Summary
Tumororganoider har revolutioneret kræftforskning og tilgangen til personlig medicin. De repræsenterer en klinisk relevant tumormodel, der gør det muligt for forskere at være et skridt foran tumoren i klinikken. Denne protokol etablerer tumororganoider fra friske pancreas tumorvævsprøver og patientafledte xenotransplantater af pancreas adenocarcinom oprindelse.
Abstract
Tumororganoider er tredimensionelle (3D) ex vivo tumormodeller, der rekapitulerer de biologiske nøglefunktioner i de oprindelige primære tumorvæv. Patientafledte tumororganoider er blevet anvendt i translationel kræftforskning og kan anvendes til at vurdere behandlingsfølsomhed og resistens, celle-celle-interaktioner og tumorcelleinteraktioner med tumormikromiljøet. Tumororganoider er komplekse kultursystemer, der kræver avancerede cellekulturteknikker og kulturmedier med specifikke vækstfaktorcocktails og en biologisk kældermembran, der efterligner det ekstracellulære miljø. Evnen til at etablere primære tumorkulturer afhænger i høj grad af oprindelsesvævet, cellulariteten og tumorens kliniske egenskaber, såsom tumorkvaliteten. Desuden er indsamling af vævsprøver, materialekvalitet og -kvantitet samt korrekt biobanking og opbevaring afgørende elementer i denne procedure. Laboratoriets tekniske evner er også afgørende faktorer at overveje. Her rapporterer vi en valideret SOP/protokol, der er teknisk og økonomisk gennemførlig til dyrkning af ex vivo tumororganoider fra friske vævsprøver af pancreas adenocarcinom-oprindelse, enten fra frisk primært resekteret patientdonorvæv eller patientafledte xenotransplantater (PDX). Teknikken beskrevet heri kan udføres i laboratorier med grundlæggende vævskultur og musefaciliteter og er skræddersyet til bred anvendelse inden for translationel onkologi.
Introduction
Tumororganoider er ex vivo tredimensionelle (3D) organiserede kulturer, der stammer fra frisk tumorvæv og giver kræftmodeller. Tumororganoider rekapitulerer de biologiske nøgleegenskaber ved den oprindelige primære tumor 1,2,3,4 og kan udvides i op til flere måneder og kryopræserveres, svarende til konventionelle udødeliggjorte cellelinjer. Tumororganoider giver en biobank med patientafledte tumormodeller til translationel / personlig medicin5 og repræsenterer et vigtigt fremskridt inden for kræftcellebiologiske systemer / modeller. Patientafledte tumororganoider kan anvendes som ex vivo-modeller til at forudsige effekten af (neo)adjuverende onkologiske/farmakologiske behandlinger, for hvilke kulturer er etableret ud fra frisk tumorvæv, og lægemiddelfølsomhedsanalyser eller farmakotypning udføres på patientspecifik basis for at identificere effektive midler til efterfølgende behandlingslinjer 1,4. Desuden overvinder tumororganoider begrænsningen af tilgængeligheden af primært tumorvæv og, endnu vigtigere, giver et fremragende alternativ eller komplementært system til in vivo-musemodeller, såsom patientafledte xenotransplantater (PDX)2. Kompleksiteten af tumororganoider øges, hvis de primære tumorceller kombineres med stromale celler, der findes i tumormikromiljøet (TME), såsom kræftassocierede fibroblaster (CAF'er), endotelceller og immunceller, som efterligner funktionen og den komplekse cellularitet af den primære tumor. Tumororganoider er blevet etableret for mange tumortyper ved hjælp af standardiserede protokoller 6,7,8,9,10. Organoid formering fra forskellige faste tumorer, herunder kolorektal og brystkræftvæv, er veletableret og teknisk overkommelig 11,12,13,14,15.
Kirurgiske tumorresektioner eller tumorbiopsier giver primære tumorvævsprøver. Ideelt set bør tumorvævsprøver komme fra midten af tumormassen eller den invaderende kant af tumoren såvel som normalt udseende væv ved siden af tumoren. Sammenlignet med konventionelle 2D-kulturer kræver tumororganoider flere "add-ons", herunder en biologisk kældermembran (såsom Matrigel, hydrogel eller et kollagenbaseret stillads), som efterligner den ekstracellulære TME og et flydende vækstmedium, der leverer specifikke næringsstoffer og vækstfaktorer og understøtter celleproliferation og levedygtighed i kultur16.
