Summary
Tumor-Organoide haben die Krebsforschung und den Ansatz der personalisierten Medizin revolutioniert. Sie stellen ein klinisch relevantes Tumormodell dar, das es Forschern ermöglicht, dem Tumor in der Klinik einen Schritt voraus zu sein. Dieses Protokoll etabliert Tumor-Organoide aus frischen Gewebeproben des Pankreastumors und von Patienten stammenden Xenotransplantaten aus dem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse.
Abstract
Tumororganoide sind dreidimensionale (3D) ex vivo Tumormodelle, die die biologischen Schlüsselmerkmale des ursprünglichen primären Tumorgewebes rekapitulieren. Von Patienten stammende Tumororganoide wurden in der translationalen Krebsforschung verwendet und können zur Beurteilung der Behandlungsempfindlichkeit und -resistenz, der Zell-Zell-Interaktionen und der Tumorzellinteraktionen mit der Tumormikroumgebung eingesetzt werden. Tumor-Organoide sind komplexe Kultursysteme, die fortschrittliche Zellkulturtechniken und Nährmedien mit spezifischen Wachstumsfaktor-Cocktails und einer biologischen Basalmembran erfordern, die die extrazelluläre Umgebung nachahmt. Die Fähigkeit, primäre Tumorkulturen zu etablieren, hängt stark vom Ursprungsgewebe, der Zellularität und den klinischen Merkmalen des Tumors, wie z. B. dem Tumorgrad, ab. Darüber hinaus sind die Entnahme von Gewebeproben, die Materialqualität und -quantität sowie das korrekte Biobanking und die Lagerung entscheidende Elemente dieses Verfahrens. Auch die technischen Möglichkeiten des Labors sind entscheidende Faktoren, die es zu berücksichtigen gilt. Hier berichten wir über ein validiertes SOP/Protokoll, das technisch und wirtschaftlich für die Kultivierung von ex vivo Tumororganoiden aus frischen Gewebeproben des Pankreas-Adenokarzinoms geeignet ist, entweder aus frischem primär reseziertem Patientenspendergewebe oder patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDX). Die hier beschriebene Technik kann in Laboratorien mit grundlegenden Gewebekultur- und Mauseinrichtungen durchgeführt werden und ist auf eine breite Anwendung im Bereich der translationalen Onkologie zugeschnitten.
Introduction
Tumor-Organoide sind ex vivo dreidimensionale (3D) organisierte Kulturen, die aus frischem Tumorgewebe gewonnen werden und Krebsmodelle liefern. Tumor-Organoide rekapitulieren die biologischen Schlüsselmerkmale des ursprünglichen Primärtumors 1,2,3,4 und können, ähnlich wie herkömmliche immortalisierte Zelllinien, für bis zu mehrere Monate expandiert und kryokonserviert werden. Tumororganoide stellen eine Biobank von patientenabgeleiteten Tumormodellen für die translationale/personalisierte Medizin dar5 und stellen einen wichtigen Fortschritt in den Systemen und Modellen der Krebszellbiologie dar. Patienten-abgeleitete Tumor-Organoide können als Ex-vivo-Modelle verwendet werden, um die Wirksamkeit von (neo)adjuvanten onkologischen/pharmakologischen Therapien vorherzusagen, für die Kulturen aus frischem Tumorgewebe etabliert und Arzneimittelsensitivitätsassays oder Pharmakotypisierungen patientenspezifisch durchgeführt werden, um wirksame Wirkstoffe für nachfolgende Therapielinien zu identifizieren 1,4. Darüber hinaus überwinden Tumororganoide die Begrenzung der Verfügbarkeit von primärem Tumorgewebe und, was noch wichtiger ist, sie bieten eine hervorragende Alternative oder Ergänzung zu In-vivo-Mausmodellen, wie z. B. patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDX)2. Die Komplexität von Tumororganoiden wird erhöht, wenn die primären Tumorzellen mit Stromazellen kombiniert werden, die sich in der Tumormikroumgebung (TME) befinden, wie z. B. krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs), Endothelzellen und Immunzellen, die die Funktionsweise und komplexe Zellularität des Primärtumors nachahmen. Tumor-Organoide wurden für viele Tumorarten unter Verwendung standardisierter Protokolle 6,7,8,9,10 etabliert. Die Vermehrung von Organoiden aus verschiedenen soliden Tumoren, einschließlich Darm- und Brustkrebsgewebe, ist gut etabliert und technisch erschwinglich 11,12,13,14,15.
Chirurgische Tumorresektionen oder Tumorbiopsien liefern primäre Tumorgewebeproben. Im Idealfall sollten Tumorgewebeproben aus dem Zentrum der Tumormasse oder dem eindringenden Rand des Tumors sowie aus normal aussehendem Gewebe in der Nähe des Tumors stammen. Im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kulturen benötigen Tumororganoide mehrere "Add-ons", darunter eine biologische Basalmembran (wie Matrigel, Hydrogel oder ein kollagenbasiertes Gerüst), die das extrazelluläre TME nachahmt, und ein flüssiges Wachstumsmedium, das spezifische Nährstoffe und Wachstumsfaktoren liefert und die Zellproliferation und Lebensfähigkeit in Kultur unterstützt16.
