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Cancer Research

ताजे ऊतक से अग्नाशय ी कैंसर-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स और फाइब्रोब्लास्ट ्स की स्थापना

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65229
Automatic Translation
*1,2,3,4, *5, 6, 6, 1,3, 6, 7, 6,8, 6,8, 3, 3, 2,9, 9, 10, 2,7, 11, 1,2, 1,2, 1,2,4, 3,12,13, 2,3,12,13, 3, 6, 1,2,3
1Molecular Epidemiology and Predictive Tumor Markers Group, Area 3, Ramón y Cajal Health Research Institute (IRYCIS), 2The Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC), 3Biobank and Biomodels Platform (PT20/0045), ISCIII research and development platforms in biomedicine and health sciences, BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS, Spanish National Biobanks Network (ISCIII Biobank Register No. B.0000678), Ramón y Cajal Health Research Institute (IRYCIS), 4Faculty of Medicine, University of Alcalá de Henares, 5Institute of Tissue Medicine and Pathology, University of Bern, 6Department of Molecular Oncology, Cancer Research Institute, Biomedical Research Center of the Slovak Academy of Sciences, 7Experimental Oncology, Molecular Oncology Program, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), 8Department of Surgical Oncology, National Cancer Institute, Slovak Medical University, 9Pancreatic and Biliopancreatic Surgery Unit, Hospital Universitario Ramón y Cajal, 10Department of Pathology, Hospital Universitario Ramón y Cajal, 11Department of Radiation Oncology, Hospital Universitario Ramón y Cajal, 12Department of Cancer, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” (IIBM), 13Cancer Stem Cell and Fibroinflammatory Group, Chronic Diseases and Cancer, Area 3, IRYCIS
* These authors contributed equally

Summary

ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स ने कैंसर अनुसंधान और व्यक्तिगत चिकित्सा के दृष्टिकोण में क्रांति ला दी है। वे एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक ट्यूमर मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं जो शोधकर्ताओं को क्लिनिक में ट्यूमर से एक कदम आगे रहने की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल ताजे अग्नाशय ी ट्यूमर ऊतक के नमूनों और अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा मूल के रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स से ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स स्थापित करता है।

Abstract

ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स त्रि-आयामी (3 डी) एक्स विवो ट्यूमर मॉडल हैं जो मूल प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों की जैविक प्रमुख विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करते हैं। रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स का उपयोग ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान में किया गया है और इसे उपचार संवेदनशीलता और प्रतिरोध, सेल-सेल इंटरैक्शन और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ ट्यूमर सेल इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है। ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स जटिल संस्कृति प्रणालियां हैं जिन्हें विशिष्ट विकास कारक कॉकटेल और एक जैविक तहखाने झिल्ली के साथ उन्नत सेल कल्चर तकनीकों और संस्कृति मीडिया की आवश्यकता होती है जो बाह्य वातावरण की नकल करती है। प्राथमिक ट्यूमर संस्कृतियों को स्थापित करने की क्षमता अत्यधिक उत्पत्ति के ऊतक, सेलुलरिटी और ट्यूमर की नैदानिक विशेषताओं पर निर्भर करती है, जैसे कि ट्यूमर ग्रेड। इसके अलावा, ऊतक नमूना संग्रह, सामग्री की गुणवत्ता और मात्रा, साथ ही सही बायोबैंकिंग और भंडारण इस प्रक्रिया के महत्वपूर्ण तत्व हैं। प्रयोगशाला की तकनीकी क्षमताएं भी विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। यहां, हम एक मान्य एसओपी / प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं जो अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा मूल के ताजा ऊतक नमूनों से एक्स विवो ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति के लिए तकनीकी और आर्थिक रूप से संभव है, या तो ताजा प्राथमिक रोगी दाता ऊतक या रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) से। यहां वर्णित तकनीक को बुनियादी ऊतक संस्कृति और माउस सुविधाओं के साथ प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है और ट्रांसलेशनल ऑन्कोलॉजी क्षेत्र में व्यापक अनुप्रयोग के लिए तैयार किया गया है।