De mest grundlæggende trin i primær cellekultur er vask af vævet i saltopløsning for at forhindre forurening, mekanisk skæring / fordøjelse af tumoren i små stykker på 1-3 mm3 og behandling med kollagenase til enzymatisk fordøjelse af vævet. Den fordøjede blanding filtreres derefter for at fjerne store vævsfragmenter, resuspenderes i en biologisk kældermembran såsom Matrigel og belægges som kupler i kulturplader med lav vedhæftning for at forbedre ikke-vedhæftningsvækst. Kældermembranmatrixkuplerne er dækket med flydende kulturmedium og suppleret med glutamin og antibiotika for at undgå forurening samt med specifikke vækstfaktorer afhængigt af vævstypen 7,8,9,16,17. Andre relevante celler, der er til stede i bulktumoren og TME, kan også isoleres, såsom kræftassocierede fibroblaster (CAF'er) og immunceller. Denne teknik, som for nylig er blevet gennemgået18, tillader etablering af co-kulturer med forskellige celletyper for at studere responsen på terapi i et mere "realistisk" tumormiljø. Desuden kan celle-celle-interaktioner og interaktionen mellem tumorceller og komponenter i den omgivende biologiske matrix undersøges.
Den rapporterede succesrate for tumororganoidetablering ved hjælp af frisk væv fra biopsier eller resekteret gastrointestinalt tumorvæv er omkring 50%11, og succesraten fra sidstnævnte afhænger i høj grad af vævstypen og oprindelsen4, især tumorkvaliteten og den samlede tumorcellularitet. Tredimensionelle tumormodeller har varierende kompleksitet, fra simple encellede aggregater til meget komplekse konstruerede modeller bestående af forskellige celletyper. Terminologien, der bruges til at beskrive 3D-kulturer i litteraturen, er meget inkonsekvent 19,20,21, da forskellige udtryk som sfæroider, tumorsfærer og organoider anvendes, selvom forskellen mellem dem er uklar. Da der endnu ikke er opnået en klar konsensus om definitionen, beskrives en tumororganoid i denne artikel som en organiseret tumorcellekultur indlejret i en biologisk kældermembran.
Heri rapporteres en valideret protokol til etablering af tumororganoider fra friske vævsprøver, der stammer fra frisk primær resekteret eller PDX-afledt pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), og denne protokol kan udføres i de fleste laboratorier med basale vævskulturfaciliteter. Denne protokol er blevet tilpasset fra flere state-of-the-art rapporterede protokoller, der i øjeblikket bruges til at etablere tumororganoider eller tumoroider fra fordøjelsestumorvæv fra grupperne David Tuveson9, Hans Clevers8 og Aurel Perren7.
Denne protokol diskuterer ikke, hvordan det friske væv høstes. For at opnå frisk humant tumorvæv af høj kvalitet er det vigtigt at have effektiv koordinering mellem kirurgerne, der høster vævet, og patologiafdelingen, der ekstraherer vævsprøven til organoidkultur. Ligeledes, når du bruger PDX som en frisk vævskilde, er effektiv koordinering med den person, der høster vævsprøven, også vigtig. Det er afgørende at få vævsprøven så hurtigt som muligt (inden for 30-60 min fra høsttidspunktet) for at opretholde en høj kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for forsøgsdyrs velfærd, der er godkendt af Universidad Autónoma de Madrid Ethics Committee (CEI 103-1958-A337) og La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) og i overensstemmelse med retningslinjerne for etisk adfærd i pasning og brug af dyr som anført i de internationale vejledende principper for biomedicinsk forskning, der involverer dyr, udviklet af Rådet for Internationale Organisationer for Medicinsk Videnskab (CIOMS). Protokollen fulgte de etiske principper for biomedicinsk forskning med skriftligt informeret samtykke. Der blev opnået forudgående etisk godkendelse til anvendelse af frisk væv til etablering af tumororganoidkulturer. Prøverne blev leveret af BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (National Registry of Biobanks B.0000678), integreret i Biobanks and Biomodels Platform of the ISCIII (PT20/00045) og behandlet efter standardprocedurer med den relevante etiske godkendelse. Tumorerne blev subkutant implanteret, som tidligere beskrevet22, i immunkompromitterede 6 uger gamle kvindelige NU-Foxn1nu nøgne mus (se materialetabel) og passeret in vivo for at etablere PDAC PDX'er.