Die grundlegendsten Schritte in der primären Zellkultur sind das Waschen des Gewebes in Kochsalzlösung, um eine Kontamination zu verhindern, das mechanische Schneiden/Verdauen des Tumors in kleine Stücke von 1-3mm3 und die Behandlung mit Kollagenase für die enzymatische Verdauung des Gewebes. Die verdaute Mischung wird dann filtriert, um große Gewebefragmente zu entfernen, in einer biologischen Basalmembran wie Matrigel resuspendiert und als Kuppeln in Kulturplatten mit geringer Anhaftung plattiert, um das Wachstum ohne Anhaftung zu fördern. Die Membran-Kuppeln der Basalmembran sind mit flüssigem Nährmedium bedeckt und mit Glutamin und Antibiotika ergänzt, um eine Kontamination zu vermeiden, sowie mit spezifischen Wachstumsfaktoren je nach Gewebetyp 7,8,9,16,17. Andere relevante Zellen, die innerhalb des Massentumors und der TME vorhanden sind, können ebenfalls isoliert werden, wie z. B. krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) und Immunzellen. Diese Technik, die kürzlich überprüft wurde18, ermöglicht die Etablierung von Kokulturen mit verschiedenen Zelltypen, um das Ansprechen auf die Therapie in einer "realistischeren" Tumorumgebung zu untersuchen. Darüber hinaus können Zell-Zell-Interaktionen und die Interaktion zwischen Tumorzellen und Komponenten der umgebenden biologischen Matrix untersucht werden.
Die berichtete Erfolgsrate der Etablierung von Tumororganoiden unter Verwendung von frischem Gewebe aus Biopsien oder reseziertem gastrointestinalem Tumorgewebe liegt bei etwa 50 %11, wobei die Erfolgsrate bei letzterem weitgehend vom Gewebetyp undder Herkunft 4 abhängt, insbesondere vom Tumorgrad und der allgemeinen Tumorzellularität. Dreidimensionale Tumormodelle haben eine unterschiedliche Komplexität, von einfachen einzelligen Aggregaten bis hin zu hochkomplexen Modellen, die aus verschiedenen Zelltypen bestehen. Die Terminologie, die in der Literatur zur Beschreibung von 3D-Kulturen verwendet wird, ist höchst inkonsistent 19,20,21, da verschiedene Begriffe wie Sphäroide, Tumorsphären und Organoide verwendet werden, obwohl der Unterschied zwischen ihnen unklar ist. Da ein eindeutiger Konsens über die Definition noch nicht erreicht wurde, wird in diesem Artikel ein Tumororganoid als eine organisierte Tumorzellkultur beschrieben, die in eine biologische Basalmembran eingebettet ist.
Hierin wird ein validiertes Protokoll für die Etablierung von Tumororganoiden aus frischen Gewebeproben vorgestellt, die aus einem frischen primär resezierten oder PDX-abgeleiteten duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) stammen, und dieses Protokoll kann in den meisten Laboratorien mit grundlegenden Gewebekultureinrichtungen durchgeführt werden. Dieses Protokoll wurde von mehreren hochmodernen Protokollen adaptiert, die derzeit verwendet werden, um Tumororganoide oder Tumoroide aus Verdauungstumorgewebe aus den Gruppen von David Tuveson9, Hans Clevers8 und Aurel Perren7 zu etablieren.
In diesem Protokoll wird nicht erläutert, wie das frische Gewebe geerntet wird. Um qualitativ hochwertiges frisches menschliches Tumorgewebe zu erhalten, ist es wichtig, eine effiziente Koordination zwischen den Chirurgen, die das Gewebe entnehmen, und der Pathologieabteilung, die die Gewebeprobe für die Organoidkultur entnimmt, zu haben. Auch bei der Verwendung von PDX als Frischgewebequelle ist eine effiziente Koordination mit der Person, die die Gewebeprobe entnimmt, wichtig. Es ist wichtig, die Gewebeprobe so schnell wie möglich zu erhalten (innerhalb von 30-60 Minuten nach der Entnahme), um eine hohe Qualität aufrechtzuerhalten.
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Protocol
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für das Wohlergehen von Versuchstieren durchgeführt, die von der Ethikkommission der Universidad Autónoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) und La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) genehmigt wurden, sowie in Übereinstimmung mit den Richtlinien für ethisches Verhalten bei der Pflege und Verwendung von Tieren, wie sie in den Internationalen Leitprinzipien für die biomedizinische Forschung mit Tieren festgelegt sind. vom Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS) entwickelt. Das Protokoll folgte den ethischen Grundsätzen für biomedizinische Forschung mit schriftlicher Einverständniserklärung. Für die Verwendung von frischem Gewebe für die Etablierung der Tumororganoidkulturen wurde eine vorherige ethische Genehmigung eingeholt. Die Proben wurden vom BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (Nationales Register der Biobanken B.0000678) zur Verfügung gestellt, in die Biobanken- und Biomodellplattform des ISCIII (PT20/00045) integriert und nach Standardarbeitsanweisungen mit der entsprechenden ethischen Genehmigung verarbeitet. Die Tumoren wurden, wie zuvor beschrieben22, subkutan in immungeschwächte 6 Wochen alte weibliche NU-Foxn1nu-Nacktmäuse implantiert (siehe Materialtabelle) und in vivo zur Etablierung von PDAC-PDXs durchgelassen.
