Summary
أحدثت عضويات الورم ثورة في أبحاث السرطان ونهج الطب الشخصي. إنها تمثل نموذجا للورم ذا صلة سريريا يسمح للباحثين بالبقاء متقدما بخطوة على الورم في العيادة. يحدد هذا البروتوكول عضويات الورم من عينات أنسجة ورم البنكرياس الطازجة والطعوم الخارجية المشتقة من المريض من أصل سرطان البنكرياس الغدي.
Abstract
عضويات الورم هي نماذج ورم ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي تلخص السمات البيولوجية الرئيسية لأنسجة الورم الأولية الأصلية. تم استخدام عضويات الورم المشتقة من المريض في أبحاث السرطان الانتقالية ويمكن تطبيقها لتقييم حساسية العلاج ومقاومته ، وتفاعلات الخلايا الخلوية ، وتفاعلات الخلايا السرطانية مع البيئة المكروية للورم. عضويات الورم هي أنظمة زراعة معقدة تتطلب تقنيات زراعة الخلايا المتقدمة ووسائط الاستزراع مع كوكتيلات عامل نمو محددة وغشاء قاعدي بيولوجي يحاكي البيئة خارج الخلية. تعتمد القدرة على إنشاء ثقافات الورم الأولية بشكل كبير على نسيج المنشأ والخلوية والسمات السريرية للورم ، مثل درجة الورم. علاوة على ذلك ، فإن جمع عينات الأنسجة ، وجودة المواد وكميتها ، بالإضافة إلى البنوك الحيوية الصحيحة والتخزين هي عناصر حاسمة في هذا الإجراء. كما أن القدرات التقنية للمختبر هي أيضا عوامل حاسمة يجب مراعاتها. هنا ، نبلغ عن إجراء تشغيلي موحد / بروتوكول تم التحقق من صحته وهو مجدي تقنيا واقتصاديا لثقافة عضويات الورم خارج الجسم الحي من عينات الأنسجة الطازجة من أصل غدية البنكرياس ، إما من أنسجة المتبرعين بالمرضى الأولية الجديدة أو الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX). يمكن إجراء التقنية الموصوفة هنا في المختبرات ذات زراعة الأنسجة الأساسية ومرافق الفئران وهي مصممة للتطبيق على نطاق واسع في مجال الأورام الانتقالي.
Introduction
عضويات الورم هي ثقافات منظمة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي مشتقة من أنسجة الورم الطازجة وتوفر نماذج سرطانية. تلخص عضويات الورم السمات البيولوجية الرئيسية للورم الأولي الأصلي1،2،3،4 ويمكن توسيعها لمدة تصل إلى عدة أشهر وحفظها بالتبريد ، على غرار خطوط الخلايا الخالدة التقليدية. توفر عضويات الورم بنكا حيويا لنماذج الورم المشتقة من المريض للطب الانتقالي / الشخصي5 وتمثل تقدما مهما في أنظمة / نماذج بيولوجيا الخلايا السرطانية. يمكن استخدام عضويات الورم المشتقة من المريض كنماذج خارج الجسم الحي للتنبؤ بفعالية علاجات الأورام / الأدوية المساعدة (الجديدة) ، والتي يتم إنشاء ثقافات لها من أنسجة الورم الطازجة ويتم إجراء فحوصات حساسية الدواء أو التنميط الدوائي على أساس خاص بالمريض لتحديد العوامل الفعالة لخطوط العلاج اللاحقة 1,4. علاوة على ذلك ، تتغلب الكائنات العضوية السرطانية على محدودية توافر أنسجة الورم الأولية ، والأهم من ذلك ، أنها توفر بديلا ممتازا أو نظاما تكميليا لنماذج الفئران في الجسم الحي ، مثل الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) 2. يزداد تعقيد عضويات الورم إذا تم دمج الخلايا السرطانية الأولية مع الخلايا اللحمية الموجودة في البيئة الدقيقة للورم (TME) ، مثل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) ، والخلايا البطانية ، والخلايا المناعية ، والتي تحاكي عمل الورم الرئيسي وخلويته المعقدة. تم إنشاء عضويات الورم للعديد من أنواع الأورام باستخدام بروتوكولات موحدة6،7،8،9،10. الانتشار العضوي من الأورام الصلبة المختلفة ، بما في ذلك أنسجة سرطان القولون والمستقيم والثدي ، راسخ وبأسعار معقولة تقنيا11،12،13،14،15.
توفر عمليات استئصال الورم الجراحية أو خزعات الورم عينات أنسجة الورم الأولية. من الناحية المثالية ، يجب أن تأتي عينات أنسجة الورم من مركز كتلة الورم أو الحافة الغازية للورم ، وكذلك الأنسجة ذات المظهر الطبيعي المجاورة للورم. بالمقارنة مع الثقافات التقليدية 2D ، تتطلب عضويات الورم العديد من "الإضافات" ، بما في ذلك الغشاء القاعدي البيولوجي (مثل Matrigel أو hydrogel أو سقالة قائمة على الكولاجين) ، والتي تحاكي TME خارج الخلية ، ووسط نمو سائل يوفر مغذيات محددة وعوامل نمو ويدعم تكاثر الخلايا وصلاحيتها في الثقافة16.