1. Eksperimentel forberedelse
- Håndter humane prøver i et klasse II biosikkerhedsskab.
- Brug en laboratoriefrakke, beskyttelseshandsker og briller under hele proceduren for at undgå infektion med vævsbårne patogener.
BEMÆRK: Der kræves mindst 3 timer til at behandle den friske vævsprøve og plade organoiderne og fibroblasterne. - De friske vævsprøverbehandles 22 inden for højst 24 timer efter høsten, og opbevares ved 4 °C i vævskulturmedium (DMEM suppleret med 10 % FBS og 1 % penicillin-streptomycin) indtil forarbejdning.
- Opbevar alle prøver og reagenser på isen under hele proceduren, og sørg for at forudindstille en nedkølet centrifuge til 4 °C og bruge den ved lav hastighed for at undgå at beskadige cellepræparatet.
- Opbevar P1.000 og P200 pipettespidser i en -20 °C fryser til brug under protokollen.
- Alikvoten kældermembranmatrixen (se materialetabel) før brug. Til denne protokol anbefales 250 ml alikvoter.
2. Behandling af frisk primært tumorvæv for at etablere tumororganoider og primære fibroblaster
BEMÆRK: Der kræves mindst 3 timer for at behandle den friske vævsprøve (enten primære humane resektable tumorer eller PDX'er) og for at plade tumororganoiderne og fibroblasterne. En oversigt over organoidforberedelsesprocessen er vist i figur 1, fra vævsfordøjelse til plettering af tumororganoiderne. Før du starter protokollen, skal du tage en prøve af kældermembranmatrixen ud af -20 °C fryseren og lade den ligge på is i ca. 30-60 minutter før brug.
- Sæt en 6-brønds kulturplade i en 37 °C cellekulturkuvøse 3 timer før plettering af organoiderne.
- Afmål, fotografer og vask vævet (trin 1.3) med 3 ml avanceret DMEM-F12 (Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM)/næringsstofblanding F-12 skinke (F12), suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 15 mM Hepes, 1% L-glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 125 ng/ml amphotericin B, 0,1 mg/ml normocin) (se materialetabel) ved pipettering op og ned og derefter vask med 3 ml fosfatbufret saltvand (PBS) ved pipettering op og ned.
- Mediet fjernes ved aspiration fra vævskulturpladen og skærer vævet i 1 mm3 stykker i en steril vævskulturplade ved hjælp af to sterile blade og 2 ml fordøjelsesmedium (avanceret DMEM-F12 + 10 mg collagenase IV / ml, 0,000625% trypsin-EDTA og 10 μg / ml DNase). Vævet opsamles i et 50 ml rør med i alt 5 ml nedbrydningsmedier og inkuberes i 1 time ved 37 °C med mekanisk nedbrydning med kommercielt tilgængeligt udstyr (se materialetabellen) eller med periodisk blanding af prøven ved at pipettere prøven op og ned.
- Tilsæt 5 ml avanceret DMEM-F12 for at inaktivere trypsinet, og filtrer prøven gennem en 70 μm poresi for at fjerne store snavs.
- Tilsæt 2 ml DMEM med 10% FBS øverst på filteret, og saml snavs og vævsrester for at etablere kulturer af fibroblaster (se trin 5).
- Filtratet centrifugeres ved 200-300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten suges til sig, idet der kun er cellepillen tilbage. Tilsæt 5 ml Advanced DMEM-F12, og centrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
- Pellet resuspenderes i 4 ml ammoniumchloridkalium (ACK, se materialetabellen) lysisbuffer. Blandingen sendes til et 15 ml rør, og inkuberes ved stuetemperatur i 2 minutter for at lyse de røde blodlegemer.
BEMÆRK: Dette trin i lyse af røde blodlegemer kan fjernes, når der ikke er synlige tegn på kontaminering. - Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten suges op. Tilsæt 5 ml Advanced DMEM-F12, og centrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
- Tilsæt 1 ml kommercielt tilgængeligt celledissociationsreagens (se materialetabel) suppleret med DNase (1 μg/ml) til cellepelletsen, og inkuber i 2-3 minutter ved stuetemperatur.
- Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min., og supernatanten suges op. Tilsæt 5 ml Advanced DMEM-F12, og ophvirvl cellepelleten.
- Der pipetteres op og ned 30 gange med en P1.000-pipette for at adskille cellerne, centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g, og supernatanten fjernes.
- Tag P1.000 og P200 pipettespidser fra -20 °C fryseren, og resuspender cellepillen i membranmatrixen ved hjælp af en P1.000 pipette og kolde spidser (50 μL pr. dråbe, under hensyntagen til pelletvolumen, seks til syv kupler pr. brønd). Tag den tidligere opvarmede plade ud af inkubatoren. Indstil en P200-pipette til 48 μL, og brug kolde spidser til at skabe kupler i kældermembranmatrixen i den forvarmede 6-brøndsplade.
- Sæt pladen med kældermembranmatrixcellekuplerne i 37 °C 5% CO2 -inkubatoren i 15 minutter for at størkne kældermembranmatrixen.
- Tilføj 2-2,5 ml avanceret DMEM-F12, suppleret med 20 ng/ml rekombinant human epidermal vækstfaktor (EGF), 100 ng/ml human placenta vækstfaktor (PlGF), 10 ng/ml rekombinant human basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), 769 ng/ml insulinlignende vækstfaktor-1 (IGF-1) og 10,5 μM ROCK-hæmmer (avanceret DMEM-F12 + vækstfaktorer) (se materialetabel).
3. Overvågning af organoiderne
- Overvåg tumororganoidkulturen visuelt i de første 7 dage og derefter tre gange om ugen derefter.
- Skift mediet to gange om ugen med Advanced DMEM-F12 indeholdende 20 ng/ml rekombinant human epidermal vækstfaktor (EGF), 100 ng/ml human placenta vækstfaktor (PlGF), 10 ng/ml rekombinant human basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), 769 ng/ml insulinlignende vækstfaktor-1 (IGF-1) og 10,5 μM ROCK-hæmmer (Advanced DMEM-F12 + vækstfaktorer).
- Tag billeder af tumororganoidkulturen med jævne mellemrum på dag 1, dag 3, dag 7, dag 10 og dag 15 efter behandling af prøven og plettering af kulturen i matrixen for at observere vækst og levedygtighed.
4. Passage og kryoopbevaring af organoiderne
- Fjern kulturmediet fra 6-brøndpladen.
- Der tilsættes 1 ml af et passende cellegenvindingsreagens (se materialetabel) for at adskille kældermembranmatrixen og opnå en cellesuspension, og supernatanten genvindes i et 15 ml glas. Hvis matricen ikke dissocieres med det samme, inkuberes prøven ved 4 °C i 15-20 min., indtil den er helt opløst.
- Der tilsættes 1 ml af det samme cellegenvindingsreagens, der blev anvendt i trin 4.2, til pladens hul for at genvinde yderligere dissocierede celler, og supernatanten tilsættes til det samme 15 ml glas som i trin 4.2.
- Tilsæt 5 ml kold Advanced DMEM-F12, og centrifuger ved 200 x g i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og pelletpen tørres omhyggeligt ved at fjerne eventuel resterende væske med en 5 ml pipette; Undgå at flytte røret så meget som muligt. Resuspender cellepelleten i to gange det oprindelige volumen kældermembranmatrix for at opnå en passage på 1: 2.
- Til kryoopbevaring af organoidkulturerne resuspenderes pellet opnået i trin 4,5 i 1 ml frysemedium (10% DMSO, 20% FBS, 50% DMEM-F12, 10,5 μM ROCK-hæmmer) og opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: Volumenet af kældermembranmatrix kan justeres til at udføre forskellige passager, såsom 1: 1 (ved hjælp af det samme volumen kældermembranmatrix som originalen) eller 1: 3 (tilføjer tre gange det oprindelige volumen af kældermembranmatrix).
5. Etablering af fibroblaster
- Efter genvinding af affald og vævsrester i 2 ml DMEM med 10% FBS, tilsættes dette til en 6-brønds plade og inkuberes ved 37 °C med 5% CO2.
- Fjern vævsresterne fra fibroblastkulturerne fra trin 2.5 ved aspiration af mediet 2 dage eller 3 dage efter plettering, og erstat med frisk DMEM med 10% FBS.