1. Experimentelle Vorbereitung
- Behandeln Sie menschliche Proben in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II.
- Tragen Sie während des gesamten Eingriffs einen Laborkittel, Schutzhandschuhe und eine Brille, um eine Infektion mit durch Gewebe übertragenen Krankheitserregern zu vermeiden.
HINWEIS: Es sind mindestens 3 Stunden erforderlich, um die frische Gewebeprobe zu verarbeiten und die Organoide und Fibroblasten zu plattieren. - Die frischen Gewebeproben22 werden innerhalb von maximal 24 Stunden nach der Entnahme verarbeitet und bis zur Verarbeitung bei 4 °C in Gewebekulturmedium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin) gelagert.
- Bewahren Sie alle Proben und Reagenzien während des gesamten Verfahrens auf dem Eis auf und stellen Sie sicher, dass Sie eine gekühlte Zentrifuge auf 4 °C voreinstellen und mit niedriger Geschwindigkeit verwenden, um eine Beschädigung der Zellvorbereitung zu vermeiden.
- Bewahren Sie die Pipettenspitzen P1.000 und P200 in einem Gefrierschrank bei −20 °C auf, um sie während des Protokolls zu verwenden.
- Aliquotieren Sie die Basalmembranmatrix (siehe Materialtabelle) vor der Verwendung. Für dieses Protokoll werden 250-ml-Aliquots empfohlen.
2. Aufbereitung von frischem Primärtumorgewebe zur Etablierung von Tumororganoiden und primären Fibroblasten
HINWEIS: Für die Verarbeitung der frischen Gewebeprobe (entweder primär humane resezierbare Tumoren oder PDXs) und die Platte der Tumororganoide und Fibroblasten sind mindestens 3 h erforderlich. Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den Prozess der Organoidpräparation, vom Gewebeaufschluss bis zur Plattierung der Tumororganoide. Bevor Sie mit dem Protokoll beginnen, nehmen Sie ein Aliquot der Basalmembranmatrix aus dem −20 °C-Gefrierschrank und lassen Sie es vor der Verwendung ca. 30-60 Minuten auf Eis.
- Legen Sie eine 6-Well-Kulturplatte 3 h vor dem Plattieren der Organoide in einen 37 °C heißen Zellkultur-Inkubator.
- Messen, fotografieren und waschen Sie das Gewebe (Schritt 1.3) mit 3 ml Advanced DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nährstoffmischung F-12 Schinken (F12), ergänzt mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS), 15 mM Hepes, 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin, 125 ng/ml Amphotericin B, 0,1 mg/ml Normocin) (siehe Materialtabelle) und waschen Sie es dann mit 3 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Auf- und Abpipettieren.
- Entfernen Sie das Medium durch Aspiration von der Gewebekulturplatte und schneiden Sie das Gewebe in einer sterilen Gewebekulturplatte mit zwei sterilen Klingen und 2 ml Verdauungsmedium (Advanced DMEM-F12 + 10 mg Kollagenase IV/ml, 0,000625% Trypsin-EDTA und 10 μg/ml DNase) in1 mm 3 Stücke. Das Gewebe wird in einem 50-ml-Röhrchen mit insgesamt 5 ml Aufschlussmedien entnommen und 1 Stunde lang bei 37 °C mit mechanischem Aufschluss mit handelsüblichen Geräten (siehe Materialtabelle) oder mit regelmäßigem Mischen der Probe durch Pipettieren der Probe auf und ab inkubiert.
- Fügen Sie 5 ml Advanced DMEM-F12 hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, und filtern Sie die Probe durch ein 70-μm-Porensieb, um große Ablagerungen zu entfernen.
- Geben Sie 2 ml DMEM mit 10 % FBS an die Oberseite des Filters und sammeln Sie die Ablagerungen und Gewebereste, um Kulturen von Fibroblasten zu etablieren (siehe Schritt 5).
- Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 200-300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und saugen Sie den Überstand ab, so dass nur das Zellpellet übrig bleibt. Fügen Sie 5 ml Advanced DMEM-F12 hinzu und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 300 x g.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 4 ml Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer (ACK, siehe Materialtabelle). Geben Sie die Mischung in ein 15-ml-Röhrchen und inkubieren Sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.
HINWEIS: Dieser Lyseschritt der roten Blutkörperchen kann entfernt werden, wenn es keine sichtbaren Anzeichen einer Kontamination gibt. - Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand absaugen. Fügen Sie 5 ml Advanced DMEM-F12 hinzu und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 300 x g.
- Geben Sie 1 ml handelsübliches Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle), ergänzt mit DNase (1 μg/ml), zum Zellpellet und inkubieren Sie es 2-3 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Bei 300 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand absaugen. Fügen Sie 5 ml Advanced DMEM-F12 hinzu und resuspendieren Sie das Zellpellet.