تتمثل الخطوات الأساسية في زراعة الخلايا الأولية في غسل الأنسجة في محلول ملحي لمنع التلوث ، وقطع / هضم الورم ميكانيكيا إلى قطع صغيرة من 1-3 مم3 ، والعلاج بالكولاجيناز للهضم الأنزيمي للأنسجة. ثم يتم ترشيح المزيج المهضوم لإزالة شظايا الأنسجة الكبيرة ، وإعادة تعليقه في غشاء قاعدي بيولوجي مثل Matrigel ، ومطلي كقباب في ألواح ثقافة منخفضة التعلق لتعزيز نمو عدم التعلق. يتم تغطية قباب مصفوفة الغشاء القاعدي بوسط ثقافة سائلة وتستكمل بالجلوتامين والمضادات الحيوية لتجنب التلوث ، وكذلك بعوامل نمو محددة اعتمادا على نوع الأنسجة7،8،9،16،17. يمكن أيضا عزل الخلايا الأخرى ذات الصلة الموجودة داخل الورم السائب و TME ، مثل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) والخلايا المناعية. تسمح هذه التقنية ، التي تمت مراجعتها مؤخرا18 ، بإنشاء ثقافات مشتركة مع أنواع مختلفة من الخلايا لدراسة الاستجابة للعلاج في بيئة ورم أكثر "واقعية". علاوة على ذلك ، يمكن دراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والتفاعل بين الخلايا السرطانية ومكونات المصفوفة البيولوجية المحيطة.
يبلغ معدل النجاح المبلغ عنه لإنشاء الورم العضوي باستخدام أنسجة جديدة من الخزعات أو أنسجة ورم الجهاز الهضمي المقطوعة حوالي 50٪ 11 ، ويعتمد معدل النجاح من الأخير إلى حد كبير على نوع الأنسجة وأصلها4 ، لا سيما درجة الورم وخلوية الورم بشكل عام. تتميز نماذج الأورام ثلاثية الأبعاد بتعقيد متفاوت ، من المجاميع أحادية الخلية البسيطة إلى النماذج الهندسية المعقدة للغاية التي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا. المصطلحات المستخدمة لوصف الثقافات ثلاثية الأبعاد في الأدبيات غير متسقة إلى حد كبير19،20،21 ، حيث يتم استخدام مصطلحات مختلفة مثل الأجسام الكروية وكرات الأورام والكائنات العضوية ، على الرغم من أن الفرق بينهما غير واضح. نظرا لأنه لم يتم التوصل بعد إلى إجماع واضح على التعريف ، في هذه المقالة ، يوصف العضو العضوي الورمي بأنه ثقافة خلية ورمية منظمة مضمنة في غشاء قاعدي بيولوجي.
هنا ، تم الإبلاغ عن بروتوكول تم التحقق من صحته لإنشاء عضويات الورم من عينات الأنسجة الطازجة الناشئة من سرطان البنكرياس الغدي القنوي الأولي أو المشتق من PDX (PDAC) ، ويمكن إجراء هذا البروتوكول في معظم المختبرات مع مرافق زراعة الأنسجة الأساسية. تم تكييف هذا البروتوكول من العديد من البروتوكولات الحديثة المبلغ عنها والتي تستخدم حاليا لإنشاء عضويات الورم أو الأورام من أنسجة الورم الهضمي من مجموعات David Tuveson9 و Hans Clevers8 و Aurel Perren7.
لا يناقش هذا البروتوكول كيفية حصاد الأنسجة الطازجة. للحصول على أنسجة أورام بشرية طازجة عالية الجودة ، من المهم أن يكون هناك تنسيق فعال بين الجراحين الذين يحصدون الأنسجة وقسم علم الأمراض الذي يستخرج عينة الأنسجة للثقافة العضوية. وبالمثل ، عند استخدام PDX كمصدر جديد للأنسجة ، فإن التنسيق الفعال مع الشخص الذي يحصد عينة الأنسجة مهم أيضا. من الأهمية بمكان الحصول على عينة الأنسجة في أسرع وقت ممكن (في غضون 30-60 دقيقة من وقت الحصاد) من أجل الحفاظ على جودة عالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية التجارب التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات بجامعة مدريد المستقلة (CEI 103-1958-A337) و La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) ووفقا للمبادئ التوجيهية للسلوك الأخلاقي في رعاية واستخدام على النحو المنصوص عليه في المبادئ التوجيهية الدولية للبحوث الطبية الحيوية التي تشمل ، تم تطويره من قبل مجلس المنظمات الدولية للعلوم الطبية (CIOMS). اتبع البروتوكول المبادئ الأخلاقية للبحوث الطبية الحيوية بموافقة خطية مستنيرة. تم الحصول على موافقة أخلاقية مسبقة لاستخدام الأنسجة الطازجة لإنشاء مزارع الورم العضوية. تم تقديم العينات من قبل مستشفى البنك الحيوي Ramón y Cajal-IRYCIS (السجل الوطني للبنوك الحيوية B.0000678) ، وتم دمجها في منصة البنوك الحيوية والنماذج الحيوية الخاصة ب ISCIII (PT20 / 00045) ، ومعالجتها وفقا لإجراءات التشغيل القياسية مع الموافقة الأخلاقية المناسبة. تم زرع الأورام تحت الجلد ، كما هو موضح سابقا22 ، في إناث الفئران العارية NU-Foxn1nu البالغة من العمر 6 أسابيع (انظر جدول المواد) وتم تمريرها في الجسم الحي لإنشاء PDAC PDXs.
