Summary
Gli organoidi tumorali hanno rivoluzionato la ricerca sul cancro e l'approccio alla medicina personalizzata. Rappresentano un modello tumorale clinicamente rilevante che consente ai ricercatori di stare un passo avanti rispetto al tumore in clinica. Questo protocollo stabilisce organoidi tumorali da campioni di tessuto tumorale pancreatico fresco e xenotrapianti derivati da pazienti di origine adenocarcinoma pancreatica.
Abstract
Gli organoidi tumorali sono modelli tumorali tridimensionali (3D) ex vivo che ricapitolano le caratteristiche biologiche chiave dei tessuti tumorali primari originali. Gli organoidi tumorali derivati da pazienti sono stati utilizzati nella ricerca traslazionale sul cancro e possono essere applicati per valutare la sensibilità e la resistenza al trattamento, le interazioni cellula-cellula e le interazioni delle cellule tumorali con il microambiente tumorale. Gli organoidi tumorali sono sistemi di coltura complessi che richiedono tecniche avanzate di coltura cellulare e terreni di coltura con cocktail di fattori di crescita specifici e una membrana basale biologica che imita l'ambiente extracellulare. La capacità di stabilire colture tumorali primarie dipende fortemente dal tessuto di origine, dalla cellularità e dalle caratteristiche cliniche del tumore, come il grado del tumore. Inoltre, la raccolta dei campioni di tessuto, la qualità e la quantità dei materiali, nonché la corretta biobanca e conservazione sono elementi cruciali di questa procedura. Anche le capacità tecniche del laboratorio sono fattori cruciali da considerare. In questo articolo, riportiamo una SOP/protocollo convalidato che è tecnicamente ed economicamente fattibile per la coltura di organoidi tumorali ex vivo da campioni di tessuto fresco di origine adenocarcinoma pancreatica, sia da tessuto di donatore paziente primario fresco resecato che da xenotrapianti derivati da pazienti (PDX). La tecnica qui descritta può essere eseguita in laboratori con colture tissutali di base e strutture murine ed è adattata per un'ampia applicazione nel campo dell'oncologia traslazionale.
Introduction
Gli organoidi tumorali sono colture organizzate tridimensionali (3D) ex vivo derivate da tessuto tumorale fresco e forniscono modelli di cancro. Gli organoidi tumorali ricapitolano le caratteristiche biologiche chiave del tumore primario originale 1,2,3,4 e possono essere espansi fino a diversi mesi e crioconservati, in modo simile alle linee cellulari immortalizzate convenzionali. Gli organoidi tumorali forniscono una biobanca di modelli tumorali derivati da pazienti per la medicina traslazionale/personalizzata5 e rappresentano un importante progresso nei sistemi/modelli di biologia delle cellule tumorali. Gli organoidi tumorali derivati da pazienti possono essere utilizzati come modelli ex vivo per prevedere l'efficacia delle terapie oncologiche/farmacologiche (neo)adiuvanti, per le quali vengono stabilite colture da tessuto tumorale fresco e vengono eseguiti saggi di sensibilità ai farmaci o farmacotipizzazione su base paziente-specifica per identificare agenti efficaci per le successive linee di terapia 1,4. Inoltre, gli organoidi tumorali superano i limiti della disponibilità di tessuto tumorale primario e, cosa più importante, forniscono un eccellente sistema alternativo o complementare ai modelli murini in vivo, come gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX)2. La complessità degli organoidi tumorali aumenta se le cellule tumorali primarie sono combinate con le cellule stromali che si trovano nel microambiente tumorale (TME), come i fibroblasti associati al cancro (CAF), le cellule endoteliali e le cellule immunitarie, che imitano il funzionamento e la complessa cellularità del tumore primario. Gli organoidi tumorali sono stati stabiliti per molti tipi di tumore utilizzando i protocolli standardizzati 6,7,8,9,10. La propagazione degli organoidi da diversi tumori solidi, tra cui il tessuto del cancro del colon-retto e della mammella, è ben consolidata e tecnicamente conveniente 11,12,13,14,15.
Le resezioni chirurgiche del tumore o le biopsie tumorali forniscono campioni di tessuto tumorale primario. Idealmente, i campioni di tessuto tumorale dovrebbero provenire dal centro della massa tumorale o dal bordo invasore del tumore, nonché dal tessuto dall'aspetto normale adiacente al tumore. Rispetto alle colture 2D convenzionali, gli organoidi tumorali richiedono diversi "componenti aggiuntivi", tra cui una membrana basale biologica (come Matrigel, idrogel o un'impalcatura a base di collagene), che imita la TME extracellulare, e un terreno di crescita liquido che fornisce nutrienti e fattori di crescita specifici e supporta la proliferazione e la vitalità cellulare in coltura16.