- 30 Mal mit einer P1.000-Pipette auf und ab pipettieren, um die Zellen zu dissoziieren, 5 Minuten bei 300 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
- Nehmen Sie P1.000- und P200-Pipettenspitzen aus dem −20 °C-Gefrierschrank und resuspendieren Sie das Zellpellet in der Membranmatrix mit einer P1.000-Pipette und kalten Spitzen (50 μl pro Tropfen, unter Berücksichtigung des Pelletvolumens, sechs bis sieben Kuppeln pro Well). Nehmen Sie die zuvor erhitzte Platte aus dem Inkubator. Stellen Sie eine P200-Pipette auf 48 μl ein und verwenden Sie kalte Spitzen, um Kuppeln der Basalmembranmatrix in der vorgeheizten 6-Well-Platte zu erzeugen.
- Legen Sie die Platte mit den Basalmembran-Matrix-Zelldomen für 15 min in den 37 °C 5% CO2 -Inkubator, um die Basalmembranmatrix zu verfestigen.
- Fügen Sie 2-2,5 ml Advanced DMEM-F12 hinzu, ergänzt mit 20 ng/ml rekombinantem humanem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng/ml humanem Plazenta-Wachstumsfaktor (PlGF), 10 ng/ml rekombinantem humanem basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 769 ng/ml insulinähnlichem Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) und 10,5 μM ROCK-Inhibitor (Advanced DMEM-F12 + Wachstumsfaktoren) (siehe Materialtabelle).
3. Überwachung der Organoide
- Überwachen Sie die Tumor-Organoid-Kultur in den ersten 7 Tagen visuell und danach dreimal pro Woche.
- Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche mit Advanced DMEM-F12, das 20 ng/ml rekombinanten humanen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng/ml humanen Plazenta-Wachstumsfaktor (PlGF), 10 ng/ml rekombinanten humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 769 ng/ml insulinähnlichen Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) und 10,5 μM ROCK-Inhibitor (Advanced DMEM-F12 + Wachstumsfaktoren) enthält.
- Nehmen Sie regelmäßig Bilder der Tumor-Organoid-Kultur an Tag 1, Tag 3, Tag 7, Tag 10 und Tag 15 auf, nachdem Sie die Probe verarbeitet und die Kultur in der Matrix plattiert haben, um das Wachstum und die Lebensfähigkeit zu beobachten.
4. Passage und Kryolagerung der Organoide
- Entfernen Sie das Nährmedium von der 6-Well-Platte.
- Fügen Sie 1 ml eines geeigneten Zellrückgewinnungsreagenzes hinzu (siehe Materialtabelle), um die Basalmembranmatrix zu trennen und eine Zellsuspension zu erhalten, und gewinnen Sie den Überstand in einem 15-ml-Röhrchen. Wenn die Matrix nicht sofort dissoziiert, wird die Probe bei 4 °C für 15-20 Minuten inkubiert, bis sie sich vollständig aufgelöst hat.
- Geben Sie 1 ml des gleichen Zellrückgewinnungsreagenzes, das in Schritt 4.2 verwendet wurde, in die Vertiefung der Platte, um zusätzliche dissoziierte Zellen zu gewinnen, und geben Sie den Überstand in dasselbe 15-ml-Röhrchen wie in Schritt 4.2.
- 5 ml kaltes Advanced DMEM-F12 zugeben und 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet vorsichtig, indem Sie die restliche Flüssigkeit mit einer 5-ml-Pipette entfernen. Vermeiden Sie es, den Schlauch so weit wie möglich zu bewegen. Resuspendieren Sie das Zellpellet im doppelten Volumen der Basalmembranmatrix, um eine Passage von 1:2 zu erhalten.
- Für die Kryolagerung der Organoidkulturen wird das in Schritt 4.5 erhaltene Pellet in 1 ml Gefriermedium (10 % DMSO, 20 % FBS, 50 % DMEM-F12, 10,5 μM ROCK-Inhibitor) resuspendiert und bei −80 °C gelagert.
HINWEIS: Das Volumen der Basalmembranmatrix kann so eingestellt werden, dass verschiedene Durchgänge durchgeführt werden, z. B. 1:1 (unter Verwendung des gleichen Volumens der Basalmembranmatrix wie beim Original) oder 1:3 (Hinzufügen des dreifachen Volumens der Basalmembranmatrix).
5. Etablierung von Fibroblasten
- Nach der Rückgewinnung der Ablagerungen und Gewebereste in 2 ml DMEM mit 10 % FBS wird dies auf eine 6-Well-Platte gegeben und bei 37 °C mit 5 %CO2 inkubiert.
- Entfernen Sie die Gewebereste aus den Fibroblastenkulturen aus Schritt 2.5 durch die Aspiration des Mediums 2 Tage oder 3 Tage nach der Beschichtung und ersetzen Sie sie durch frisches DMEM mit 10% FBS.
- Überwachen Sie die Fibroblastenkultur dreimal pro Woche visuell und wechseln Sie das Kulturmedium mindestens zweimal pro Woche mit DMEM, das mit 10% FBS ergänzt wird.