1. التحضير التجريبي
- التعامل مع العينات البشرية في خزانة السلامة الأحيائية من الدرجة الثانية.
- ارتد معطف المختبر والقفازات الواقية والنظارات طوال الإجراء لتجنب العدوى بمسببات الأمراض المنقولة بالأنسجة.
ملاحظة: مطلوب ما لا يقل عن 3 ساعات لمعالجة عينة الأنسجة الطازجة ولوحة المواد العضوية والخلايا الليفية. - قم بمعالجة عينات الأنسجة الطازجة22 في غضون 24 ساعة كحد أقصى من الحصاد ، وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في وسط زراعة الأنسجة (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين) حتى المعالجة.
- احتفظ بجميع العينات والكواشف على الجليد أثناء الإجراء بأكمله ، وتأكد من ضبط جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا على 4 درجات مئوية واستخدامه بسرعة منخفضة لتجنب إتلاف تحضير الخلية.
- قم بتخزين أطراف ماصة P1000 و P200 في مجمد بدرجة حرارة -20 درجة مئوية لاستخدامها أثناء البروتوكول.
- قسمة مصفوفة الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) قبل الاستخدام. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يوصى باستخدام 250 مل من القسامة.
2. معالجة أنسجة الورم الأولية الطازجة لإنشاء عضويات الورم والخلايا الليفية الأولية
ملاحظة: مطلوب ما لا يقل عن 3 ساعات لمعالجة عينة الأنسجة الطازجة (إما الأورام البشرية الأولية القابلة للاستئصال أو PDXs) ولوحة عضويات الورم والخلايا الليفية. يوضح الشكل 1 مخططا لعملية تحضير العضو العضوي، من هضم الأنسجة إلى طلاء عضويات الورم. قبل بدء البروتوكول ، أخرج حصة من مصفوفة الغشاء القاعدي من الفريزر -20 درجة مئوية ، واتركها على الثلج لمدة 30-60 دقيقة تقريبا قبل الاستخدام.
- ضع صفيحة استزراع ذات 6 آبار في حاضنة زراعة الخلايا 37 درجة مئوية قبل 3 ساعات من طلاء المواد العضوية.
- قم بقياس وتصوير وغسل الأنسجة (الخطوة 1.3) ب 3 مل من DMEM-F12 المتقدم (وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) / خليط المغذيات F-12 Ham (F12) ، المكمل بمصل بقري جنيني 5٪ (FBS) ، 15 مللي مول هيبس ، 1٪ ل-جلوتامين ، 1٪ بنسلين-ستربتومايسين ، 125 نانوغرام / مل أمفوتريسين ب ، 0.1 مجم / مل نورموسين) (انظر جدول المواد) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ثم غسله ب 3 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
- قم بإزالة الوسائط عن طريق الشفط من لوحة زراعة الأنسجة وقطع الأنسجة إلى 1 مم3 قطع في صفيحة زراعة الأنسجة المعقمة باستخدام شفرتين معقمتين و 2 مل من وسط الهضم (Advanced DMEM-F12 + 10 mg Collagenase IV / mL ، 0.000625٪ Trypsin-EDTA ، و 10 ميكروغرام / مل DNase). اجمع الأنسجة في أنبوب سعة 50 مل بإجمالي 5 مل من وسائط الهضم واحتضانها لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهضم الميكانيكي باستخدام المعدات المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) أو بالخلط الدوري للعينة ، عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
- أضف 5 مل من Advanced DMEM-F12 لتعطيل التربسين ، وقم بتصفية العينة من خلال مصفاة مسام 70 ميكرومتر لإزالة الحطام الكبير.
- أضف 2 مل من DMEM مع 10٪ FBS إلى الجزء العلوي من المرشح ، واجمع الحطام وبقايا الأنسجة لإنشاء مزارع الخلايا الليفية (انظر الخطوة 5).
- أجهزة الطرد المركزي الترشيح في 200-300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ونضح طاف ، وترك فقط بيليه الخلية. أضف 5 مل من Advanced DMEM-F12 ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
- أعد تعليق الحبيبات في 4 مل من محلول تحلل كلوريد الأمونيوم (ACK ، انظر جدول المواد). مرر الخليط إلى أنبوب سعة 15 مل ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة لتحلل خلايا الدم الحمراء.
ملاحظة: يمكن إزالة خطوة تحلل خلايا الدم الحمراء هذه عندما لا يكون هناك دليل واضح على التلوث. - أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ونضح المادة الطافية. أضف 5 مل من Advanced DMEM-F12 ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
- أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) المكمل ب DNase (1 ميكروغرام / مل) إلى حبيبات الخلية ، واحتضانها لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق ، ونضح طاف. أضف 5 مل من Advanced DMEM-F12 ، وأعد تعليق حبيبات الخلية.
- ماصة صعودا وهبوطا 30 مرة مع ماصة P1,000 لفصل الخلايا ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × غرام ، وإزالة المادة الطافية.