Le fasi più basilari della coltura cellulare primaria sono il lavaggio del tessuto in soluzione salina per prevenire la contaminazione, il taglio/digestione meccanica del tumore in piccoli pezzi di 1-3mm3 e il trattamento con collagenasi per la digestione enzimatica del tessuto. La miscela digerita viene quindi filtrata per rimuovere frammenti di tessuto di grandi dimensioni, risospesa in una membrana basale biologica come Matrigel e placcata come cupole in piastre di coltura a basso attaccamento per migliorare la crescita senza attaccamento. Le cupole della matrice della membrana basale sono ricoperte con terreno di coltura liquido e integrate con glutammina e antibiotici per evitare contaminazioni, nonché con fattori di crescita specifici a seconda del tipo di tessuto 7,8,9,16,17. Possono essere isolate anche altre cellule rilevanti presenti all'interno del tumore di massa e della TME, come i fibroblasti associati al cancro (CAF) e le cellule immunitarie. Questa tecnica, che è stata recentemente rivista18, consente la costituzione di co-colture con diversi tipi cellulari per studiare la risposta alla terapia in un ambiente tumorale più "realistico". Inoltre, possono essere studiate le interazioni cellula-cellula e l'interazione tra cellule tumorali e componenti della matrice biologica circostante.
Il tasso di successo riportato per l'insediamento di organoidi tumorali utilizzando tessuto fresco proveniente da biopsie o tessuto tumorale gastrointestinale resecato è di circa il 50%11 e il tasso di successo di quest'ultimo dipende in gran parte dal tipo di tessuto e dall'origine4, in particolare dal grado del tumore e dalla cellularità complessiva del tumore. I modelli tumorali tridimensionali hanno una complessità variabile, da semplici aggregati unicellulari a modelli ingegnerizzati altamente complessi costituiti da vari tipi di cellule. La terminologia utilizzata per descrivere le culture 3D in letteratura è altamente incoerente 19,20,21, poiché vengono utilizzati termini diversi come sferoidi, tumoresfere e organoidi, sebbene la differenza tra loro non sia chiara. Poiché non è stato ancora raggiunto un chiaro consenso sulla definizione, in questo articolo, un organoide tumorale è descritto come una coltura cellulare tumorale organizzata incorporata in una membrana basale biologica.
In questo documento, viene riportato un protocollo convalidato per la creazione di organoidi tumorali da campioni di tessuto fresco provenienti da adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) primario resecato o derivato da PDX, e questo protocollo può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori con strutture di coltura tissutale di base. Questo protocollo è stato adattato da diversi protocolli all'avanguardia che sono attualmente utilizzati per stabilire organoidi tumorali o tumoroidi da tessuto tumorale digestivo dei gruppi di David Tuveson9, Hans Clevers8 e Aurel Perren7.
Questo protocollo non discute il modo in cui il tessuto fresco viene raccolto. Per ottenere tessuto tumorale umano fresco di alta qualità, è importante avere un coordinamento efficiente tra i chirurghi che prelevano il tessuto e il reparto di patologia che estrae il campione di tessuto per la coltura di organoidi. Allo stesso modo, quando si utilizza PDX come fonte di tessuto fresco, è importante anche un coordinamento efficiente con la persona che raccoglie il campione di tessuto. È fondamentale ottenere il campione di tessuto il più rapidamente possibile (entro 30-60 minuti dal momento del prelievo) per mantenere un'elevata qualità.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per il benessere degli animali da esperimento approvate dal Comitato Etico dell'Universidad Autónoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) e La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) e in conformità con le linee guida per la condotta etica nella cura e nell'uso degli animali come indicato nei Principi guida internazionali per la ricerca biomedica che coinvolge gli animali. sviluppato dal Consiglio per le Organizzazioni Internazionali delle Scienze Mediche (CIOMS). Il protocollo ha seguito i principi etici per la ricerca biomedica con il consenso informato scritto. È stata ottenuta una preventiva approvazione etica per l'uso di tessuto fresco per l'istituzione delle colture di organoidi tumorali. I campioni sono stati forniti dalla Biobanca Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (Registro Nazionale delle Biobanche B.0000678), integrati nella Piattaforma Biobanche e Biomodelli dell'ISCIII (PT20/00045), e processati seguendo procedure operative standard con l'appropriata approvazione etica. I tumori sono stati impiantati per via sottocutanea, come descrittoin precedenza 22, in topi nudi femmine NU-Foxn1nu immunocompromessi di 6 settimane (vedi Tabella dei materiali) e passati in vivo per stabilire PDX PDAC.
