Summary
Tumororganoïden hebben een revolutie teweeggebracht in kankeronderzoek en de benadering van gepersonaliseerde geneeskunde. Ze vertegenwoordigen een klinisch relevant tumormodel waarmee onderzoekers de tumor in de kliniek een stap voor kunnen blijven. Dit protocol stelt tumororganoïden vast uit verse weefselmonsters van pancreastumoren en van patiënten afgeleide xenotransplantaten van pancreasadenocarcinoomoorsprong.
Abstract
Tumororganoïden zijn driedimensionale (3D) ex vivo tumormodellen die de biologische belangrijkste kenmerken van de oorspronkelijke primaire tumorweefsels samenvatten. Patiënt-afgeleide tumororganoïden zijn gebruikt in translationeel kankeronderzoek en kunnen worden toegepast om de gevoeligheid en resistentie van de behandeling, cel-celinteracties en tumorcelinteracties met de tumormicro-omgeving te beoordelen. Tumororganoïden zijn complexe kweeksystemen die geavanceerde celkweektechnieken en kweekmedia vereisen met specifieke groeifactorcocktails en een biologisch basaalmembraan dat de extracellulaire omgeving nabootst. Het vermogen om primaire tumorculturen tot stand te brengen hangt sterk af van het weefsel van oorsprong, de cellulariteit en de klinische kenmerken van de tumor, zoals de tumorgraad. Bovendien zijn het verzamelen van weefselmonsters, de kwaliteit en kwantiteit van het materiaal, evenals de juiste biobank en -opslag cruciale elementen van deze procedure. De technische mogelijkheden van het laboratorium zijn ook cruciale factoren om rekening mee te houden. Hier rapporteren we een gevalideerd SOP/protocol dat technisch en economisch haalbaar is voor de kweek van ex vivo tumororganoïden uit verse weefselmonsters van pancreasadenocarcinoomoorsprong, hetzij van vers primair gereseceerd donorweefsel van de patiënt of van de patiënt afgeleide xenotransplantaten (PDX). De hierin beschreven techniek kan worden uitgevoerd in laboratoria met basisweefselkweek- en muisfaciliteiten en is op maat gemaakt voor brede toepassing op het gebied van translationele oncologie.
Introduction
Tumororganoïden zijn ex vivo driedimensionale (3D) georganiseerde culturen die zijn afgeleid van vers tumorweefsel en kankermodellen opleveren. Tumororganoïden recapituleren de biologische belangrijkste kenmerken van de oorspronkelijke primaire tumor 1,2,3,4 en kunnen tot enkele maanden worden uitgebreid en gecryopreserveerd, vergelijkbaar met conventionele onsterfelijke cellijnen. Tumororganoïden bieden een biobank van patiënt-afgeleide tumormodellen voor translationele/gepersonaliseerde geneeskunde5 en vertegenwoordigen een belangrijke vooruitgang in kankercelbiologische systemen/modellen. Patiënt-afgeleide tumororganoïden kunnen worden gebruikt als ex vivo modellen om de werkzaamheid te voorspellen van (neo)adjuvante oncologische/farmacologische therapieën, waarvoor culturen worden gemaakt van vers tumorweefsel en geneesmiddelgevoeligheidstesten of farmacotypering worden uitgevoerd op patiëntspecifieke basis om effectieve middelen te identificeren voor volgende therapielijnen 1,4. Bovendien overwinnen tumororganoïden de beperking van de beschikbaarheid van primair tumorweefsel en, nog belangrijker, bieden ze een uitstekend alternatief of complementair systeem voor in vivo muismodellen, zoals van patiënten afgeleide xenotransplantaten (PDX)2. De complexiteit van tumororganoïden neemt toe als de primaire tumorcellen worden gecombineerd met stromale cellen die worden aangetroffen in de tumormicro-omgeving (TME), zoals kankergeassocieerde fibroblasten (CAF's), endotheelcellen en immuuncellen, die de werking en complexe cellulariteit van de primaire tumor nabootsen. Tumororganoïden zijn vastgesteld voor veel tumortypes met behulp van gestandaardiseerde protocollen 6,7,8,9,10. Organoïde-voortplanting van verschillende solide tumoren, waaronder colorectaal en borstkankerweefsel, is goed ingeburgerd en technisch betaalbaar 11,12,13,14,15.
Chirurgische tumorresecties of tumorbiopten leveren primaire tumorweefselmonsters op. Idealiter zouden tumorweefselmonsters uit het midden van de tumormassa of de binnenvallende rand van de tumor moeten komen, evenals normaal ogend weefsel naast de tumor. In vergelijking met conventionele 2D-culturen hebben tumororganoïden verschillende "add-ons" nodig, waaronder een biologisch basaalmembraan (zoals Matrigel, hydrogel of een op collageen gebaseerde steiger), die de extracellulaire TME nabootst, en een vloeibaar groeimedium dat specifieke voedingsstoffen en groeifactoren levert en de celproliferatie en levensvatbaarheid in cultuur ondersteunt.