- خذ أطراف ماصة P1,000 و P200 من الفريزر -20 درجة مئوية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في مصفوفة الغشاء باستخدام ماصة P1,000 وأطراف باردة (50 ميكرولتر لكل قطرة ، مع مراعاة حجم الحبيبات ، من ستة إلى سبعة قباب لكل بئر). أخرج اللوحة التي تم تسخينها مسبقا من الحاضنة. اضبط ماصة P200 على 48 ميكرولتر ، واستخدم الأطراف الباردة لإنشاء قباب من مصفوفة الغشاء القاعدي في لوحة 6 آبار مسخنة مسبقا.
- ضع اللوحة مع قباب مصفوفة الخلايا الغشائية القاعدية في حاضنة CO2 37 °C 5٪ لمدة 15 دقيقة لترسيخ مصفوفة الغشاء القاعدي.
- أضف 2-2.5 مل من DMEM-F12 المتقدم ، مع استكماله بعامل نمو البشرة البشري المؤتلف 20 نانوغرام / مل (EGF) ، وعامل نمو المشيمة البشرية 100 نانوغرام / مل (PlGF) ، وعامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسية المؤتلف 10 نانوغرام / مل (bFGF) ، وعامل النمو الشبيه بالأنسولين 769 نانوغرام / مل -1 (IGF-1) ، ومثبط ROCK 10.5 ميكرومتر (DMEM-F12 المتقدم + عوامل النمو) (انظر جدول المواد).
3. مراقبة المواد العضوية
- مراقبة ثقافة الورم العضوية بصريا لأول 7 أيام ثم ثلاث مرات في الأسبوع بعد ذلك.
- قم بتغيير الوسط مرتين في الأسبوع باستخدام DMEM-F12 المتقدم الذي يحتوي على 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة البشري المؤتلف (EGF) ، وعامل نمو المشيمة البشرية 100 نانوغرام / مل (PlGF) ، وعامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسية المؤتلف 10 نانوغرام / مل (bFGF) ، وعامل النمو الشبيه بالأنسولين 769 نانوغرام / مل -1 (IGF-1) ، ومثبط 10.5 ميكرومتر ROCK (DMEM-F12 المتقدم + عوامل النمو).
- التقط صورا لثقافة الورم العضوية بشكل دوري في اليوم 1 واليوم 3 واليوم 7 واليوم 10 واليوم 15 بعد معالجة العينة وطلاء الثقافة في المصفوفة لمراقبة النمو والجدوى.
4. مرور وتخزين المواد العضوية بالتبريد
- قم بإزالة وسط الاستزراع من لوحة 6 آبار.
- أضف 1 مل من كاشف استعادة الخلية المناسب (انظر جدول المواد) لفصل مصفوفة الغشاء القاعدي والحصول على تعليق خلية ، واستعادة المادة الطافية في أنبوب سعة 15 مل. إذا لم تنفصل المصفوفة على الفور ، احتضان العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 15-20 دقيقة حتى تذوب تماما.
- أضف 1 مل من نفس كاشف استعادة الخلية المستخدم في الخطوة 4.2 إلى بئر اللوحة لاستعادة الخلايا المنفصلة الإضافية ، وأضف المادة الطافية إلى نفس الأنبوب 15 مل كما في الخطوة 4.2.
- أضف 5 مل من DMEM-F12 المتقدم البارد ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة المادة الطافية وجفف الحبيبات بعناية عن طريق إزالة أي سائل متبقي باستخدام ماصة سعة 5 مل ؛ تجنب تحريك الأنبوب قدر الإمكان. أعد تعليق حبيبات الخلية في ضعف الحجم الأصلي لمصفوفة الغشاء القاعدي من أجل الحصول على ممر 1: 2.
- للتخزين بالتبريد للمزارع العضوية ، أعد تعليق الحبيبات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.5 بوصة 1 مل من وسط التجميد (10٪ DMSO ، 20٪ FBS ، 50٪ DMEM-F12 ، مثبط 10.5 ميكرومتر ROCK) ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تعديل حجم مصفوفة الغشاء القاعدي لأداء مقاطع مختلفة ، مثل 1: 1 (باستخدام نفس حجم مصفوفة الغشاء القاعدي مثل الأصل) أو 1: 3 (إضافة ثلاثة أضعاف الحجم الأصلي لمصفوفة الغشاء القاعدي).
5. إنشاء الخلايا الليفية
- بعد استعادة الحطام وبقايا الأنسجة في 2 مل من DMEM مع 10٪ FBS ، أضف هذا إلى لوحة 6 آبار ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- قم بإزالة بقايا الأنسجة من مزارع الخلايا الليفية من الخطوة 2.5 عن طريق شفط الوسط بعد يومين أو 3 أيام من الطلاء ، واستبدله ب DMEM الطازج بنسبة 10٪ FBS.