- Overvåg fibroblastkulturen visuelt tre gange om ugen, og skift kulturmediet mindst to gange om ugen ved hjælp af DMEM suppleret med 10% FBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er vigtigt at dokumentere, hvordan tumororganoidkulturen udvikler sig over tid, især i de første par uger, for at estimere, hvordan kulturen vil opføre sig i downstream-assays. Figur 2 viser et eksempel på optimal tumorcelleisolering og tumororganoidetablering fra frisk væv over en periode på 15 dage. Nogle gange er der et stort volumen celleaffald i prøven, og det er svært at se de udviklende tumororganoider, som vist i figur 3. Desuden kan fænotypen af de udviklende organoider variere fra isolerede, afrundede organoider (figur 4A) til sfæroid/aggregatlignende kulturer (figur 4B-D), og dette afhænger af tumorens oprindelse. Fibroblaster er et almindeligt biprodukt af primær tumorcellekulturetablering fra faste tumorer, især dem med et højt stromaindhold, og kan ofte forurene organoidkulturen. Figur 5 viser, hvordan disse celler migrerede fra kældermembranmatrixkuplerne og klæbede til kulturpladerne efter ca. 7 dage. Disse celler forbruger næringsstoffer fra kulturmediet og kompromitterer dermed den optimale vækst af organoider.
Primære fibroblaster kan opnås som en isoleret kultur, når de migrerer ud af vævssektionerne, klæber til kulturpladerne og vokser som en enkeltlagskultur, som vist i figur 6. Denne protokol anbefaler at bruge standard DMEM-medium med 10% FBS til kulturen af fibroblasterne. Imidlertid kan et specialiseret medium til fibroblaster også anvendes. Vedhængende fibroblaster er synlige ca. 7 dage efter plettering (figur 6).
Figur 1: Behandling af friske vævsprøver for at etablere tumororganoider. En oversigt over tumororganoidforberedelsesprocessen er vist, fra vævsfordøjelse til plettering af organoiderne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: En tumororganoidkultur etableret fra en PDX, der stammer fra en frisk PDAC-tumor. Progressionen af tumororganoidkulturen over flere dage vises med billeder af organoiderne i et mikroskopisk plan på dag 1, dag 3, dag 7, dag 10 og dag 15. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Eksempler på en ikke-optimal tumororganoidkultur på dag 2 med overskydende celleaffald. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Etablerede tumororganoider fra forskellige PDAC PDX-væv, der viser forskelle i størrelse og morfologi. Tumororganoider kan have en (A) klassisk afrundet fænotype eller (B-D) et mere sfærisk / aggregat-type udseende. Den gennemsnitlige størrelse af organoiderne varierer fra 80 uM til 100 uM, selvom nogle organoider kan være så store som 200 uM. Vægtstang: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Eksempler på en ikke-optimal tumororganoidkultur (A-C) forurenet med CAF'er / fibroblaster efter 30 dage i kultur. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Eksempler på primære fibroblastkulturer etableret fra resterne af det fordøjede primære tumorvæv . (A) Konfluent kultur. (B) Ikke-sammenflydende kultur. Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: Fejlfinding af etablering af tumororganoidkultur. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Store fremskridt inden for farmakologiske kræftbehandlinger er udfordrende, da sandsynligheden for godkendelse af lægemidler i fase I onkologiske kliniske forsøg er 5,1%, hvilket er den laveste af alle sygdomstyper23. Hovedårsagen er, at kræft er meget heterogen, og derfor reagerer patientkohorter ikke ensartet som forventet på den givne behandling, hvilket understreger, at der er behov for en mere personlig tilgang. Todimensionelle (2D) kulturer er blevet brugt i translationel kræftforskning i mange år, men mangler den strukturelle 3D-organisation, der findes i primære tumorer. Således afspejler de ikke nøjagtigt patientbehandlingsresponser og tumorcellekommunikation med hinanden eller med deres mikromiljø 3,23. Det underliggende kerneprincip for alle 3D-kultursystemer er at fremme cellulær interaktion med omgivelserne og at organisere celler på en rumligt relevant måde, svarende til i den primære tumor (in situ). Morfologien af tumororganoider varierer fra rund, masse og druelignende til stellate afhængigt af den iboende natur af dyrkede celler og de anvendte dyrkningsbetingelser, som vist i figur 4. Etablerede patientafledte tumororganoidkulturer kan behandles med den samme førstelinjebehandling, der anvendes i patienten for at bekræfte, at tumororganoid rekapitulerer den kliniske situation (dvs. det kliniske terapirespons)1,13,24,25.