1. Preparazione sperimentale
- Maneggiare campioni umani in una cabina di biosicurezza di classe II.
- Indossare un camice da laboratorio, guanti protettivi e occhiali durante tutta la procedura per evitare l'infezione da agenti patogeni trasmessi dai tessuti.
NOTA: Sono necessarie almeno 3 ore per processare il campione di tessuto fresco e placcare gli organoidi e i fibroblasti. - Processare i campioni di tessuto fresco 22 entro un massimo di24 ore dal prelievo e conservare a 4 °C in terreno di coltura tissutale (DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina) fino alla lavorazione.
- Tenere tutti i campioni e i reagenti sul ghiaccio durante l'intera procedura e assicurarsi di preimpostare una centrifuga refrigerata a 4 °C e di utilizzarla a bassa velocità per evitare di danneggiare la preparazione della cella.
- Conservare i puntali per pipette P1.000 e P200 in un congelatore a -20 °C da utilizzare durante il protocollo.
- Aliquotare la matrice della membrana basale (vedere la tabella dei materiali) prima dell'uso. Per questo protocollo, si raccomandano aliquote da 250 mL.
2. Elaborazione di tessuto tumorale primario fresco per stabilire organoidi tumorali e fibroblasti primari
NOTA: Sono necessarie almeno 3 ore per processare il campione di tessuto fresco (tumori umani primari resecabili o PDX) e per placcare gli organoidi tumorali e i fibroblasti. Nella Figura 1 è mostrato uno schema del processo di preparazione degli organoidi, dalla digestione dei tessuti alla placcatura degli organoidi tumorali. Prima di iniziare il protocollo, prelevare un'aliquota della matrice di membrana basale dal congelatore a -20 °C e lasciarla su ghiaccio per circa 30-60 minuti prima dell'uso.
- Mettere una piastra di coltura a 6 pozzetti in un incubatore per colture cellulari a 37 °C 3 ore prima di placcare gli organoidi.
- Misurare, fotografare e lavare il tessuto (passaggio 1.3) con 3 mL di Advanced DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F-12 Ham (F12), integrato con il 5% di siero fetale bovino (FBS), 15 mM di Hepes, 1% di L-Glutammina, 1% di Penicillina-Streptomicina, 125 ng/mL di Amfotericina B, 0,1 mg/mL di Normocina) (vedere la Tabella dei Materiali) pipettando su e giù e poi lavare con 3 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) pipettando su e giù.
- Rimuovere il terreno mediante aspirazione dalla piastra di coltura tissutale e tagliare il tessuto in3 pezzi di 1 mm in una piastra di coltura sterile utilizzando due lame sterili e 2 mL di terreno di digestione (DMEM-F12 avanzato + 10 mg di collagenasi EV/mL, 0,000625% tripsina-EDTA e 10 μg/mL DNasi). Raccogliere il tessuto in una provetta da 50 mL con 5 mL totali di terreno di digestione e incubare per 1 ora a 37 °C con digestione meccanica con apparecchiature disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali) o con miscelazione periodica del campione, pipettando il campione su e giù.
- Aggiungere 5 mL di Advanced DMEM-F12 per inattivare la tripsina e filtrare il campione attraverso un filtro per pori da 70 μm per rimuovere i detriti di grandi dimensioni.
- Aggiungere 2 mL di DMEM con il 10% di FBS nella parte superiore del filtro e raccogliere i detriti e i resti di tessuto per stabilire colture di fibroblasti (vedere il passaggio 5).
- Centrifugare il filtrato a 200-300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare il surnatante, lasciando solo il pellet cellulare. Aggiungere 5 mL di Advanced DMEM-F12 e centrifugare per 5 minuti a 300 x g.
- Risospendere il pellet in 4 mL di tampone di lisi ammonio-cloruro di potassio (ACK, vedere Tabella dei materiali). Passare la miscela in una provetta da 15 ml e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti per lisare i globuli rossi.
NOTA: Questa fase di lisi dei globuli rossi può essere rimossa quando non ci sono prove visibili di contaminazione. - Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare il surnatante. Aggiungere 5 mL di Advanced DMEM-F12 e centrifugare per 5 minuti a 300 x g.
- Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) integrato con DNasi (1 μg/mL) al pellet cellulare e incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min e aspirare il surnatante. Aggiungere 5 mL di Advanced DMEM-F12 e risospendere il pellet cellulare.