- راقب ثقافة الخلايا الليفية بصريا ثلاث مرات في الأسبوع ، وقم بتغيير وسط الاستزراع مرتين على الأقل في الأسبوع باستخدام DMEM المكمل ب 10٪ FBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من المهم توثيق كيفية تقدم ثقافة الورم العضوي بمرور الوقت ، خاصة في الأسابيع القليلة الأولى ، من أجل تقدير كيفية تصرف الثقافة في فحوصات المصب. يوضح الشكل 2 مثالا على العزل الأمثل للخلايا السرطانية وتكوين الورم العضوي من الأنسجة الطازجة على مدار 15 يوما. في بعض الأحيان، يوجد حجم كبير من بقايا الخلايا في العينة، ومن الصعب رؤية عضويات الورم النامية، كما هو موضح في الشكل 3. علاوة على ذلك ، يمكن أن يختلف النمط الظاهري للعضويات النامية من عضويات معزولة ومستديرة (الشكل 4 أ) إلى ثقافات كروية / شبيهة بالركام (الشكل 4B-D) ، وهذا يعتمد على أصل الورم. الخلايا الليفية هي منتج ثانوي شائع لإنشاء زراعة الخلايا السرطانية الأولية من الأورام الصلبة ، خاصة تلك التي تحتوي على نسبة عالية من السدى ، ويمكن أن تلوث في كثير من الأحيان الثقافة العضوية. يوضح الشكل 5 كيف هاجرت هذه الخلايا من قباب مصفوفة الغشاء القاعدي والتقت بألواح الاستزراع بعد حوالي 7 أيام. تستهلك هذه الخلايا العناصر الغذائية من وسط الاستزراع ، مما يضر بالنمو الأمثل للعضويات.
يمكن الحصول على الخلايا الليفية الأولية في صورة مزرعة معزولة عندما تهاجر خارج أقسام الأنسجة، وتلتصق بصفائح الثقافة، وتنمو في صورة مزرعة أحادية الطبقة، كما هو موضح في الشكل 6. يوصي هذا البروتوكول باستخدام وسيط DMEM القياسي مع 10٪ FBS لثقافة الخلايا الليفية. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام وسيط متخصص للخلايا الليفية. تظهر الخلايا الليفية الملتصقة بعد حوالي 7 أيام من الطلاء (الشكل 6).
الشكل 1: معالجة عينات الأنسجة الطازجة لإنشاء عضويات الورم. يتم عرض الخطوط العريضة لعملية تحضير الورم العضوي ، من هضم الأنسجة إلى طلاء المواد العضوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مزرعة عضوية للورم تم إنشاؤها من PDX ناشئة عن ورم PDAC جديد. يظهر تطور ثقافة الورم العضوية على مدى عدة أيام ، مع صور للعضويات في مستوى مجهري واحد في اليوم 1 واليوم 3 واليوم 7 واليوم 10 واليوم 15. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: أمثلة على ثقافة عضوية الورم غير المثلى في اليوم 2 مع بقايا الخلايا الزائدة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: عضويات الورم الراسخة من أنسجة PDAC PDX المختلفة تظهر اختلافات في الحجم والتشكل. يمكن أن يكون لعضويات الورم نمط ظاهري دائري كلاسيكي (A) أو (B-D) مظهر كروي / كلي أكثر. يتراوح متوسط حجم المواد العضوية من 80 ميكرومتر إلى 100 ميكرومتر ، على الرغم من أن بعض المواد العضوية قد تصل إلى 200 ميكرومتر. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أمثلة على مزرعة عضوية غير مثالية للورم (A-C) ملوثة ب CAFs / الخلايا الليفية بعد 30 يوما في الثقافة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: أمثلة على مزارع الخلايا الليفية الأولية التي تم إنشاؤها من بقايا نسيج الورم الأولي المهضوم . (أ) الثقافة المتقاربة. (ب) الثقافة غير المتقاربة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الملف التكميلي 1: استكشاف أخطاء مؤسسة زراعة الورم العضوي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تمثل التطورات الرئيسية في علاجات السرطان الدوائية تحديا ، حيث أن احتمال الموافقة على الأدوية في المرحلة الأولى من التجارب السريرية للأورام هو 5.1٪ ، وهو أدنى مستوى بين جميع أنواع الأمراض23. السبب الرئيسي هو أن السرطان غير متجانس للغاية ، وبالتالي ، فإن مجموعات المرضى لا تستجيب بشكل موحد كما هو متوقع للعلاج المعطى ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى نهج أكثر تخصيصا. تم استخدام الثقافات ثنائية الأبعاد (2D) في أبحاث السرطان الانتقالية لسنوات عديدة ولكنها تفتقر إلى التنظيم الهيكلي 3D الموجود في الأورام الأولية. وبالتالي ، فإنها لا تعكس بدقة استجابات علاج المريض وتواصل الخلايا السرطانية مع بعضها البعض أو مع بيئتها المكروية 3,23. المبدأ الأساسي الأساسي لجميع أنظمة ثقافة 3D هو تعزيز التفاعل الخلوي مع المناطق المحيطة وتنظيم الخلايا بطريقة ذات صلة مكانيا ، على غرار الورم الرئيسي (في الموقع). يختلف مورفولوجيا عضويات الورم من دائرية وكتلة وشبيهة بالعنب إلى نجمية اعتمادا على الطبيعة المتأصلة للخلايا المستزرعة وظروف المزرعة المستخدمة ، كما هو موضح في الشكل 4. يمكن علاج الثقافات العضوية للورم المشتقة من المريض بنفس علاج الخط الأول المستخدم في المريض من أجل التأكد من أن العضو العضوي للورم يلخص الحالة السريرية (أي استجابة العلاج السريري)1،13،24،25.