De meest elementaire stappen in de primaire celkweek zijn het wassen van het weefsel in een zoutoplossing om besmetting te voorkomen, het mechanisch snijden/verteren van de tumor in kleine stukjes van 1-3mm3 en de behandeling met collagenase voor de enzymatische vertering van het weefsel. Het verteerde mengsel wordt vervolgens gefilterd om grote weefselfragmenten te verwijderen, geresuspendeerd in een biologisch basaalmembraan zoals Matrigel, en geplateerd als koepels in kweekplaten met lage hechting om de groei van niet-gehechtheid te bevorderen. De koepels van de basale membraanmatrix zijn bedekt met vloeibaar kweekmedium en aangevuld met glutamine en antibiotica om besmetting te voorkomen, evenals met specifieke groeifactoren, afhankelijk van het weefseltype 7,8,9,16,17. Andere relevante cellen die aanwezig zijn in de bulktumor en de TME kunnen ook worden geïsoleerd, zoals kankergeassocieerde fibroblasten (CAF's) en immuuncellen. Deze techniek, die onlangs is herzien18, maakt het mogelijk om co-culturen met verschillende celtypen tot stand te brengen om de respons op therapie te bestuderen in een meer "realistische" tumoromgeving. Verder kunnen cel-cel interacties en de interactie tussen tumorcellen en componenten van de omringende biologische matrix bestudeerd worden.
Het gerapporteerde slagingspercentage van het vaststellen van tumororganoïden met behulp van vers weefsel uit biopsieën of gereseceerd gastro-intestinaal tumorweefsel is ongeveer 50%11, en het slagingspercentage van het laatste is grotendeels afhankelijk van het weefseltype ende oorsprong 4, met name de tumorgraad en de algehele cellulariteit van de tumor. Driedimensionale tumormodellen hebben verschillende complexiteit, van eenvoudige eencellige aggregaten tot zeer complexe gemanipuleerde modellen bestaande uit verschillende celtypen. De terminologie die in de literatuur wordt gebruikt om 3D-culturen te beschrijven is zeer inconsistent 19,20,21, aangezien verschillende termen zoals sferoïden, tumorsferen en organoïden worden gebruikt, hoewel het verschil tussen beide onduidelijk is. Omdat er nog geen duidelijke consensus over de definitie is bereikt, wordt in dit artikel een tumororganoïde beschreven als een georganiseerde tumorcelcultuur ingebed in een biologisch basaalmembraan.
Hierin wordt een gevalideerd protocol gerapporteerd voor het vaststellen van tumororganoïden uit verse weefselmonsters die afkomstig zijn van vers primair gereseceerd of PDX-afgeleid ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC), en dit protocol kan worden uitgevoerd in de meeste laboratoria met basisweefselkweekfaciliteiten. Dit protocol is aangepast van verschillende state-of-the-art gerapporteerde protocollen die momenteel worden gebruikt om tumororganoïden of tumoroïden vast te stellen uit spijsverteringstumorweefsel uit de groepen van David Tuveson9, Hans Clevers8 en Aurel Perren7.
Dit protocol bespreekt niet hoe het verse weefsel wordt geoogst. Om vers menselijk tumorweefsel van hoge kwaliteit te verkrijgen, is het belangrijk om een efficiënte coördinatie te hebben tussen de chirurgen die het weefsel oogsten en de pathologieafdeling die het weefselmonster extraheert voor organoïdekweek. Evenzo is bij het gebruik van PDX als bron van vers weefsel ook een efficiënte coördinatie met de persoon die het weefselmonster oogst belangrijk. Het is van cruciaal belang om het weefselmonster zo snel mogelijk te verkrijgen (binnen 30-60 minuten na het oogsten) om een hoge kwaliteit te behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor het welzijn van proefdieren die zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Universidad Autónoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) en La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) en in overeenstemming met de richtlijnen voor ethisch gedrag bij de verzorging en het gebruik van dieren zoals vermeld in The International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals, ontwikkeld door de Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS). Het protocol volgde de ethische principes voor biomedisch onderzoek met schriftelijke geïnformeerde toestemming. Voorafgaande ethische goedkeuring werd verkregen voor het gebruik van vers weefsel voor het opzetten van de tumororganoïdeculturen. De monsters werden verstrekt door de BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (Nationaal Register van Biobanken B.0000678), geïntegreerd in het Biobanks and Biomodels Platform van de ISCIII (PT20/00045), en verwerkt volgens standaard operationele procedures met de juiste ethische goedkeuring. De tumoren werden subcutaan geïmplanteerd, zoals eerder beschreven22, in immuungecompromitteerde vrouwelijke NU-Foxn1nu naaktmuizen van 6 weken oud (zie Materiaaltabel) en in vivo gepasseerd om PDAC PDX's vast te stellen.