- Pipettare su e giù 30 volte con una pipetta P1.000 per dissociare le cellule, centrifugare per 5 minuti a 300 x g e rimuovere il surnatante.
- Prelevare i puntali per pipette P1.000 e P200 dal congelatore a −20 °C e risospendere il pellet cellulare nella matrice di membrana utilizzando una pipetta P1.000 e puntali freddi (50 μL per goccia, tenendo conto del volume del pellet, da sei a sette cupole per pozzetto). Estrarre la piastra precedentemente riscaldata dall'incubatrice. Impostare una pipetta P200 su 48 μL e utilizzare puntali freddi per creare cupole della matrice della membrana basale nella piastra a 6 pozzetti preriscaldata.
- Mettere la piastra con le cupole della matrice della membrana basale nell'incubatore a 37 °C 5% CO2 per 15 minuti per solidificare la matrice della membrana basale.
- Aggiungere 2-2,5 mL di Advanced DMEM-F12, integrato con 20 ng/mL di fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF), 100 ng/mL di fattore di crescita della placenta umana (PlGF), 10 ng/mL di fattore di crescita di base dei fibroblasti umani ricombinanti (bFGF), 769 ng/mL di fattore di crescita insulino-simile-1 (IGF-1) e 10,5 μM di inibitore ROCK (Advanced DMEM-F12 + fattori di crescita) (vedere la tabella dei materiali).
3. Monitoraggio degli organoidi
- Monitorare visivamente la coltura dell'organoide tumorale per i primi 7 giorni e successivamente tre volte alla settimana.
- Cambiare il terreno due volte alla settimana con Advanced DMEM-F12 contenente 20 ng/mL di fattore di crescita epidermico umano ricombinante (EGF), 100 ng/mL di fattore di crescita della placenta umana (PlGF), 10 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti di base umano ricombinante (bFGF), 769 ng/mL di fattore di crescita insulino-simile-1 (IGF-1) e 10,5 μM di inibitore ROCK (Advanced DMEM-F12 + fattori di crescita).
- Acquisire periodicamente immagini della coltura di organoidi tumorali il giorno 1, il giorno 3, il giorno 7, il giorno 10 e il giorno 15 dopo aver elaborato il campione e placcato la coltura nella matrice per osservare la crescita e la vitalità.
4. Passaggio e crioconservazione degli organoidi
- Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 6 pozzetti.
- Aggiungere 1 mL di un reagente appropriato per il recupero cellulare (vedere Tabella dei materiali) per dissociare la matrice di membrana basale e ottenere una sospensione cellulare, quindi recuperare il surnatante in una provetta da 15 mL. Se la matrice non si dissocia immediatamente, incubare il campione a 4 °C per 15-20 minuti fino a completa dissoluzione.
- Aggiungere 1 mL dello stesso reagente di recupero cellulare utilizzato nella fase 4.2 nel pozzetto della piastra per recuperare ulteriori cellule dissociate e aggiungere il surnatante nella stessa provetta da 15 mL della fase 4.2.
- Aggiungere 5 ml di Advanced DMEM-F12 freddo e centrifugare a 200 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante e asciugare accuratamente il pellet rimuovendo il liquido residuo con una pipetta da 5 mL; Evitare il più possibile di spostare il tubo. Risospendere il pellet cellulare nel doppio del volume originale della matrice di membrana basale per ottenere un passaggio di 1:2.
- Per la crioconservazione delle colture di organoidi, risospendere il pellet ottenuto nella fase 4,5 in 1 mL di terreno di congelamento (10% DMSO, 20% FBS, 50% DMEM-F12, 10,5 μM ROCK inibitore) e conservare a -80 °C.
NOTA: Il volume della matrice della membrana basale può essere regolato per eseguire diversi passaggi, ad esempio 1:1 (utilizzando lo stesso volume della matrice della membrana basale dell'originale) o 1:3 (aggiungendo tre volte il volume originale della matrice della membrana basale).
5. Insediamento dei fibroblasti
- Dopo aver recuperato i detriti e i resti di tessuto in 2 mL di DMEM con il 10% di FBS, aggiungerlo a una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C con il 5% di CO2 .
- Rimuovere i resti di tessuto dalle colture di fibroblasti dal passaggio 2.5 aspirando il terreno 2 giorni o 3 giorni dopo la placcatura e sostituirli con DMEM fresco con FBS al 10%.
- Monitorare visivamente la coltura dei fibroblasti tre volte alla settimana e cambiare il terreno di coltura almeno due volte alla settimana utilizzando DMEM integrato con FBS al 10%.