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Representative Results
Es ist wichtig zu dokumentieren, wie sich die Tumororganoidkultur im Laufe der Zeit, insbesondere in den ersten Wochen, entwickelt, um abschätzen zu können, wie sich die Kultur in nachgeschalteten Assays verhalten wird. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für die optimale Isolierung von Tumorzellen und die Etablierung von Tumororganoiden aus frischem Gewebe über einen Zeitraum von 15 Tagen. Manchmal befindet sich eine große Menge an Zelltrümmern in der Probe, und es ist schwierig, die sich entwickelnden Tumororganoide zu erkennen, wie in Abbildung 3 gezeigt. Darüber hinaus kann der Phänotyp der sich entwickelnden Organoide von isolierten, abgerundeten Organoiden (Abbildung 4A) bis hin zu sphäroiden/aggregatartigen Kulturen (Abbildung 4B-D) variieren, und dies hängt von der Herkunft des Tumors ab. Fibroblasten sind ein häufiges Nebenprodukt der Etablierung von primären Tumorzellkulturen aus soliden Tumoren, insbesondere solchen mit einem hohen Stromagehalt, und können häufig die Organoidkultur kontaminieren. Abbildung 5 zeigt, wie diese Zellen nach etwa 7 Tagen aus den Membranmembrankuppeln der Basalmembran wanderten und an den Kulturplatten hafteten. Diese Zellen verbrauchen die Nährstoffe aus dem Nährmedium und beeinträchtigen so das optimale Wachstum von Organoiden.
Primäre Fibroblasten können als isolierte Kultur erhalten werden, wenn sie aus den Gewebeschnitten migrieren, an den Kulturplatten haften und als Monoschichtkultur wachsen, wie in Abbildung 6 dargestellt. Dieses Protokoll empfiehlt die Verwendung von Standard-DMEM-Medium mit 10% FBS für die Kultivierung der Fibroblasten. Es kann aber auch ein spezielles Medium für Fibroblasten verwendet werden. Adhärente Fibroblasten sind etwa 7 Tage nach der Beschichtung sichtbar (Abbildung 6).
Abbildung 1: Aufbereitung frischer Gewebeproben zur Etablierung von Tumororganoiden. Es wird ein Überblick über den Prozess der Herstellung von Tumororganoiden gezeigt, von der Gewebeverdauung bis zur Plattierung der Organoide. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Eine Tumor-Organoid-Kultur, die aus einem PDX hergestellt wurde, der aus einem frischen PDAC-Tumor stammt. Das Fortschreiten der Tumor-Organoid-Kultur über mehrere Tage wird mit Bildern der Organoide in einer mikroskopischen Ebene an Tag 1, Tag 3, Tag 7, Tag 10 und Tag 15 gezeigt. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beispiele für eine nicht optimale Tumororganoidkultur an Tag 2 mit überschüssigen Zelltrümmern. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Etablierte Tumor-Organoide aus verschiedenen PDAC-PDX-Geweben mit Unterschieden in Größe und Morphologie. Tumor-Organoide können einen (A) klassischen runden Phänotyp oder (B-D) ein eher sphäroides/aggregatartiges Erscheinungsbild haben. Die durchschnittliche Größe der Organoide reicht von 80 μM bis 100 μM, obwohl einige Organoide bis zu 200 μM groß sein können. Maßstab: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Beispiele für eine nicht optimale Tumor-Organoid-Kultur (A-C), die nach 30 Tagen in Kultur mit CAFs/Fibroblasten kontaminiert wurde. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Beispiele für primäre Fibroblastenkulturen, die aus den Resten des verdauten primären Tumorgewebes hergestellt wurden . (A) Konfluente Kultur. (B) Nicht-konfluente Kultur. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzungsdatei 1: Fehlerbehebung bei der Etablierung von Tumororganoidkulturen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Große Fortschritte in der pharmakologischen Krebstherapie sind eine Herausforderung, da die Wahrscheinlichkeit der Zulassung von Medikamenten in klinischen Phase-I-onkologischen Studien bei 5,1 % liegt, was die niedrigste aller Krankheitsarten ist23. Der Hauptgrund dafür ist, dass Krebs sehr heterogen ist und daher die Patientenkohorten nicht einheitlich wie erwartet auf die jeweilige Behandlung ansprechen, was unterstreicht, dass ein personalisierterer Ansatz erforderlich ist. Zweidimensionale (2D) Kulturen werden seit vielen Jahren in der translationalen Krebsforschung eingesetzt, aber es fehlt die strukturelle 3D-Organisation, die bei Primärtumoren zu finden ist. Daher spiegeln sie das Ansprechen auf die Therapie des Patienten und die Kommunikation der Tumorzellen untereinander oder mit ihrer Mikroumgebung nicht genau wider 3,23. Das zugrundeliegende Kernprinzip aller 3D-Kultursysteme ist es, die zelluläre Interaktion mit der Umgebung zu fördern und Zellen räumlich relevant zu organisieren, ähnlich wie im Primärtumor (in situ). Die Morphologie von Tumororganoiden variiert von rund, masse- und traubenförmig bis sternförmig, abhängig von der inhärenten Beschaffenheit der kultivierten Zellen und den verwendeten Kulturbedingungen, wie in Abbildung 4 dargestellt. Etablierte patienteneigene Tumor-Organoid-Kulturen können mit der gleichen Erstlinienbehandlung behandelt werden, die beim Patienten verwendet wird, um zu bestätigen, dass das Tumor-Organoid die klinische Situation (d. h. das klinische Therapieansprechen) rekapituliert1,13,24,25.