1. Experimentele voorbereiding
- Behandel menselijke monsters in een bioveiligheidskast van klasse II.
- Draag tijdens de procedure een laboratoriumjas, beschermende handschoenen en een bril om infectie door door weefsel overgedragen ziekteverwekkers te voorkomen.
OPMERKING: Er is minimaal 3 uur nodig om het verse weefselmonster te verwerken en de organoïden en fibroblasten te registreren. - Verwerk de verse weefselmonsters22 binnen maximaal 24 uur na de oogst en bewaar ze bij 4 °C in weefselkweekmedium (DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine) tot verwerking.
- Bewaar alle monsters en reagentia tijdens de hele procedure op het ijs en zorg ervoor dat u een gekoelde centrifuge vooraf instelt op 4 °C en deze op een lage snelheid gebruikt om beschadiging van het celpreparaat te voorkomen.
- Bewaar de pipetpunten P1.000 en P200 in een vriezer van -20 °C om te gebruiken tijdens het protocol.
- Aliquot de basaalmembraanmatrix (zie Materiaaltabel) voor gebruik. Voor dit protocol worden aliquots van 250 ml aanbevolen.
2. Verwerking van vers primair tumorweefsel om tumororganoïden en primaire fibroblasten te vestigen
OPMERKING: Er is minimaal 3 uur nodig om het verse weefselmonster (primaire menselijke resectabele tumoren of PDX'en) te verwerken en om de tumororganoïden en fibroblasten te plaaten. Een overzicht van het bereidingsproces van de organoïden wordt weergegeven in figuur 1, van weefselvertering tot het plateren van de tumororganoïden. Voordat u met het protocol begint, haalt u een aliquot van de basaalmembraanmatrix uit de vriezer van -20 °C en laat u deze voor gebruik ongeveer 30-60 minuten op ijs liggen.
- Plaats een kweekplaat met 6 putjes in een celkweekincubator van 37 °C 3 uur voordat u de organoïden plateert.
- Meet, fotografeer en was het weefsel (stap 1.3) met 3 ml Advanced DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F-12 Ham (F12), aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 15 mM Hepes, 1% L-Glutamine, 1% Penicilline-Streptomycine, 125 ng/ml Amfotericine B, 0,1 mg/ml Normocin) (zie Materiaaltabel) door op en neer te pipetteren en vervolgens wassen met 3 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door op en neer te pipetteren.
- Verwijder het medium door aspiratie van de weefselkweekplaat en snijd het weefsel in 1 mm3 stukken in een steriele weefselkweekplaat met behulp van twee steriele mesjes en 2 ml Digest Medium (Advanced DMEM-F12 + 10 mg Collagenase IV/ml, 0,000625% trypsine-EDTA en 10 μg/ml DNase). Verzamel het weefsel in een buisje van 50 ml met in totaal 5 ml digestiemedia en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C met mechanische destructie met in de handel verkrijgbare apparatuur (zie Materiaaltabel) of met periodieke menging van het monster, door het monster op en neer te pipetteren.
- Voeg 5 ml Advanced DMEM-F12 toe om de trypsine te inactiveren en filtreer het monster door een poriënzeef van 70 μm om groot vuil te verwijderen.
- Voeg 2 ml DMEM met 10% FBS toe aan de bovenkant van het filter en verzamel het vuil en de weefselresten om fibroblastculturen te maken (zie stap 5).
- Centrifugeer het filtraat bij 200-300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig het supernatant op, zodat alleen de celpellet overblijft. Voeg 5 ml Advanced DMEM-F12 toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g.
- Resuspendeer de pellet in 4 ml ammoniumchloride-kalium (ACK, zie Materiaaltabel) lysisbuffer. Giet het mengsel in een buisje van 15 ml en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur om de rode bloedcellen te lyseren.
OPMERKING: Deze lysestap van rode bloedcellen kan worden verwijderd als er geen zichtbaar bewijs van besmetting is. - Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig het supernatant op. Voeg 5 ml Advanced DMEM-F12 toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g.
- Voeg 1 ml in de handel verkrijgbaar celdissociatiereagens (zie materiaaltabel) aangevuld met DNase (1 μg/ml) toe aan de celpellet en incubeer gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g en zuig het supernatant op. Voeg 5 ml Advanced DMEM-F12 toe en resuspendeer de celpellet.
- Pipetteer 30 keer op en neer met een P1.000-pipet om de cellen te dissociëren, centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g en verwijder het supernatant.