يمكن أيضا علاج عضويات الورم بعوامل دوائية جديدة ، مما يوفر نهجا استكشافيا لتحديد العلاجات الجديدة التي يمكن استخدامها في خطوط العلاج اللاحقة في العيادة عند استنفاد خيارات العلاج القياسية. تتم مراقبة الثقافة باستمرار لتقييم استجابة الثقافات العضوية للورم للعامل في الوقت الفعلي. أظهرت دراسة جدوى للتوصيف الجزيئي والكيميائي المناعي لورم الطعم الأجنبي المشتق من المريض (PDX) والكائنات العضوية المشتقة من PDX أن التشكل والتعبير البروتيني والتغيرات الجينومية كانت قابلة للمقارنة بين النموذجين. علاوة على ذلك ، أظهرت دراسة إثبات المفهوم للقوالب الدوائية أن التنبؤات في الجسم الحي وخارج الجسم الحي كانت قابلة للمقارنة أيضا ، وبالتالي خلصت إلى أن استخدام عضويات الورم كنموذج للسرطان / المرض هو نهج ممكن وقوي يمكن تطبيقه في الإعداد السريري2.
تم تسليط الضوء هنا على مجموعة من التحديات المتعلقة بإنشاء ثقافات عضوية للورم تنشأ من أنواع مختلفة من الأورام وتمت مراجعتها مؤخرا26،27،28. تشمل القضايا الرئيسية "التلوث / فرط النمو" بواسطة الخلايا السليمة ، والتي تشكل عضويات ذات معدل نمو أعلى من الخلايا السرطانية ، والتكلفة العالية لصيانة الثقافة مقارنة بالثقافات 2D ، وانخفاض معدل التأسيس ، والتناقضات في ملف الطفرة الجسدية والأنسجة بين الثقافة خارج الجسم الحي والورم الأصلي ، وعدم تجانس الورم الأولي ، واستخدام مصفوفة خارج الخلية قائمة على مورين ، التي قد لا تكون مثالية للخلايا البشرية وقد تعيق توصيل الدواء ، وغياب TME والخلايا المرتبطة به ، وتداخل عوامل النمو أو المثبطات الجزيئية مع استجابة الدواء ، وعدم وجود بروتوكولات موحدة ومعتمدة لإنشاء وصيانة عضويات الورم. ومع ذلك ، على مر السنين ، زاد استخدام نماذج الأورام الأولية في أبحاث السرطان ، وتحسنت تقنيات زراعة الثقافات الأولية والحفاظ عليها. يتم إنشاء هذه الثقافات الحساسة خارج الجسم الحي والحفاظ عليها عن طريق إضافة مكملات لتعزيز نمو الخلايا واستقرارها. يضاف الآن مثبط Rho kinase (ROCK) بشكل روتيني إلى الثقافات الأولية لتجنب موت الخلايا المبرمج وتعزيز التصاق الخلايا الخلوية ، وبالتالي تعزيز التوسع طويل الأجل في الثقافات الأولية المستقرةفي المختبر 29. علاوة على ذلك ، فإنه يزيد أيضا من بقاء الخلايا الجذعية المذابة المحفوظة بالتبريد ، وهو أمر مهم عند توليد مخزونات مجمدة من الثقافات العضوية29. يمكن أيضا استخدام مكملات الهيبارين لتعزيز توسع الخلايا الجذعية عن طريق زيادة إشارات WNT و FGF ، وبالتالي تكاثر الخلايا30. تشمل الكواشف المهمة الأخرى المستخدمة في هذا البروتوكول الذي تم التحقق من صحته لتحسين إنشاء الورم العضوي Accutase و DNase. Accutase هو كاشف هضم لطيف موصى به لفصل الخلايا الجذعية الفردية أو فصلها عن أسطح الثقافة ، ويساعد في الحفاظ على صلاحية الخلية بشكل أفضل من استخدام الكواشف الأخرى المصممة لهذا الغرض ، مثل التربسين31. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام الكولاجين لاستهداف نوع الكولاجين المدمج في الغشاء القاعدي البيولوجي على وجه التحديد. تم استخدام DNase في طرق عزل الخلايا لسنواتعديدة 32 للقضاء على بقايا الحمض النووي من الخلايا الميتة والنخرية أثناء بروتوكول الاستخراج ، وبالتالي منع تكتل / تجميع الخلايا بسبب زيادة لزوجة تحضير العينة. غالبا ما تتم معالجة كريات الخلايا بمحلول التحلل ، ولكن يمكن استبعاد هذه الخطوة عندما لا يكون هناك دليل واضح على تلوث خلايا الدم الحمراء لعينة الأنسجة8 (الملف التكميلي 1).