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Representative Results
È importante documentare come la coltura di organoidi tumorali progredisce nel tempo, in particolare nelle prime settimane, al fine di stimare come si comporterà la coltura nei saggi a valle. La Figura 2 mostra un esempio di isolamento ottimale delle cellule tumorali e di insediamento di organoidi tumorali da tessuto fresco per un periodo di 15 giorni. A volte, c'è un grande volume di detriti cellulari nel campione ed è difficile vedere gli organoidi tumorali in via di sviluppo, come mostrato nella Figura 3. Inoltre, il fenotipo degli organoidi in via di sviluppo può variare da organoidi isolati e arrotondati (Figura 4A) a colture sferoidi/aggregate (Figura 4B-D), e questo dipende dall'origine del tumore. I fibroblasti sono un sottoprodotto comune dell'instaurazione di colture cellulari tumorali primarie da tumori solidi, in particolare quelli con un alto contenuto di stroma, e spesso possono contaminare la coltura di organoidi. La Figura 5 mostra come queste cellule siano migrate dalle cupole della matrice di membrana basale e abbiano aderito alle piastre di coltura dopo circa 7 giorni. Queste cellule consumano i nutrienti dal terreno di coltura, compromettendo così la crescita ottimale degli organoidi.
I fibroblasti primari possono essere ottenuti come coltura isolata quando migrano fuori dalle sezioni di tessuto, aderiscono alle piastre di coltura e crescono come una coltura monostrato, come mostrato nella Figura 6. Questo protocollo raccomanda l'utilizzo di un terreno DMEM standard con il 10% di FBS per la coltura dei fibroblasti. Tuttavia, è possibile utilizzare anche un mezzo specializzato per i fibroblasti. I fibroblasti aderenti sono visibili circa 7 giorni dopo la placcatura (Figura 6).
Figura 1: Elaborazione di campioni di tessuto fresco per stabilire gli organoidi tumorali. Viene mostrato uno schema del processo di preparazione degli organoidi tumorali, dalla digestione dei tessuti alla placcatura degli organoidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Una coltura di organoidi tumorali stabilita da un PDX originato da un tumore PDAC fresco. Viene mostrata la progressione della coltura di organoidi tumorali nell'arco di diversi giorni, con immagini degli organoidi in un piano microscopico il giorno 1, il giorno 3, il giorno 7, il giorno 10 e il giorno 15. Barra graduata: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempi di una coltura di organoidi tumorali non ottimale il giorno 2 con detriti cellulari in eccesso. Barra graduata: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Organoidi tumorali stabiliti da diversi tessuti PDAC PDX che mostrano differenze di dimensioni e morfologia. Gli organoidi tumorali possono avere un fenotipo arrotondato classico (A) o (B-D) un aspetto più sferoide/aggregato. La dimensione media degli organoidi varia da 80 uM a 100 uM, anche se alcuni organoidi possono raggiungere i 200 uM. Barra graduata: 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Esempi di una coltura di organoidi tumorali (A-C) non ottimale contaminata da CAF/fibroblasti dopo 30 giorni di coltura. Barra graduata: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Esempi di colture di fibroblasti primari ottenuti dai resti del tessuto tumorale primario digerito . (A) Coltura confluente. (B) Cultura non confluente. Barra graduata: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Risoluzione dei problemi dell'istituzione di colture di organoidi tumorali. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
I principali progressi nelle terapie farmacologiche antitumorali sono impegnativi, poiché la probabilità di approvazione dei farmaci negli studi clinici oncologici di fase I è del 5,1%, che è la più bassa di tutti i tipi di malattia23. Il motivo principale è che il cancro è molto eterogeneo e, pertanto, le coorti di pazienti non rispondono uniformemente come previsto al trattamento dato, il che evidenzia la necessità di un approccio più personalizzato. Le colture bidimensionali (2D) sono state utilizzate nella ricerca traslazionale sul cancro per molti anni, ma mancano dell'organizzazione strutturale 3D che si trova nei tumori primari. Pertanto, non riflettono accuratamente le risposte terapeutiche del paziente e la comunicazione delle cellule tumorali tra loro o con il loro microambiente 3,23. Il principio fondamentale di tutti i sistemi di coltura 3D è quello di promuovere l'interazione cellulare con l'ambiente circostante e di organizzare le cellule in modo spazialmente rilevante, in modo simile al tumore primario (in situ). La morfologia degli organoidi tumorali varia da rotondi, di massa e simili a grappoli d'uva a stellati a seconda della natura intrinseca delle cellule coltivate e delle condizioni di coltura utilizzate, come mostrato nella Figura 4. Le colture di organoidi tumorali derivate dal paziente possono essere trattate con lo stesso trattamento di prima linea utilizzato nel paziente al fine di confermare che l'organoide tumorale ricapitola la situazione clinica (cioè la risposta alla terapia clinica)1,13,24,25.