- Neem de pipetpunten P1.000 en P200 uit de vriezer van −20 °C en resuspendeer de celpellet in de membraanmatrix met behulp van een P1.000-pipet en koude tips (50 μL per druppel, rekening houdend met het pelletvolume, zes tot zeven koepels per putje). Haal de eerder verwarmde plaat uit de couveuse. Stel een P200-pipet in op 48 μl en gebruik koude tips om koepels van de basaalmembraanmatrix in de voorverwarmde plaat met 6 putjes te maken.
- Plaats de plaat met de basaalmembraanmatrix-celkoepels gedurende 15 minuten in de incubator van 37 °C 5% CO2 om de keldermembraanmatrix te laten stollen.
- Voeg 2-2,5 ml Advanced DMEM-F12 toe, aangevuld met 20 ng/ml recombinante humane epidermale groeifactor (EGF), 100 ng/ml humane placentagroeifactor (PlGF), 10 ng/ml recombinante humane basisfibroblastgroeifactor (bFGF), 769 ng/ml insulineachtige groeifactor-1 (IGF-1) en 10,5 μM ROCK-remmer (Advanced DMEM-F12 + groeifactoren) (zie materiaaltabel).
3. Monitoren van de organoïden
- Bewaak de tumororganoïdekweek visueel gedurende de eerste 7 dagen en daarna drie keer per week.
- Vervang het medium tweemaal per week met Advanced DMEM-F12 met 20 ng/ml recombinante humane epidermale groeifactor (EGF), 100 ng/ml humane placentagroeifactor (PlGF), 10 ng/ml recombinante humane basisfibroblastgroeifactor (bFGF), 769 ng/ml insuline-achtige groeifactor-1 (IGF-1) en 10,5 μM ROCK-remmer (Advanced DMEM-F12 + groeifactoren).
- Leg periodiek beelden vast van de tumororganoïdecultuur op dag 1, dag 3, dag 7, dag 10 en dag 15 na verwerking van het monster en het plateren van de kweek in de matrix om de groei en levensvatbaarheid te observeren.
4. Passage en cryo-opslag van de organoïden
- Verwijder het kweekmedium van de plaat met 6 putjes.
- Voeg 1 ml van een geschikt celterugwinningsreagens toe (zie Materiaaltabel) om de basaalmembraanmatrix te dissociëren en een celsuspensie te verkrijgen, en het supernatans terug te winnen in een buisje van 15 ml. Als de matrix niet onmiddellijk dissocieert, incubeer het monster dan gedurende 15-20 minuten bij 4 °C totdat het volledig is opgelost.
- Voeg 1 ml van hetzelfde celterugwinningsreagens dat in stap 4.2 is gebruikt, toe aan het putje van de plaat om extra gedissocieerde cellen terug te winnen, en voeg het supernatans toe aan hetzelfde buisje van 15 ml als in stap 4.2.
- Voeg 5 ml koude Advanced DMEM-F12 toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 x g .
- Verwijder het supernatant en droog de pellet zorgvuldig af door de resterende vloeistof te verwijderen met een pipet van 5 ml; Vermijd zoveel mogelijk het verplaatsen van de buis. Resuspendeer de celpellet in tweemaal het oorspronkelijke volume van de basaalmembraanmatrix om een doorgang van 1:2 te verkrijgen.
- Voor de cryo-opslag van de organoïdeculturen, resuspendeert de in stap 4,5 verkregen pellet in 1 ml vriesmedium (10% DMSO, 20% FBS, 50% DMEM-F12, 10,5 μM ROCK-remmer) en bewaart bij -80 °C.
OPMERKING: Het volume van de basaalmembraanmatrix kan worden aangepast om verschillende passages uit te voeren, zoals 1:1 (met hetzelfde volume van de basaalmembraanmatrix als het origineel) of 1:3 (drie keer het oorspronkelijke volume van de basaalmembraanmatrix toevoegen).
5. Vestiging van fibroblasten
- Na het opvangen van het puin en de weefselresten in 2 ml DMEM met 10% FBS, voeg je dit toe aan een plaat met 6 putjes en incubeer je dit bij 37 °C met 5% CO2.
- Verwijder de weefselresten uit de fibroblastculturen uit stap 2.5 door de aspiratie van het medium 2 dagen of 3 dagen na het uitplateren, en vervang ze door verse DMEM met 10% FBS.