Die Tumor-Organoide können auch mit neuartigen pharmakologischen Wirkstoffen behandelt werden, was einen explorativen Ansatz zur Identifizierung neuartiger Therapien bietet, die in nachfolgenden Behandlungslinien in der Klinik eingesetzt werden könnten, wenn die Standardtherapieoptionen ausgeschöpft sind. Die Kultur wird kontinuierlich überwacht, um die Reaktion der Tumororganoidkulturen auf den Wirkstoff in Echtzeit zu beurteilen. Eine Machbarkeitsstudie zur molekularen und immunhistochemischen Charakterisierung von patienteneigenen Xenograft-Tumoren (PDX) und PDX-abgeleiteten Organoiden zeigte, dass die Morphologie, die Proteinexpression und die genomischen Veränderungen zwischen den beiden Modellen vergleichbar waren. Darüber hinaus zeigte eine Proof-of-Concept-Studie zur Pharmakotypisierung, dass die In-vivo- und Ex-vivo-Vorhersagen ebenfalls vergleichbar waren, und kam somit zu dem Schluss, dass die Verwendung von Tumororganoiden als Krebs-/Krankheitsmodell ein praktikabler und robuster Ansatz ist, der im klinischen Umfeld angewendet werden kann2.
Eine Reihe von Herausforderungen im Zusammenhang mit der Etablierung von Tumororganoidkulturen, die von verschiedenen Tumortypen stammen, wurden hier hervorgehoben und kürzlich überprüft26,27,28. Zu den Hauptproblemen gehören die "Kontamination/Überwucherung" durch gesunde Zellen, die Organoide mit einer höheren Wachstumsrate als Krebszellen bilden, die hohen Kosten für die Kulturpflege im Vergleich zu 2D-Kulturen, die geringe Etablierungsrate, Inkonsistenzen im somatischen Mutationsprofil und in der Histologie zwischen der ex vivo Kultur und dem Ursprungstumor, die Heterogenität des Primärtumors, die Verwendung einer extrazellulären Matrix auf Mausbasis, die für menschliche Zellen möglicherweise nicht optimal sind und die Verabreichung von Medikamenten behindern können, das Fehlen der TME und der assoziierten Zellen, die Störung des Ansprechens auf das Arzneimittelansprechen durch Wachstumsfaktoren oder molekulare Inhibitoren und das Fehlen standardisierter und validierter Protokolle für die Etablierung und Aufrechterhaltung von Tumororganoiden. Im Laufe der Jahre hat die Verwendung von Primärtumormodellen in der Krebsforschung jedoch zugenommen, und die Techniken zur Kultivierung und Pflege von Primärkulturen haben sich verbessert. Diese empfindlichen Ex-vivo-Kulturen werden durch Zugabe von Nahrungsergänzungsmitteln zur Förderung des Zellwachstums und der Zellstabilität etabliert und gepflegt. Der Rhokinase-Inhibitor (ROCK) wird heute routinemäßig zu Primärkulturen hinzugefügt, um Apoptose zu vermeiden und die Zell-Zell-Adhäsion zu verbessern, wodurch die langfristige Expansion stabiler primärer In-vitro-Kulturen gefördertwird 29. Darüber hinaus erhöht es auch das Überleben von aufgetauten kryokonservierten Stammzellen, was bei der Erzeugung von gefrorenen Vorräten an Organoidkulturen wichtig ist29. Die Supplementierung mit Heparin kann auch verwendet werden, um die Expansion von Stammzellen zu verbessern, indem die WNT- und FGF-Signalgebung und damit die Zellproliferation erhöhtwird 30. Weitere wichtige Reagenzien, die in diesem validierten Protokoll zur Optimierung der Etablierung von Tumororganoiden verwendet werden, sind Accutase und DNase. Accutase ist ein sanftes Verdauungsreagenz, das empfohlen wird, um einzelne Stammzellen zu trennen oder sie von den Kulturoberflächen zu lösen, und es hilft, die Lebensfähigkeit der Zellen besser zu erhalten als die Verwendung anderer Reagenzien, die für diesen Zweck entwickelt wurden, wie z. B. Trypsin31. Kollagenasen können jedoch auch verwendet werden, um spezifisch auf den Kollagentyp abzuzielen, der in die biologische Basalmembran eingebaut ist. DNase wird seit vielen Jahren in Zellisolationsmethoden eingesetzt32, um DNA-Reste aus toten und nekrotischen Zellen während des Extraktionsprotokolls zu eliminieren und so die Verklumpung/Aggregation von Zellen aufgrund der erhöhten Viskosität der Probenvorbereitung zu verhindern. Zellpellets werden häufig mit Lysepuffer behandelt, aber dieser Schritt kann ausgeschlossen werden, wenn es keine sichtbaren Hinweise auf eine Kontamination der Gewebeprobe mit roten Blutkörperchen gibt8 (Ergänzungsdatei 1).