Tumororganoiderne kan også behandles med nye farmakologiske midler, hvilket giver en sonderende tilgang til identifikation af nye terapier, der kan anvendes i efterfølgende behandlingslinjer i klinikken, når standardbehandlingsmulighederne er udtømt. Kulturen overvåges løbende for at vurdere tumororganoidkulturernes respons på midlet i realtid. En gennemførlighedsundersøgelse af den molekylære og immunohistokemiske karakterisering af patientafledt xenografttumor (PDX) og PDX-afledte organoider viste, at morfologien, proteinekspressionen og genomiske ændringer var sammenlignelige mellem de to modeller. Desuden viste en proof-of-concept-undersøgelse af farmakotypning, at in vivo- og ex vivo-forudsigelserne også var sammenlignelige, og konkluderede således, at anvendelse af tumororganoider som kræft/sygdomsmodel er en gennemførlig og robust tilgang, der kan anvendes i den kliniske indstilling2.
En række udfordringer relateret til etablering af tumororganoidkulturer, der stammer fra forskellige tumortyper, er blevet fremhævet heri og for nylig gennemgået26,27,28. Nøglespørgsmål omfatter "forurening / overvækst" af sunde celler, som danner organoider med en højere væksthastighed end kræftceller, de høje omkostninger ved vedligeholdelse af kulturen sammenlignet med 2D-kulturer, den lave etableringshastighed, uoverensstemmelser i den somatiske mutationsprofil og histologi mellem ex vivo-kulturen og oprindelsestumoren, primær tumorheterogenitet, brugen af en murinbaseret ekstracellulær matrix, som muligvis ikke er optimal for humane celler og kan hæmme lægemiddelafgivelse, fraværet af TME og tilknyttede celler, interferens mellem vækstfaktorer eller molekylære hæmmere med lægemiddelresponsen og manglen på standardiserede og validerede protokoller til etablering og vedligeholdelse af tumororganoider. I årenes løb er brugen af primære tumormodeller i kræftforskning imidlertid steget, og teknikker til dyrkning og vedligeholdelse af primære kulturer er forbedret. Disse delikate ex vivo-kulturer etableres og vedligeholdes ved at tilføje kosttilskud for at fremme cellevækst og stabilitet. Rho-kinasehæmmeren (ROCK) tilsættes nu rutinemæssigt til primære kulturer for at undgå apoptose og forbedre celle-celleadhæsion, hvilket fremmer den langsigtede ekspansion af stabile primære in vitro-kulturer 29. Desuden øger det også overlevelsen af optøede kryopræserverede stamceller, hvilket er vigtigt ved dannelsen af frosne lagre af organoidkulturer29. Tilskud med heparin kan også bruges til at øge udvidelsen af stamceller ved at øge WNT- og FGF-signalering og dermed celleproliferation30. Andre vigtige reagenser, der anvendes i denne validerede protokol til optimering af tumororganoidetablering, inkluderer Accutase og DNase. Accutase er et skånsomt nedbrydningsreagens, der anbefales til at adskille individuelle stamceller eller løsne dem fra kulturoverfladerne, og det hjælper med at opretholde cellelevedygtighed bedre end at bruge andre reagenser designet til dette formål, såsom trypsin31. Imidlertid kan collagenaser også bruges til specifikt at målrette kollagentypen, der er inkorporeret i den biologiske kældermembran. DNase har været anvendt i celleisolationsmetoder i mange år32 for at eliminere DNA-rester fra døde og nekrotiske celler under ekstraktionsprotokollen og dermed forhindre klumpning/aggregering af celler på grund af den øgede viskositet af prøvepræparatet. Cellepiller behandles ofte med lysisbuffer, men dette trin kan udelukkes, når der ikke er synlige tegn på kontaminering af røde blodlegemer i vævsprøven8 (supplerende fil 1).