- Bewaak de fibroblastcultuur drie keer per week visueel en verander het kweekmedium minstens twee keer per week met DMEM aangevuld met 10% FBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het is belangrijk om te documenteren hoe de tumororganoïdekweek zich in de loop van de tijd ontwikkelt, vooral in de eerste paar weken, om in te schatten hoe de kweek zich zal gedragen in stroomafwaartse tests. Figuur 2 toont een voorbeeld van optimale isolatie van tumorcellen en het tot stand brengen van tumororganoïden uit vers weefsel gedurende een periode van 15 dagen. Soms zit er een grote hoeveelheid celresten in het monster en is het moeilijk om de zich ontwikkelende tumororganoïden te zien, zoals weergegeven in figuur 3. Bovendien kan het fenotype van de zich ontwikkelende organoïden variëren van geïsoleerde, afgeronde organoïden (Figuur 4A) tot sferoïde/aggregaatachtige culturen (Figuur 4B-D), en dit hangt af van de oorsprong van de tumor. Fibroblasten zijn een veelvoorkomend bijproduct van de vestiging van primaire tumorcelkweek van solide tumoren, vooral die met een hoog stromagehalte, en kunnen vaak de organoïdecultuur besmetten. Figuur 5 laat zien hoe deze cellen na ongeveer 7 dagen uit de koepels van de basale membraanmatrix migreerden en zich aan de kweekplaten hechtten. Deze cellen consumeren de voedingsstoffen uit het kweekmedium, waardoor de optimale groei van organoïden in gevaar komt.
Primaire fibroblasten kunnen worden verkregen als een geïsoleerde cultuur wanneer ze uit de weefselsecties migreren, zich hechten aan de kweekplaten en groeien als een eenlaagse cultuur, zoals weergegeven in figuur 6. Dit protocol beveelt aan om standaard DMEM-medium met 10% FBS te gebruiken voor de kweek van de fibroblasten. Er kan echter ook een gespecialiseerd medium voor fibroblasten worden gebruikt. Aanhangende fibroblasten zijn ongeveer 7 dagen na het uitplateren zichtbaar (Figuur 6).
Figuur 1: Verwerking van verse weefselmonsters om tumororganoïden vast te stellen. Er wordt een overzicht getoond van het voorbereidingsproces van tumororganoïden, van weefselvertering tot het plateren van de organoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een tumororganoïdecultuur gemaakt van een PDX afkomstig van een verse PDAC-tumor. De progressie van de tumororganoïdecultuur over meerdere dagen wordt getoond, met afbeeldingen van de organoïden in één microscopisch vlak op dag 1, dag 3, dag 7, dag 10 en dag 15. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeelden van een niet-optimale tumororganoïdekweek op dag 2 met overtollig celafval. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vastgestelde tumororganoïden van verschillende PDAC PDX-weefsels die verschillen in grootte en morfologie vertonen. Tumororganoïden kunnen een (A) klassiek afgerond fenotype hebben of (B-D) een meer sferoïde/aggregaat-type uiterlijk. De gemiddelde grootte van de organoïden varieert van 80 uM tot 100 uM, hoewel sommige organoïden wel 200 uM groot kunnen zijn. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van een niet-optimale tumororganoïdecultuur (A-C) die na 30 dagen in kweek besmet is met CAF's/fibroblasten. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbeelden van primaire fibroblastculturen die zijn vastgesteld op basis van de restanten van het verteerde primaire tumorweefsel . (A) Confluente cultuur. (B) Niet-confluente cultuur. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Probleemoplossing van tumororganoïdekweek. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grote vooruitgang in farmacologische kankertherapieën is een uitdaging, aangezien de kans op goedkeuring van geneesmiddelen in fase I klinische onderzoeken naar oncologie 5,1% is, wat het laagste is van alle ziektetypes. De belangrijkste reden is dat kanker zeer heterogeen is en daarom reageren patiëntencohorten niet uniform zoals verwacht op de gegeven behandeling, wat benadrukt dat een meer gepersonaliseerde aanpak nodig is. Tweedimensionale (2D) culturen worden al vele jaren gebruikt in translationeel kankeronderzoek, maar missen de structurele 3D-organisatie die wordt aangetroffen in primaire tumoren. Ze geven dus geen nauwkeurige weergave van de therapierespons van de patiënt en de communicatie van tumorcellen met elkaar of met hun micro-omgeving 3,23. Het onderliggende kernprincipe van alle 3D-kweeksystemen is het bevorderen van cellulaire interactie met de omgeving en het organiseren van cellen op een ruimtelijk relevante manier, vergelijkbaar met in de primaire tumor (in situ). De morfologie van tumororganoïden varieert van rond, massa- en druifachtig tot stellaat, afhankelijk van de inherente aard van gekweekte cellen en de gebruikte kweekomstandigheden, zoals weergegeven in figuur 4. Gevestigde, van de patiënt afkomstige tumororganoïdeculturen kunnen worden behandeld met dezelfde eerstelijnsbehandeling die bij de patiënt wordt gebruikt om te bevestigen dat de tumororganoïde de klinische situatie recapituleert (d.w.z. de respons op de klinische therapie)1,13,24,25.