Die erfolgreiche Etablierung von Tumororganoiden geht nicht ohne inhärente biologische Komplikationen vonstatten. Im Idealfall sollten Gewebe für Tumor-Organoid-Kulturen am selben Tag wie die Ernte verarbeitet werden, um die Zelllebensfähigkeit zu optimieren. Das Einfrieren von Gewebe wird nicht immer empfohlen, da es die Lebensfähigkeit der Zellen erheblich beeinträchtigen kann. Tumororganoide können jedoch unter Verwendung von Proben hergestellt werden, die schockgefroren oder langsam in DMSO-haltigem Gefriermedium33,34 kryokonserviert wurden, was den Probenversand und das Biobanking ermöglicht. In einigen Fällen ist es möglich, 2D-Kulturen aus Tumor-Organoid-Kulturen zu gewinnen, die durch die Rückgewinnung der an den Platten anhaftenden Tumorzellen nach dem Entfernen der Basalmembran-Matrix-Kuppeln mehrfach durchlaufen wurden. Unserer Erfahrung nach ist die Erfolgsrate der Etablierung von Tumororganoiden mit PDX-PDAC-Gewebe viel höher als mit frischem PDAC-Gewebe, das aus einer resezierten Probe gewonnen wurde4. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass in der Regel größere Stücke von frischem PDX-PDAC-Gewebe verfügbar sind und dieses Gewebe eine höhere Zellularität aufweist, was wahrscheinlich auf die gastfreundlichere In-vivo-Umgebung zurückzuführen ist, die das PDX-Modell im Vergleich zu Ex-vivo-basierten Ansätzen bietet. Dem Kulturmedium können ungiftige Wirkstoffe zugesetzt werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferation der Kultur zu überwachen. Darüber hinaus muss das Überwachsen von nicht-neoplastischen Organoiden durch selektive Bedingungen vermiedenwerden 35,36. Bauchspeicheldrüsengewebe kann Verdauungsenzyme enthalten, die die Lebensfähigkeit der isolierten Tumorzellen beeinträchtigen könnten. Daher kann Trypsin dem Verdauungsschritt zugesetzt werden, um dieses Problem zu überwinden4. Viele andere Faktoren, wie z.B. der Status des Patienten/Gewebes (d.h. behandelt oder unbehandelt mit onkologischer Therapie), die Art des Tumors, die Kontamination der Probe aus dem Operationssaal und der ursprüngliche Grad des Tumors, können die Fähigkeit, ein Tumororganoid zu etablieren, ebenfalls erheblich beeinflussen. Ebenso verfügt nicht jedes Gewebe über genügend lebensfähige Tumorzellen, um Primärkulturen zu etablieren. Dies gilt insbesondere für PDAC-Tumoren, die notorisch stromareich sind (ca. 90%-95%) und einen geringen Prozentsatz an epithelialen Tumorzellen enthalten. Darüber hinaus kann es schwierig sein, Gewebe mit einem hohen Stromagehalt zu schneiden und zu dissoziieren, um einzelne Tumorzellen für die Kultur zu erhalten. Spezielle und kommerziell erhältliche Aufschlussmedien können hinzugefügt werden, oder es können auch mechanische Dissoziationsgeräte verwendet werden, wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut ist. Alternativ kann eine gründliche Gewebedissoziation durch kontinuierliches Schneiden mit zwei Skalpellklingen erreicht werden, bis das Gewebe ein halbflüssiges Aussehen hat (siehe Videodemonstration).
Es gibt viele technische Fallstricke während des Verfahrens, die ebenfalls hervorgehoben werden müssen. Zum Beispiel können Gewebereste den Filter verstopfen, und der Filter muss dann gewechselt werden, da die Reste den Durchgang des flüssigen Überstandes behindern. Der Filtrationsschritt kann mehrmals wiederholt werden, um die maximale Menge an dissoziierten Tumorzellen zu gewinnen. Darüber hinaus ist es wichtig, das Zellpellet nach jedem Zentrifugationsschritt zu überprüfen, da es manchmal schwierig ist, eine niedrige Zellzahl zu erkennen. Das Pipettieren der Zellpellets sollte schonend und langsam erfolgen, da aggressives Pipettieren zu einem Verlust von Zellen oder einer Verringerung der Zelllebensfähigkeit führen kann. Darüber hinaus sollten bei der Herstellung des Matrix-Zell-Mixes auf 4 °C vorgekühlte Medien und gekühlte Spitzen verwendet werden, die bei −20 °C gelagert werden, da die Matrix schnell erstarrt. Schließlich trägt DNase, wie bereits erwähnt, dazu bei, das Verklumpen von Zellen während der Probenvorbereitung zu verhindern. Das Aliquotieren der im Protokoll verwendeten Reagenzien und die Herstellung von Wachstumsfaktormischungen werden ebenfalls empfohlen, um das wiederholte Einfrieren und Auftauen der Reagenzien zu vermeiden.
Die Isolierung von primären Fibroblasten ist von Interesse, da sie ein wichtiger Zelltyp in PDAC sind und für nachfolgende Co-Kultur-Experimente verwendet werden können, um die Auswirkungen der TME auf das Tumorzellwachstum zu bestimmen. Nach ca. 1 Woche sind die Fibroblasten aus den Gewebeschnitten gewandert und können in der Regel an den Kulturplatten befestigt und als Monolayer-Kultur wachsen. Das Vorhandensein von Fibroblasten in der Kultur hat jedoch auch Nachteile, da sie die Nährstoffe aus dem Nährmedium verbrauchen und so das optimale Wachstum der Tumororganoide beeinträchtigen. Ultra-Low-Attachment-Platten (ULA-Platten) werden häufig für die Kultivierung von Tumororganoiden empfohlen, um das Wachstum von Fibroblasten zu begrenzen, da sie sich leicht an Standard-Zellkultur-behandelte Platten anheften lassen. Dieses validierte Protokoll empfiehlt die Verwendung von Standard-DMEM-Medien mit 10 % FBS für die Kultivierung von primären Fibroblasten, obwohl auch spezielle Medien für Fibroblasten verwendet werden können.
