1 DDM2を作るCNBM/B27の0.5ml（馴化培地）を追加します。
- CNBM/B27：5日目に3時01分DDM2用培地1 mlを交換してください。
- CNBM/B27ごとに4-5日：3:1 DDM2で餌細胞を保管してください。
注 ：培養物は、非神経細胞馴化培地に栽培が神経細胞が少し壊れやすく表示され、電気生理学的実験で使うために、より困難であることができる。
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Discussion
彼らは神経突起を拡張し、機能的なシナプス結合を形成する場所胚/出生後のげっ歯類の脳から採取した神経細胞は初代培養細胞で増殖させることができる。これらの培養物の調製方法は十分に確立されており、げっ歯類ニューロン培養の研究は、シナプス形成と機能の調節（バンカーとゴズリン、1991）に関与する遺伝子と環境要因を特定する上で重要な役割を果たしている。様々な種から昆虫のニューロンはまた文化の中で成長することができるが、文化の中で機能的なシナプス結合を形成するために示される唯一の昆虫のニューロンは、ショウジョウバエ（ロールボーら、2003）からです。定義されているメディアで栽培中期原腸段階のショウジョウバエの胚を採取した神経芽細胞は電気的興奮性と形態、機能、ニューロン間のシナプス結合（;リーとオダウド、1999オダウド、1995）であるニューロンを生じさせる。我々は後期ショウジョウバエ（蘇とオダウド、2003）の脳から収穫し、培養神経細胞のためのこのビデオで示した手法を開発した大人の行動を媒介に関与することが知られているニューロンのシナプス形態と機能を調節する因子を同定する。この手順の主な特徴の1つは、パパイン、代わりのコラゲナーゼまたは伝統的に昆虫のニューロン培養の調製に使用される他の過酷な酵素を使用することでした。生き残る短い軸索のプロセスを保持解離ニューロンにおけるパパインの結果は、神経突起のプロセスを再生成し、機能的なニューロン間のシナプス結合を形成する。キノコ体ケニヨン細胞を含む特定された細胞集団、全体の録音は、抑制はGABA受容体（蘇とオダウド、2003）媒介している間の文化の速い興奮性シナプス伝達がnAChRsによって媒介されることを示している。我々の最近の電子顕微鏡分析は、化学と成体脳における電気的シナプス（ああら、2007）の両方に似ている構造的な特徴を持つ文化のフォームのシナプスにおけるニューロンことを示している。ビデオに示すように、文化にもフラ-2カルシウムイメージング研究に適していると我々は、ケニヨン細胞およびコリン作動性ニューロン（Jiangらを含めて同定された細胞集団における細胞内カルシウム濃度の自発及び誘発の変化の根底にある細胞メカニズムを調査するためにこれらを使用しているら、2005;。Campusanoら、2007）。。ショウジョウバエで利用可能な大規模な遺伝子ツールキットを使用してこの培養系は、中枢シナプスの構造、機能、および可塑性の内因性および外因性調節因子を同定するために非常に便利なツールを提供しています。
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Acknowledgments
この作品は、DKODにNIHの助成金NS27501によってサポートされていました。この作業のための追加サポートがHHMIの教授プログラムを通じてDKODのサポートでUCアーバイン校への助成金によって提供されていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C-2010 | To 2.5 mL DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration.Make aliquots of 90 ul and store at -20 °C, no longer than 3 months. | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | Add 1 mL DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/mL concentration.Make aliquots of 10 μL and store at -20 °C, no longer than 3 months. | |
| Coverslips | Bellco Glass | 1943-00012 | 12 mm glass coverslips | |
| ConA + Laminin solution | Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 mL DS, 83.5 μL of ConA (167 μg/mL) and 8.35 μuL of Laminin (0.835 μg/mL). Mix. Make aliquots of 100 μL and store at -20 °C, not longer than a month. | |||
| Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C. | ||
| Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label "Dissecting Solution" and store at 4?C. | ||
| Solution B: HEPES | Buffer | Sigma-Aldrich | H-3375 | 20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution B" and store at 4 C. |
| Solution A | Buffer | For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379).Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label "Solution A" and store at 4°C. | ||
| Coating Coverslips:Put autoclaved coverslips in a 60 mm petri dish.Pipet 5 ul of Con A/Laminin mix onto center of each coverslip.Place in 37 C incubator for 2 hours.Rinse 3x coverslips with 100 ul of autoclaved water each. Use vacuum attached to a sterile Pasteur pipet.During the last rinse, pick up the coverslip with forceps and dry both sides.Transfer the coverslip to a 35mm Petri dish.Store at room temperature for up to a month. | ||||
References
- Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).
- Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System. J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).
- O'Dowd, D. K. Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium. J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).
- Lee, D., O'Dowd, D. K. Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons. J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).
- Su, H., O'Dowd, D. K. Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors. J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).
- Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells. Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).
- Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture. Develop Neurobiol. , (2007).