De tumororganoïden kunnen ook worden behandeld met nieuwe farmacologische middelen, wat een verkennende benadering biedt voor het identificeren van nieuwe therapieën die kunnen worden gebruikt in volgende behandelingslijnen in de kliniek wanneer de standaardtherapie-opties zijn uitgeput. De kweek wordt continu gemonitord om de respons van de tumororganoïdeculturen op het middel in realtime te beoordelen. Een haalbaarheidsstudie van de moleculaire en immunohistochemische karakterisering van van patiënten afgeleide xenotransplantaattumoren (PDX) en PDX-afgeleide organoïden toonde aan dat de morfologie, eiwitexpressie en genomische veranderingen vergelijkbaar waren tussen de twee modellen. Bovendien toonde een proof-of-concept-studie van farmacotypering aan dat de in vivo en ex vivo voorspellingen ook vergelijkbaar waren en concludeerde dus dat het gebruik van tumororganoïden als kanker/ziektemodel een haalbare en robuuste aanpak is die kan worden toegepast in de klinische setting2.
Een reeks uitdagingen met betrekking tot het opzetten van tumororganoïdeculturen afkomstig van verschillende tumortypes zijn hierin belicht en onlangs beoordeeld26,27,28. Belangrijke kwesties zijn onder meer "contaminatie/overgroei" door gezonde cellen, die organoïden vormen met een hogere groeisnelheid dan kankercellen, de hoge kosten van kweekonderhoud in vergelijking met 2D-culturen, de lage vestigingsgraad, inconsistenties in het somatische mutatieprofiel en de histologie tussen de ex vivo cultuur en de tumor van oorsprong, primaire tumorheterogeniteit, het gebruik van een op muizen gebaseerde extracellulaire matrix, die mogelijk niet optimaal zijn voor menselijke cellen en de afgifte van geneesmiddelen kunnen belemmeren, de afwezigheid van de TME en geassocieerde cellen, de interferentie van groeifactoren of moleculaire remmers met de geneesmiddelrespons, en het ontbreken van gestandaardiseerde en gevalideerde protocollen voor het opstellen en onderhouden van tumororganoïden. In de loop der jaren is het gebruik van primaire tumormodellen in kankeronderzoek echter toegenomen en zijn de technieken om primaire culturen te kweken en te onderhouden verbeterd. Deze delicate ex vivo-culturen worden tot stand gebracht en onderhouden door supplementen toe te voegen om de celgroei en stabiliteit te bevorderen. De Rho-kinaseremmer (ROCK) wordt nu routinematig toegevoegd aan primaire culturen om apoptose te voorkomen en de cel-celadhesie te verbeteren, waardoor de langdurige uitbreiding van stabiele primaire in-vitroculturen wordt bevorderd29. Bovendien verhoogt het ook de overleving van ontdooide ingevroren stamcellen, wat belangrijk is bij het genereren van bevroren voorraden organoïdeculturen29. Suppletie met heparine kan ook worden gebruikt om de expansie van stamcellen te verbeteren door de WNT- en FGF-signalering en dus de celproliferatie te verhogen30. Andere belangrijke reagentia die in dit gevalideerde protocol worden gebruikt om de vestiging van tumororganoïden te optimaliseren, zijn Accutase en DNase. Accutase is een zacht spijsverteringsreagens dat wordt aanbevolen om individuele stamcellen te scheiden of los te maken van de kweekoppervlakken, en het helpt de levensvatbaarheid van de cellen beter te behouden dan het gebruik van andere reagentia die voor dit doel zijn ontworpen, zoals trypsine31. Collagenasen kunnen echter ook worden gebruikt om zich specifiek te richten op het collageentype dat in het biologische basale membraan is opgenomen. DNase wordt al vele jaren gebruikt in celisolatiemethoden32 om DNA-resten van dode en necrotische cellen tijdens het extractieprotocol te elimineren en zo het samenklonteren/samenklonteren van cellen als gevolg van de verhoogde viscositeit van de monstervoorbereiding te voorkomen. Celpellets worden vaak behandeld met lysisbuffer, maar deze stap kan worden uitgesloten wanneer er geen zichtbaar bewijs is van besmetting met rode bloedcellen van het weefselmonster8 (aanvullend dossier 1).