Den vellykkede etablering af tumororganoider kommer ikke uden iboende biologiske komplikationer. Ideelt set bør væv til tumororganoidkulturer behandles samme dag som høsten for at optimere cellelevedygtigheden. Frysning af væv anbefales ikke altid, da det kan reducere cellelevedygtigheden betydeligt. Imidlertid kan tumororganoider etableres ved hjælp af prøver, der er blevet flashfrosset eller langsomt kryopræserveret i DMSO-holdigt frysemedium33,34, hvilket tillader prøveforsendelse og biobanking. I nogle tilfælde er det muligt at opnå 2D-kulturer fra tumororganoidkulturer, der er blevet passeret flere gange ved genopretning af tumorcellerne, der er fastgjort til pladerne efter fjernelse af kældermembranmatrixkuplerne. Efter vores erfaring er succesraten for tumororganoidetablering meget højere med PDX PDAC-væv end med frisk PDAC-væv afledt af en resekteret prøve4. Dette skyldes det faktum, at større stykker frisk PDX PDAC-væv normalt er tilgængeligt, og dette væv har højere cellularitet, sandsynligvis på grund af det mere gæstfrie in vivo-miljø, der leveres af PDX-modellen sammenlignet med ex vivo-baserede tilgange. Ikke-toksiske stoffer kan tilsættes til kulturmediet for at overvåge cellelevedygtigheden og spredningen af kulturen. Desuden skal overvækst af ikke-neoplastiske organoider undgås ved hjælp af selektive betingelser35,36. Bugspytkirtelvæv kan indeholde fordøjelsesenzymer, der kan påvirke levedygtigheden af de isolerede tumorceller; Således kan trypsin tilsættes til fordøjelsestrinnet for at overvinde dette problem4. Mange andre faktorer, såsom patientens / vævets status (dvs. behandlet eller ubehandlet med onkologisk terapi), typen af tumor, forureningen af prøven fra operationsstuen og tumorens oprindelige kvalitet, kan også påvirke evnen til at etablere en tumororganoid betydeligt. Ligeledes har ikke alle væv nok levedygtige tumorceller til at etablere primære kulturer. Dette gælder især for PDAC-tumorer, som er notorisk stroma-rige (ca. 90% -95%) og indeholder en lille procentdel af epiteltumorceller. Derudover kan væv med et højt stromaindhold være vanskeligt at skære og dissociere for at opnå enkelttumorceller til dyrkning. Specialiserede og kommercielt tilgængelige fordøjelsesmedier kan tilføjes, eller mekanisk dissociationsudstyr kan også anvendes, hvis vævet ikke fordøjes fuldt ud. Alternativt kan en grundig vævsdissociation opnås ved kontinuerlig skæring ved hjælp af to skalpelblade, indtil vævet har et halvflydende udseende (se videodemonstration).
Der er mange tekniske faldgruber under proceduren, som også skal fremhæves. For eksempel kan vævsrester blokere filteret, og filteret skal derefter skiftes, da resterne hindrer passagen af den flydende supernatant. Filtreringstrinnet kan gentages flere gange for at genvinde den maksimale mængde dissocierede tumorceller. Desuden er det vigtigt at kontrollere cellepillen efter hvert centrifugeringstrin, da det nogle gange er svært at se, hvornår der er et lavt celletal. Pietteringen af cellepillerne skal udføres forsigtigt og langsomt, da aggressiv pipettering kan resultere i tab af celler eller nedsat cellelevedygtighed. Ved fremstilling af matrix-celleblandingen bør der desuden anvendes medier, der er forkølet til 4 °C, og nedkølede spidser, der opbevares ved -20 °C, da matrixen hurtigt størkner. Endelig, og som nævnt ovenfor, hjælper DNase med at forhindre klumpning af celler under prøveforberedelse. Aliquoting af de reagenser, der anvendes i protokollen, og fremstilling af vækstfaktorblandinger anbefales også for at undgå gentagen frysning og optøning af reagenserne.
Isoleringen af primære fibroblaster er af interesse, da de er en vigtig celletype i PDAC og kan bruges til efterfølgende co-kultureksperimenter for at bestemme virkningerne af TME på tumorcellevækst. Efter ca. 1 uge er fibroblasterne migreret ud af vævssektionerne og kan normalt ses fastgjort til kulturpladerne og vokse som en enkeltlagskultur. Tilstedeværelsen af fibroblaster i kulturen har imidlertid også ulemper, da de forbruger næringsstoffer fra kulturmediet og dermed kompromitterer den optimale vækst af tumororganoiderne. Ultra-lav vedhæftning (ULA) plader anbefales ofte til dyrkning af tumororganoider for at begrænse fibroblastvækst, da de let fastgøres til standard cellekulturbehandlede plader. Denne validerede protokol anbefaler brug af standard DMEM-medier med 10% FBS til dyrkning af primære fibroblaster, selvom specialiserede medier til fibroblaster også kan anvendes.