Gli organoidi tumorali possono anche essere trattati con nuovi agenti farmacologici, il che fornisce un approccio esplorativo per identificare nuove terapie che potrebbero essere utilizzate nelle successive linee di trattamento in clinica quando le opzioni terapeutiche standard sono state esaurite. La coltura viene continuamente monitorata per valutare in tempo reale la risposta delle colture di organoidi tumorali all'agente. Uno studio di fattibilità della caratterizzazione molecolare e immunoistochimica del tumore xenotrapianto derivato da paziente (PDX) e degli organoidi derivati da PDX ha mostrato che la morfologia, l'espressione proteica e le alterazioni genomiche erano comparabili tra i due modelli. Inoltre, uno studio proof-of-concept di farmacotipizzazione ha dimostrato che anche le previsioni in vivo ed ex vivo erano comparabili e, quindi, ha concluso che l'utilizzo di organoidi tumorali come modello di cancro/malattia è un approccio fattibile e robusto che può essere applicato in ambito clinico2.
Una serie di sfide relative alla creazione di colture di organoidi tumorali provenienti da diversi tipi di tumore sono state evidenziate e recentemente esaminate26,27,28. Le questioni chiave includono la "contaminazione/crescita eccessiva" da parte di cellule sane, che formano organoidi con un tasso di crescita più elevato rispetto alle cellule tumorali, l'elevato costo di mantenimento della coltura rispetto alle colture 2D, il basso tasso di insediamento, le incongruenze nel profilo di mutazione somatica e istologia tra la coltura ex vivo e il tumore di origine, l'eterogeneità del tumore primario, l'uso di una matrice extracellulare a base murina, che potrebbe non essere ottimale per le cellule umane e potrebbe ostacolare la somministrazione del farmaco, l'assenza della TME e delle cellule associate, l'interferenza di fattori di crescita o inibitori molecolari con la risposta al farmaco e la mancanza di protocolli standardizzati e convalidati per la creazione e il mantenimento di organoidi tumorali. Tuttavia, nel corso degli anni, l'uso di modelli di tumore primario nella ricerca sul cancro è aumentato e le tecniche per coltivare e mantenere le colture primarie sono migliorate. Queste delicate colture ex vivo vengono stabilite e mantenute con l'aggiunta di integratori per promuovere la crescita e la stabilità cellulare. L'inibitore della Rho chinasi (ROCK) viene ora aggiunto di routine alle colture primarie per evitare l'apoptosi e migliorare l'adesione cellula-cellula, promuovendo così l'espansione a lungo termine delle colture primarie stabili in vitro 29. Inoltre, aumenta anche la sopravvivenza delle cellule staminali crioconservate scongelate, il che è importante quando si generano scorte congelate di colture di organoidi29. L'integrazione con eparina può anche essere utilizzata per migliorare l'espansione delle cellule staminali aumentando la segnalazione WNT e FGF e, quindi, la proliferazione cellulare30. Altri importanti reagenti utilizzati in questo protocollo convalidato per ottimizzare l'insediamento degli organoidi tumorali includono Accutasi e DNasi. L'accutasi è un reagente per la digestione delicata raccomandato per segregare le singole cellule staminali o staccarle dalle superfici di coltura e aiuta a mantenere la vitalità cellulare meglio rispetto all'utilizzo di altri reagenti progettati per questo scopo, come la tripsina31. Tuttavia, le collagenasi possono anche essere utilizzate per colpire in modo specifico il tipo di collagene incorporato nella membrana basale biologica. La DNasi è stata utilizzata nei metodi di isolamento cellulare per molti anni32 per eliminare i resti di DNA dalle cellule morte e necrotiche durante il protocollo di estrazione e, quindi, prevenire l'aggregazione/aggregazione delle cellule a causa della maggiore viscosità della preparazione del campione. I pellet cellulari sono spesso trattati con tampone di lisi, ma questa fase può essere esclusa quando non vi è evidenza visibile di contaminazione dei globuli rossi del campione di tessuto8 (File supplementare 1).