De succesvolle oprichting van tumororganoïden komt niet zonder inherente biologische complicaties. Idealiter zouden weefsels voor tumororganoïdeculturen op dezelfde dag als de oogst moeten worden verwerkt om de levensvatbaarheid van de cellen te optimaliseren. Het invriezen van weefsels wordt niet altijd aanbevolen, omdat dit de levensvatbaarheid van de cellen aanzienlijk kan verminderen. Tumororganoïden kunnen echter worden vastgesteld met behulp van monsters die snel zijn ingevroren of langzaam zijn ingevroren in DMSO-bevattend vriesmedium33,34, waardoor monsterverzending en biobanking mogelijk zijn. In sommige gevallen is het mogelijk om 2D-culturen te verkrijgen uit tumororganoïdeculturen die meerdere keren zijn gepasseerd door het herstel van de tumorcellen die aan de platen zijn bevestigd na het verwijderen van de koepels van de basale membraanmatrix. Onze ervaring is dat het slagingspercentage van het vaststellen van tumororganoïden veel hoger is met PDX PDAC-weefsel dan met vers PDAC-weefsel afkomstig van een gereseceerd monster4. Dit is te wijten aan het feit dat er meestal grotere stukken vers PDX-PDAC-weefsel beschikbaar zijn, en dit weefsel heeft een hogere cellulariteit, waarschijnlijk vanwege de meer gastvrije in vivo-omgeving die wordt geboden door het PDX-model in vergelijking met ex vivo gebaseerde benaderingen. Niet-toxische stoffen kunnen aan het kweekmedium worden toegevoegd om de levensvatbaarheid van de cel en de proliferatie van de kweek te controleren. Bovendien moet de overgroei van niet-neoplastische organoïden worden vermeden met behulp van selectieve voorwaarden35,36. Pancreasweefsel kan spijsverteringsenzymen bevatten die de levensvatbaarheid van de geïsoleerde tumorcellen kunnen beïnvloeden; Trypsine kan dus worden toegevoegd aan de verteringsstap om dit probleem op te lossen4. Veel andere factoren, zoals de status van de patiënt/het weefsel (d.w.z. behandeld of onbehandeld met oncologische therapie), het type tumor, de besmetting van het monster uit de operatiekamer en de oorspronkelijke graad van de tumor, kunnen ook het vermogen om een tumororganoïde te maken aanzienlijk beïnvloeden. Evenzo heeft niet elk weefsel voldoende levensvatbare tumorcellen om primaire culturen tot stand te brengen. Dit geldt met name voor PDAC-tumoren, die notoir stromarijk zijn (ongeveer 90%-95%) en een klein percentage epitheliale tumorcellen bevatten. Bovendien kunnen weefsels met een hoog stromagehalte moeilijk te knippen en te dissociëren zijn om enkele tumorcellen voor kweek te verkrijgen. Gespecialiseerde en in de handel verkrijgbare spijsverteringsmedia kunnen worden toegevoegd, of mechanische dissociatieapparatuur kan ook worden gebruikt als het weefsel niet volledig is verteerd. Als alternatief kan een grondige weefseldissociatie worden bereikt door continu te snijden met behulp van twee scalpelmesjes totdat het weefsel er halfvloeibaar uitziet (zie videodemonstratie).
Er zijn veel technische valkuilen tijdens de procedure die ook moeten worden benadrukt. Weefselresten kunnen bijvoorbeeld het filter blokkeren en het filter moet dan worden vervangen, omdat de restanten de doorgang van het vloeibare supernatant belemmeren. De filtratiestap kan meerdere keren worden herhaald om de maximale hoeveelheid gedissocieerde tumorcellen te herstellen. Verder is het belangrijk om de celpellet na elke centrifugatiestap te controleren, omdat het soms moeilijk te zien is wanneer er een laag celgetal is. Het pipetteren van de celpellets moet voorzichtig en langzaam gebeuren, omdat agressief pipetteren kan leiden tot verlies van cellen of een vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen. Bovendien moeten bij de bereiding van het matrix-celmengsel media worden gebruikt die zijn voorgekoeld tot 4 °C en gekoelde tips die zijn opgeslagen bij -20 °C, omdat de matrix snel stolt. Ten slotte, en zoals hierboven vermeld, helpt DNase het samenklonteren van cellen tijdens de monstervoorbereiding te voorkomen. Het wordt ook aanbevolen om de in het protocol gebruikte reagentia te aliquoteren en groeifactormengsels te bereiden om te voorkomen dat de reagentia herhaaldelijk worden ingevroren en ontdooid.
De isolatie van primaire fibroblasten is van belang, omdat ze een belangrijk celtype zijn in PDAC en kunnen worden gebruikt voor latere co-cultuurexperimenten om de effecten van de TME op de groei van tumorcellen te bepalen. Na ongeveer 1 week zijn de fibroblasten uit de weefselsecties gemigreerd en kunnen ze meestal worden gezien als gehecht aan de kweekplaten en groeien als een monolaagcultuur. De aanwezigheid van fibroblasten in de kweek heeft echter ook nadelen, omdat ze de voedingsstoffen uit het kweekmedium consumeren en zo de optimale groei van de tumororganoïden in gevaar brengen. Ultra-low attachment (ULA)-platen worden vaak aanbevolen voor het kweken van tumororganoïden om de groei van fibroblasten te beperken, omdat ze zich gemakkelijk hechten aan standaard met celkweek behandelde platen. Dit gevalideerde protocol beveelt het gebruik van standaard DMEM-media met 10% FBS aan voor de kweek van primaire fibroblasten, hoewel gespecialiseerde media voor fibroblasten ook kunnen worden gebruikt.