Det er vigtigt at dokumentere tilstanden af tumororganoidkulturen over tid, især i den første uge, da kulturen opfører sig forskelligt afhængigt af vævets kvalitet, mængde og kilde (primære humane resektable tumorer versus PDX'er). Ikke-toksiske stoffer kan tilsættes til kulturmediet for at overvåge cellelevedygtigheden og spredningen af kulturen. Kulturerne skal overvåges visuelt dagligt i de første 7 dage og derefter to til tre gange om ugen. Desuden skal mediet skiftes hver 4-5 dag, eller når det ser surt ud (fremstår gult), idet man skal passe på ikke at beskadige kældermembranmatrixkuplerne. I første omgang kan store brune klumper forekomme på grund af en høj celletæthed. Dette bør imidlertid forsvinde efter den første passage, hvilket gør det muligt at opnå klart definerede tumororganoider på en klar baggrund af kældermembranmatrixen. Det anbefales at tage billeder af tumororganoiderne, især i de første 3 uger, for at bestemme tumororganoidernes visuelle fænotype og væksthastighed. Passagen af tumororganoidkulturen er også en teknisk udfordring. Generelt fjernes kulturmediet, og matrixkuplerne adskilles med trypsinbaserede eller specialiserede reagenser ved 4 ° C, indtil kældermembranmatrixen opløses fuldstændigt. Cellepelleten resuspenderes derefter i frisk matrix, og volumenet justeres til at udføre den ønskede passage, såsom 1: 1 (ved hjælp af samme matrixvolumen som originalen) eller 1: 3 (tilføjer tre gange det oprindelige volumen af tilgangen). Gruppen af David Tuveson, der består af eksperter i bugspytkirtelorganoider, leverer online ressourcer med protokoller til etablering, vedligeholdelse og farvning af bugspytkirtelorganoider37.
Patientafledte ex vivo tumororganoider giver en værdifuld præklinisk model til vurdering af patientspecifik behandlingsfølsomhed til anvendelse i personlig medicin. Desuden er disse modeller mere fysiologisk relevante tumormodeller sammenlignet med traditionelle 2D-klæbende cellemonolag. En klar og konsistent nomenklatur for 3D-tumormodeller med periodisk fotografisk og beskrivende opfølgning af kulturen er nødvendig inden for tumormodelfeltet. Desuden er arbejde med standardiserede protokoller af største betydning for succesen med denne teknologi i klinikken til bestemmelse af lægemiddelfølsomhed på patientspecifik basis. Forskere, der bruger denne teknologi, bør være opmærksomme på forhindringerne og faldgruberne ved disse følsomme og komplekse modeller. Men at arbejde med en valideret protokol og klart definerede betingelser og fejlfindingsmuligheder vil hjælpe med at undgå tekniske problemer og optimere etableringen og vedligeholdelsen af kulturen. Her tilvejebringes en valideret protokol til etablering af tumororganoider og isolering af fibroblaster, der let kan implementeres i mange translationelle onkologiske laboratorier med standardudstyr og vævskulturerfaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af finansiering fra Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), Den Europæiske Unions Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 857381, projekt VISION (Strategies to strengthen scientific excellence and innovation capacity for early diagnosis of gastrointestinal cancers), Intramural call til nye forskningsprojekter for kliniske forskere og nye forskningsgrupper IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) og TRANSCAN II projektet JTC 2017 call "Etablering af en algoritme til tidlig diagnose og opfølgning af patienter med pancreas neuroendokrine tumorer (NExT)", bevillingsnummer 1.1.1.5/ERANET/20/03. De biologiske prøver, der anvendes i denne protokol, blev leveret af BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) og integreret i ISCIII's Biobanks and Biomodels Platform (PT20/00045). Vi vil også gerne takke Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita og Thorsten Knoll for deres uvurderlige støtte til at udvikle denne protokol som en del af NExT- og VISION-projekterne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
References
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids - A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al.
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H.
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab. , Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023).