Il successo dell'istituzione di organoidi tumorali non è privo di complicazioni biologiche intrinseche. Idealmente, i tessuti per le colture di organoidi tumorali dovrebbero essere trattati lo stesso giorno del prelievo per ottimizzare la vitalità cellulare. Il congelamento dei tessuti non è sempre raccomandato in quanto può ridurre significativamente la vitalità cellulare. Tuttavia, gli organoidi tumorali possono essere stabiliti utilizzando campioni che sono stati congelati o crioconservati lentamente in un terreno di congelamento contenente DMSO33,34, che consente la spedizione del campione e la bioconservazione. In alcuni casi, è possibile ottenere colture 2D da colture di organoidi tumorali che sono state attraversate più volte dal recupero delle cellule tumorali attaccate alle piastre dopo aver rimosso le cupole della matrice di membrana basale. Nella nostra esperienza, il tasso di successo dell'insediamento di organoidi tumorali è molto più alto con il tessuto PDAC PDX rispetto al tessuto PDAC fresco derivato da un campione resecato4. Ciò è dovuto al fatto che di solito sono disponibili pezzi più grandi di tessuto PDAC PDX fresco e questo tessuto ha una cellularità più elevata, probabilmente a causa dell'ambiente in vivo più ospitale fornito dal modello PDX rispetto agli approcci basati su ex vivo. Agenti non tossici possono essere aggiunti al terreno di coltura per monitorare la vitalità cellulare e la proliferazione della coltura. Inoltre, la crescita eccessiva di organoidi non neoplastici deve essere evitata utilizzando condizioni selettive35,36. Il tessuto del pancreas può contenere enzimi digestivi che potrebbero influenzare la vitalità delle cellule tumorali isolate; Pertanto, la tripsina può essere aggiunta alla fase di digestione per superare questo problema4. Molti altri fattori, come lo stato del paziente/tessuto (cioè trattato o non trattato con terapia oncologica), il tipo di tumore, la contaminazione del campione dalla sala operatoria e il grado originale del tumore, possono anche influenzare in modo significativo la capacità di stabilire un organoide tumorale. Allo stesso modo, non tutti i tessuti hanno abbastanza cellule tumorali vitali per stabilire colture primarie. Ciò è particolarmente vero per i tumori PDAC, che sono notoriamente ricchi di stroma (circa il 90%-95%) e contengono una piccola percentuale di cellule tumorali epiteliali. Inoltre, i tessuti con un alto contenuto di stroma possono essere difficili da tagliare e dissociare per ottenere singole cellule tumorali per la coltura. Possono essere aggiunti mezzi di digestione specializzati e disponibili in commercio, oppure possono essere utilizzate anche apparecchiature di dissociazione meccanica se il tessuto non è completamente digerito. In alternativa, è possibile ottenere una completa dissociazione tissutale mediante un taglio continuo con due lame di bisturi fino a quando il tessuto non ha un aspetto semiliquido (vedi video dimostrativo).
Ci sono molte insidie tecniche durante la procedura che devono anche essere evidenziate. Ad esempio, i residui di tessuto possono bloccare il filtro e il filtro deve quindi essere sostituito, poiché i resti impediscono il passaggio del surnatante liquido. La fase di filtrazione può essere ripetuta più volte per recuperare la massima quantità di cellule tumorali dissociate. Inoltre, è importante controllare il pellet cellulare dopo ogni fase di centrifugazione poiché a volte è difficile vedere quando c'è un numero di celle basso. Il pipettaggio dei pellet cellulari deve essere eseguito delicatamente e lentamente, poiché un pipettaggio aggressivo può causare una perdita di cellule o una riduzione della vitalità cellulare. Inoltre, quando si prepara la miscela matrice-cella, è necessario utilizzare terreni preraffreddati a 4 °C e puntali refrigerati conservati a -20 °C, poiché la matrice si solidifica rapidamente. Infine, e come accennato in precedenza, la DNasi aiuta a prevenire l'aggregazione delle cellule durante la preparazione del campione. Si raccomanda inoltre di aliquotare i reagenti utilizzati nel protocollo e di preparare miscele di fattori di crescita per evitare il ripetuto congelamento dei reagenti.
L'isolamento dei fibroblasti primari è di interesse, in quanto sono un tipo di cellula importante nel PDAC e possono essere utilizzati per successivi esperimenti di co-coltura per determinare gli effetti della TME sulla crescita delle cellule tumorali. Dopo circa 1 settimana, i fibroblasti sono migrati fuori dalle sezioni di tessuto e di solito possono essere visti attaccati alle piastre di coltura e crescere come una coltura monostrato. Tuttavia, la presenza di fibroblasti nella coltura presenta anche degli svantaggi, in quanto consumano i nutrienti del terreno di coltura e, quindi, compromettono la crescita ottimale degli organoidi tumorali. Le piastre a bassissimo attacco (ULA) sono spesso raccomandate per la coltura di organoidi tumorali per limitare la crescita dei fibroblasti, poiché si attaccano facilmente alle piastre standard trattate con colture cellulari. Questo protocollo convalidato raccomanda l'uso di terreni DMEM standard con FBS al 10% per la coltura di fibroblasti primari, sebbene possano essere utilizzati anche terreni specializzati per fibroblasti.