Het is belangrijk om de toestand van de tumororganoïdecultuur in de loop van de tijd te documenteren, vooral tijdens de eerste week, omdat de kweek zich anders gedraagt, afhankelijk van de kwaliteit, kwantiteit en bron van het weefsel (primaire menselijke resectabele tumoren versus PDX'en). Niet-toxische stoffen kunnen aan het kweekmedium worden toegevoegd om de levensvatbaarheid van de cel en de proliferatie van de kweek te controleren. De culturen moeten de eerste 7 dagen dagelijks visueel worden gecontroleerd en daarna twee tot drie keer per week. Bovendien moet het medium om de 4-5 dagen worden vervangen of wanneer het zuur lijkt (geel lijkt), waarbij ervoor moet worden gezorgd dat de koepels van de basaalmembraanmatrix niet worden beschadigd. In het begin kunnen grote bruine klonten verschijnen als gevolg van een hoge celdichtheid. Dit zou echter na de eerste passage moeten verdwijnen, zodat duidelijk gedefinieerde tumororganoïden kunnen worden verkregen op een duidelijke achtergrond van de basaalmembraanmatrix. Het maken van foto's van de tumororganoïden wordt aanbevolen, vooral tijdens de eerste 3 weken, om het visuele fenotype en de groeisnelheid van de tumororganoïden te bepalen. De passage van de tumororganoïdecultuur is ook een technische uitdaging. Over het algemeen wordt het kweekmedium verwijderd en worden de matrixkoepels losgekoppeld van op trypsine gebaseerde of gespecialiseerde reagentia bij 4 °C totdat de basaalmembraanmatrix volledig is opgelost. De celpellet wordt vervolgens geresuspendeerd in een nieuwe matrix en het volume wordt aangepast om de gewenste passage uit te voeren, zoals 1:1 (met hetzelfde matrixvolume als het origineel) of 1:3 (waarbij drie keer het oorspronkelijke volume van de benadering wordt toegevoegd). De groep van David Tuveson, bestaande uit experts op het gebied van pancreasorganoïden, biedt online bronnen met protocollen voor het vaststellen, onderhouden en kleuren van pancreasorganoïden37.
Van de patiënt afgeleide ex vivo tumororganoïden bieden een waardevol preklinisch model voor het beoordelen van patiëntspecifieke behandelingsgevoeligheid voor toepassing in gepersonaliseerde geneeskunde. Bovendien zijn deze modellen fysiologisch relevantere tumormodellen in vergelijking met traditionele 2D-aanhangende celmonolagen. Een duidelijke en consistente nomenclatuur van 3D-tumormodellen met periodieke fotografische en beschrijvende follow-up van de kweek is nodig op het gebied van tumormodellen. Bovendien is het werken met gestandaardiseerde protocollen van het grootste belang voor het succes van deze technologie in de kliniek bij het bepalen van de gevoeligheid van geneesmiddelen op patiëntspecifieke basis. Onderzoekers die deze technologie gebruiken, moeten zich bewust zijn van de obstakels en valkuilen van deze gevoelige en complexe modellen. Het werken met een gevalideerd protocol en duidelijk gedefinieerde voorwaarden en opties voor probleemoplossing zal echter helpen bij het voorkomen van technische problemen en het optimaliseren van het opzetten en onderhouden van de cultuur. Hier wordt een gevalideerd protocol geboden voor het vaststellen van tumororganoïden en het isoleren van fibroblasten die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd in veel translationele oncologische laboratoria met standaardapparatuur en weefselkweekervaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door financiering van de Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 857381, project VISION (Strategieën ter versterking van wetenschappelijke excellentie en innovatiecapaciteit voor vroege diagnose van gastro-intestinale kankers), Intramurale oproep voor nieuwe onderzoeksprojecten voor klinische onderzoekers en opkomende onderzoeksgroepen IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) en het TRANSCAN II-project JTC 2017 call "Establishing an algorithm for the early diagnosis and follow-up of patients with pancreas neuro-endocrine tumors (NExT)", subsidienummer 1.1.1.5/ERANET/20/03. De biologische monsters die in dit protocol worden gebruikt, zijn geleverd door het BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) en geïntegreerd in het platform voor biobanken en biomodellen van de ISCIII (PT20/00045). We willen ook Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita en Thorsten Knoll bedanken voor hun onschatbare steun bij het ontwikkelen van dit protocol als onderdeel van de NExT- en VISION-projecten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
References
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids - A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al.
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H.
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab. , Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023).