لا يأتي الإنشاء الناجح لعضويات الورم بدون مضاعفات بيولوجية متأصلة. من الناحية المثالية ، يجب معالجة أنسجة الثقافات العضوية للورم في نفس يوم الحصاد لتحسين صلاحية الخلية. لا ينصح دائما بتجميد الأنسجة لأنه قد يقلل بشكل كبير من صلاحية الخلية. ومع ذلك ، يمكن إنشاء عضويات الورم باستخدام العينات التي تم تجميدها بسرعة أو حفظها بالتبريد ببطء في وسط التجميد المحتوي على DMSO33,34 ، مما يسمح بشحن العينات والبنوك الحيوية. في بعض الحالات ، من الممكن الحصول على ثقافات 2D من الثقافات العضوية للورم التي تم تمريرها عدة مرات عن طريق استعادة الخلايا السرطانية المرتبطة باللوحات بعد إزالة قباب مصفوفة الغشاء القاعدي. في تجربتنا ، فإن معدل نجاح إنشاء الورم العضوي أعلى بكثير مع أنسجة PDX PDAC منه مع أنسجة PDAC الطازجة المشتقة من عينة مقطوعة4. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن القطع الأكبر من أنسجة PDX PDAC الطازجة متوفرة عادة ، وهذا النسيج له خلوية أعلى ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى البيئة الأكثر ضيافة في الجسم الحي التي يوفرها نموذج PDX مقارنة بالنهج القائمة على الجسم الحي. يمكن إضافة عوامل غير سامة إلى وسط الاستزراع لمراقبة صلاحية الخلية وانتشار الثقافة. علاوة على ذلك ، يجب تجنب فرط نمو الكائنات العضوية غير الورمية باستخدام ظروف انتقائية35,36. قد تحتوي أنسجة البنكرياس على إنزيمات هضمية يمكن أن تؤثر على صلاحية الخلايا السرطانية المعزولة. وبالتالي ، يمكن إضافة التربسين إلى خطوة الهضم للتغلب على هذه المشكلة4. العديد من العوامل الأخرى ، مثل حالة المريض / الأنسجة (أي المعالجة أو غير المعالجة بعلاج الأورام) ، ونوع الورم ، وتلوث العينة من غرفة العمليات ، والدرجة الأصلية للورم ، يمكن أن تؤثر أيضا بشكل كبير على القدرة على إنشاء ورم عضوي. وبالمثل ، ليس كل نسيج لديه ما يكفي من الخلايا السرطانية القابلة للحياة لإنشاء مزارع أولية. هذا ينطبق بشكل خاص على أورام PDAC ، والتي تشتهر بغناها بالسدى (حوالي 90٪ -95٪) وتحتوي على نسبة صغيرة من الخلايا السرطانية الظهارية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الصعب قطع الأنسجة التي تحتوي على نسبة عالية من السدى وفصلها للحصول على خلايا ورمية مفردة للثقافة. يمكن إضافة وسائط هضم متخصصة ومتاحة تجاريا ، أو يمكن أيضا استخدام معدات التفكك الميكانيكية إذا لم يتم هضم الأنسجة بالكامل. بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق تفكك شامل للأنسجة عن طريق القطع المستمر باستخدام شفرتي مشرط حتى يصبح للأنسجة مظهر شبه سائل (انظر عرض الفيديو).
هناك العديد من المزالق الفنية أثناء الإجراء والتي يجب تسليط الضوء عليها أيضا. على سبيل المثال ، قد تسد بقايا الأنسجة المرشح ، ويجب بعد ذلك تغيير المرشح ، حيث تعيق البقايا مرور المادة الطافية السائلة. يمكن تكرار خطوة الترشيح عدة مرات لاستعادة أكبر قدر ممكن من الخلايا السرطانية المنفصلة. علاوة على ذلك ، من المهم التحقق من حبيبات الخلية بعد كل خطوة طرد مركزي لأنه يصعب أحيانا معرفة ما إذا كان هناك رقم خلية منخفض. يجب إجراء سحب كريات الخلية بلطف وبطء, لأن السحب العدواني قد يؤدي إلى فقدان الخلايا أو تقليل صلاحية الخلية. علاوة على ذلك ، عند تحضير مزيج الخلايا المصفوفة ، يجب استخدام الوسائط المبردة مسبقا إلى 4 درجات مئوية والأطراف المبردة المخزنة عند -20 درجة مئوية ، حيث تتصلب المصفوفة بسرعة. وأخيرا، وكما ذكر أعلاه، يساعد إنزيم DNase على منع تكتل الخلايا أثناء تحضير العينة. يوصى أيضا باقتباس الكواشف المستخدمة في البروتوكول وإعداد خلطات عوامل النمو لتجنب التجميد المتكرر لذوبان الكواشف.
يعد عزل الخلايا الليفية الأولية أمرا مهما ، لأنها نوع مهم من الخلايا في PDAC ويمكن استخدامها في تجارب الاستزراع المشترك اللاحقة لتحديد آثار TME على نمو الخلايا السرطانية. بعد حوالي 1 أسبوع ، هاجرت الخلايا الليفية من أقسام الأنسجة ويمكن رؤيتها عادة متصلة بألواح الثقافة وتنمو كثقافة أحادية الطبقة. ومع ذلك ، فإن وجود الخلايا الليفية في الثقافة له أيضا عيوب ، لأنها تستهلك العناصر الغذائية من وسط الثقافة ، وبالتالي ، تعرض النمو الأمثل لعضويات الورم للخطر. غالبا ما يوصى باستخدام ألواح التعلق المنخفضة للغاية (ULA) لزراعة عضويات الورم للحد من نمو الخلايا الليفية ، لأنها تلتصق بسهولة بالألواح القياسية المعالجة بزراعة الخلايا. يوصي هذا البروتوكول الذي تم التحقق من صحته باستخدام وسائط DMEM القياسية مع 10٪ FBS لثقافة الخلايا الليفية الأولية ، على الرغم من أنه يمكن أيضا استخدام وسائط متخصصة للخلايا الليفية.