È importante documentare lo stato della coltura di organoidi tumorali nel tempo, soprattutto durante la prima settimana, poiché la coltura si comporta in modo diverso a seconda della qualità, della quantità e della fonte del tessuto (tumori umani primari resecabili rispetto ai PDX). Agenti non tossici possono essere aggiunti al terreno di coltura per monitorare la vitalità cellulare e la proliferazione della coltura. Le colture devono essere monitorate visivamente ogni giorno durante i primi 7 giorni e poi due o tre volte alla settimana. Inoltre, il terreno deve essere cambiato ogni 4-5 giorni o quando appare acido (appare giallo), facendo attenzione a non danneggiare le cupole della matrice di membrana basale. All'inizio, possono apparire grandi ciuffi marroni a causa di un'elevata densità cellulare. Tuttavia, questo dovrebbe scomparire dopo il primo passaggio, consentendo così di ottenere organoidi tumorali chiaramente definiti su uno sfondo chiaro della matrice di membrana basale. Si consiglia di fotografare gli organoidi tumorali, soprattutto durante le prime 3 settimane, al fine di determinare il fenotipo visivo e il tasso di crescita degli organoidi tumorali. Il passaggio della coltura di organoidi tumorali è anche una sfida tecnica. Generalmente, il terreno di coltura viene rimosso e le cupole della matrice vengono dissociate con reagenti a base di tripsina o specializzati a 4 °C fino a quando la matrice di membrana basale non si dissolve completamente. Il pellet cellulare viene quindi risospeso in matrice fresca e il volume viene regolato per eseguire il passaggio desiderato, ad esempio 1:1 (utilizzando lo stesso volume della matrice dell'originale) o 1:3 (aggiungendo tre volte il volume originale dell'approccio). Il gruppo di David Tuveson, composto da esperti in organoidi pancreatici, fornisce risorse online con protocolli per stabilire, mantenere e colorare gli organoidi pancreatici37.
Gli organoidi tumorali ex vivo derivati dal paziente forniscono un prezioso modello preclinico per valutare la sensibilità al trattamento specifico del paziente per l'applicazione nella medicina personalizzata. Inoltre, questi modelli sono modelli tumorali fisiologicamente più rilevanti rispetto ai tradizionali monostrati di cellule aderenti 2D. Nel campo dei modelli tumorali è necessaria una nomenclatura chiara e coerente dei modelli tumorali 3D con un periodico follow-up fotografico e descrittivo della coltura. Inoltre, lavorare con protocolli standardizzati è della massima importanza per il successo di questa tecnologia in clinica nel determinare la sensibilità ai farmaci su base specifica per il paziente. I ricercatori che utilizzano questa tecnologia dovrebbero essere consapevoli degli ostacoli e delle insidie di questi modelli sensibili e complessi. Tuttavia, lavorare con un protocollo convalidato e condizioni chiaramente definite e opzioni di risoluzione dei problemi aiuterà a evitare problemi tecnici e ottimizzare la creazione e il mantenimento della cultura. In questo caso, viene fornito un protocollo convalidato per la creazione di organoidi tumorali e l'isolamento di fibroblasti che può essere prontamente implementato in molti laboratori di oncologia traslazionale con attrezzature standard ed esperienza di coltura tissutale.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato dalla Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito della convenzione di sovvenzione n. 857381, dal progetto VISION (Strategie per rafforzare l'eccellenza scientifica e la capacità di innovazione per la diagnosi precoce dei tumori gastrointestinali), Bando intramurale per nuovi progetti di ricerca per ricercatori clinici e gruppi di ricerca emergenti IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) e il progetto TRANSCAN II JTC 2017 call "Establishing an algorithm for the early diagnosis and follow-up of patients with pancreatic neuroendocrine tumours (NExT)", grant number 1.1.1.5/ERANET/20/03. I campioni biologici utilizzati in questo protocollo sono stati forniti dalla Biobanca Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) e integrati nella Piattaforma Biobanche e Biomodelli dell'ISCIII (PT20/00045). Vorremmo anche ringraziare Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita e Thorsten Knoll per il loro prezioso supporto allo sviluppo di questo protocollo nell'ambito dei progetti NExT e VISION.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
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