Es ist wichtig, den Zustand der Tumor-Organoid-Kultur im Laufe der Zeit, insbesondere in der ersten Woche, zu dokumentieren, da sich die Kultur je nach Gewebequalität, -quantität und -quelle (primäre humane resezierbare Tumoren versus PDXs) unterschiedlich verhält. Dem Kulturmedium können ungiftige Wirkstoffe zugesetzt werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferation der Kultur zu überwachen. Die Kulturen müssen in den ersten 7 Tagen täglich und danach zwei- bis dreimal pro Woche visuell überwacht werden. Darüber hinaus muss das Medium alle 4-5 Tage gewechselt werden, wenn es sauer erscheint (gelb erscheint), wobei darauf zu achten ist, dass die Membranmembran-Kuppeln nicht beschädigt werden. Zunächst können aufgrund einer hohen Zelldichte große braune Klumpen entstehen. Diese sollte jedoch nach der ersten Passage verschwinden, so dass klar definierte Tumororganoide auf einem klaren Hintergrund der Basalmembranmatrix erhalten werden können. Es wird empfohlen, vor allem in den ersten 3 Wochen Fotos von den Tumororganoiden zu machen, um den visuellen Phänotyp und die Wachstumsrate der Tumororganoide zu bestimmen. Auch die Passage der Tumor-Organoid-Kultur ist eine technische Herausforderung. Im Allgemeinen wird das Nährmedium entfernt, und die Matrixkuppeln werden bei 4 °C mit Trypsin-basierten oder spezialisierten Reagenzien getrennt, bis sich die Basalmembranmatrix vollständig aufgelöst hat. Das Zellpellet wird dann in frischer Matrix resuspendiert, und das Volumen wird so eingestellt, dass die gewünschte Passage durchgeführt wird, z. B. 1:1 (unter Verwendung des gleichen Matrixvolumens wie beim Original) oder 1:3 (Hinzufügen des dreifachen ursprünglichen Volumens des Ansatzes). Die Gruppe von David Tuveson, die sich aus Experten für Pankreas-Organoide zusammensetzt, stellt Online-Ressourcen mit Protokollen für die Etablierung, Aufrechterhaltung und Färbung von Pankreas-Organoidenzur Verfügung 37.
Aus Patienten gewonnene ex vivo Tumororganoide stellen ein wertvolles präklinisches Modell zur Beurteilung der patientenspezifischen Behandlungssensitivität für die Anwendung in der personalisierten Medizin dar. Darüber hinaus handelt es sich bei diesen Modellen um physiologisch relevantere Tumormodelle im Vergleich zu herkömmlichen 2D-adhärenten Zellmonoschichten. Im Bereich der Tumormodelle ist eine klare und konsistente Nomenklatur von 3D-Tumormodellen mit periodischer fotografischer und deskriptiver Nachverfolgung der Kultur erforderlich. Darüber hinaus ist die Arbeit mit standardisierten Protokollen von größter Bedeutung für den Erfolg dieser Technologie in der Klinik, um die Arzneimittelsensitivität patientenspezifisch zu bestimmen. Forscher, die diese Technologie einsetzen, sollten sich der Hindernisse und Fallstricke dieser empfindlichen und komplexen Modelle bewusst sein. Die Arbeit mit einem validierten Protokoll und klar definierten Bedingungen und Fehlerbehebungsoptionen trägt jedoch dazu bei, technische Probleme zu vermeiden und die Einrichtung und Pflege der Kultur zu optimieren. Hier wird ein validiertes Protokoll zur Etablierung von Tumororganoiden und zur Isolierung von Fibroblasten bereitgestellt, das in vielen translationalen Onkologielaboren mit Standardausrüstung und Erfahrung in Gewebekulturen problemlos implementiert werden kann.
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Disclosures
Nichts.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch die Förderung der Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 857381, Projekt VISION (Strategien zur Stärkung der wissenschaftlichen Exzellenz und Innovationskapazität für die Früherkennung von Magen-Darm-Krebs), Intramurale Ausschreibung für neue Forschungsprojekte für klinische Forscher und aufstrebende Forschungsgruppen IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) und das TRANSCAN II-Projekt JTC 2017 Call "Etablierung eines Algorithmus für die Frühdiagnose und Nachsorge von Patienten mit neuroendokrinen Pankreastumoren (NExT)", Fördernummer 1.1.1.5/ERANET/20/03. Die in diesem Protokoll verwendeten biologischen Proben wurden vom BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) zur Verfügung gestellt und in die Biobanken und Biomodellplattform des ISCIII (PT20/00045) integriert. Wir danken auch Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita und Thorsten Knoll für ihre unschätzbare Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls im Rahmen der Projekte NExT und VISION.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
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