من المهم توثيق حالة مزرعة الورم العضوية بمرور الوقت ، خاصة خلال الأسبوع الأول ، حيث تتصرف المزرعة بشكل مختلف اعتمادا على جودة الأنسجة وكميتها ومصدرها (الأورام البشرية الأولية القابلة للاستئصال مقابل PDXs). يمكن إضافة عوامل غير سامة إلى وسط الاستزراع لمراقبة صلاحية الخلية وانتشار الثقافة. يجب مراقبة الثقافات بصريا يوميا خلال أول 7 أيام ثم مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع. علاوة على ذلك ، يجب تغيير الوسط كل 4-5 أيام أو عندما يبدو حمضيا (يظهر باللون الأصفر) ، مع الحرص على عدم إتلاف قباب مصفوفة الغشاء القاعدي. في البداية ، قد تظهر كتل بنية كبيرة بسبب ارتفاع كثافة الخلايا. ومع ذلك ، يجب أن يختفي هذا بعد المقطع الأول ، مما يسمح بالحصول على عضويات الورم المحددة بوضوح على خلفية واضحة لمصفوفة الغشاء القاعدي. يوصى بالتقاط صور لعضويات الورم ، خاصة خلال الأسابيع ال 3 الأولى ، من أجل تحديد النمط الظاهري البصري ومعدل نمو عضويات الورم. يعد مرور ثقافة الورم العضوي أيضا تحديا تقنيا. وبشكل عام، تتم إزالة وسط الاستزراع، ويتم فصل قباب المصفوفة مع الكواشف القائمة على التربسين أو المتخصصة عند 4 درجات مئوية حتى تذوب مصفوفة الغشاء القاعدي تماما. ثم يتم إعادة تعليق حبيبات الخلية في مصفوفة جديدة ، ويتم ضبط الحجم لأداء المقطع المطلوب ، مثل 1: 1 (باستخدام نفس حجم المصفوفة مثل الأصل) أو 1: 3 (إضافة ثلاثة أضعاف الحجم الأصلي للنهج). توفر مجموعة David Tuveson ، التي تضم خبراء في عضويات البنكرياس ، موارد عبر الإنترنت مع بروتوكولات لإنشاء عضويات البنكرياس وصيانتها وتلطيخها37.
توفر عضويات الورم خارج الجسم الحي المشتقة من المريض نموذجا قيما قبل السريري لتقييم حساسية العلاج الخاصة بالمريض للتطبيق في الطب الشخصي. علاوة على ذلك ، فإن هذه النماذج هي نماذج أورام أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية مقارنة بالخلايا أحادية الطبقة الملتصقة التقليدية 2D. هناك حاجة إلى تسمية واضحة ومتسقة لنماذج الورم 3D مع متابعة فوتوغرافية ووصفية دورية للثقافة في مجال نموذج الورم. علاوة على ذلك ، فإن العمل مع بروتوكولات موحدة له أهمية قصوى لنجاح هذه التكنولوجيا في العيادة في تحديد حساسية الدواء على أساس كل مريض على حدة. يجب أن يكون الباحثون الذين يستخدمون هذه التكنولوجيا على دراية بالعقبات والمزالق لهذه النماذج الحساسة والمعقدة. ومع ذلك ، فإن العمل مع بروتوكول تم التحقق من صحته وشروط محددة بوضوح وخيارات استكشاف الأخطاء وإصلاحها سيساعد في تجنب المشكلات الفنية وتحسين إنشاء الثقافة وصيانتها. هنا ، يتم توفير بروتوكول تم التحقق من صحته لإنشاء عضويات الورم وعزل الخلايا الليفية التي يمكن تنفيذها بسهولة في العديد من مختبرات الأورام الانتقالية مع المعدات القياسية وخبرة زراعة الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة بتمويل من Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I + D + i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20 / 00045) ، برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 857381 ، مشروع VISION (استراتيجيات لتعزيز التميز العلمي والقدرة على الابتكار للتشخيص المبكر لسرطانات الجهاز الهضمي) ، دعوة داخلية لمشاريع بحثية جديدة للباحثين السريريين ومجموعات البحث الناشئة IRYCIS (2021/0446) ، مشروع Patient Derived Organoids 2.0 (CIBERONC) ومشروع TRANSCAN II JTC 2017 دعوة "إنشاء خوارزمية للتشخيص المبكر ومتابعة المرضى الذين يعانون من أورام الغدد الصم العصبية في البنكرياس (NExT)" ، رقم المنحة 1.1.1.5 / ERANET / 20/03. تم توفير العينات البيولوجية المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل مستشفى البنك الحيوي Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) وتم دمجها في منصة البنوك الحيوية والنماذج الحيوية التابعة ل ISCIII (PT20 / 00045). نود أيضا أن نشكر إيفون كول وأغابي كاتاكي فيتا روفيتا وثورستن نول على دعمهم القيم لتطوير هذا البروتوكول كجزء من مشاريع NExT و VISION.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
References
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids - A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al.
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H.
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab. , Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023).