Introduction

ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स पूर्व विवो त्रि-आयामी (3 डी) संगठित संस्कृतियां हैं जो ताजा ट्यूमर ऊतक से प्राप्त होती हैं और कैंसर मॉडल प्रदान करती हैं। ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स मूल प्राथमिक ट्यूमर 1,2,3,4 की जैविक प्रमुख विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करते हैं और पारंपरिक अमर सेल लाइनों के समान कई महीनों तक विस्तारित और क्रायोसंरक्षित किया जा सकता है। ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स ट्रांसलेशनल / व्यक्तिगत चिकित्सा5 के लिए रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर मॉडल का एक बायोबैंक प्रदान करते हैं और कैंसर सेल जीव विज्ञान प्रणालियों / मॉडल में एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करते हैं। रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स का उपयोग (नव) सहायक ऑन्कोलॉजिकल / फार्माकोलॉजिकल उपचारों की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने के लिए पूर्व विवो मॉडल के रूप में किया जा सकता है, जिसके लिए संस्कृतियों को ताजा ट्यूमर ऊतक से स्थापित किया जाता है और दवा संवेदनशीलता परख या फार्माकोटाइपिंगको चिकित्सा की बाद की लाइनों के लिए प्रभावी एजेंटों की पहचान करने के लिए रोगी-विशिष्ट आधार पर किया जाता है।. इसके अलावा, ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स प्राथमिक ट्यूमर ऊतक की उपलब्धता की सीमा को दूर करते हैं और, अधिक महत्वपूर्ण बात यह है कि, विवो माउस मॉडल में एक उत्कृष्ट वैकल्पिक या पूरक प्रणाली प्रदान करते हैं, जैसे रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स)2। ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की जटिलता बढ़ जाती है यदि प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं को स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ जोड़ा जाता है जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) में पाए जाते हैं, जैसे कि कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ), एंडोथेलियल कोशिकाएं और प्रतिरक्षा कोशिकाएं, जो प्राथमिक ट्यूमर के कामकाज और जटिल सेलुलरिटी की नकल करती हैं। मानकीकृत प्रोटोकॉल 6,7,8,9,10 का उपयोग करके कई ट्यूमर प्रकारों के लिए ट्यूमर ऑर्गेनोइड स्थापित किए गए हैं। कोलोरेक्टल और स्तन कैंसर ऊतक सहित विभिन्न ठोस ट्यूमर से ऑर्गेनॉइड प्रसार, अच्छी तरह से स्थापित और तकनीकी रूप से सस्ती है 11,12,13,14,15।

सर्जिकल ट्यूमर रिसेक्शन या ट्यूमर बायोप्सी प्राथमिक ट्यूमर ऊतक नमूने प्रदान करते हैं। आदर्श रूप से, ट्यूमर ऊतक के नमूने ट्यूमर द्रव्यमान के केंद्र या ट्यूमर के हमलावर किनारे से आने चाहिए, साथ ही ट्यूमर से सटे सामान्य दिखने वाले ऊतक भी होने चाहिए। पारंपरिक 2 डी संस्कृतियों की तुलना में, ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स को कई "ऐड-ऑन" की आवश्यकता होती है, जिसमें एक जैविक तहखाने झिल्ली (जैसे मैट्रीगेल, हाइड्रोगेल, या कोलेजन-आधारित मचान) शामिल है, जो बाह्य टीएमई की नकल करता है, और एक तरल विकास माध्यम जो विशिष्ट पोषक तत्वों और विकास कारकों की आपूर्ति करता हैऔर संस्कृति में सेल प्रसार और व्यवहार्यता का समर्थन करता है।

प्राथमिक सेल कल्चर में सबसे बुनियादी कदम संदूषण को रोकने के लिए खारे घोल में ऊतक को धोना, यांत्रिक रूप से ट्यूमर को 1-3 मिमी3 के छोटे टुकड़ों में काटना / पचाना, और ऊतक के एंजाइमेटिक पाचन के लिए कोलेजनेस के साथ उपचार करना है। पचे हुए मिश्रण को तब बड़े ऊतक के टुकड़ों को हटाने के लिए फ़िल्टर किया जाता है, मैट्रिगेल जैसे जैविक तहखाने की झिल्ली में फिर से निलंबित किया जाता है, और गैर-लगाव विकास को बढ़ाने के लिए कम-लगाव संस्कृति प्लेटों में गुंबद के रूप में चढ़ाया जाता है। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबदों को तरल संस्कृति माध्यम के साथ कवर किया जाता है और संदूषण से बचने के लिए ग्लूटामाइन और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक किया जाता है, साथ ही ऊतक प्रकार 7,8,9,16,17 के आधार पर विशिष्ट विकास कारकों के साथ। थोक ट्यूमर और टीएमई के भीतर मौजूद अन्य प्रासंगिक कोशिकाओं को भी अलग किया जा सकता है, जैसे कि कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) और प्रतिरक्षा कोशिकाएं। यह तकनीक, जिसकी हाल हीमें समीक्षा की गई है, एक अधिक "यथार्थवादी" ट्यूमर वातावरण में चिकित्सा की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए विभिन्न सेल प्रकारों के साथ सह-संस्कृतियों की स्थापना की अनुमति देता है। इसके अलावा, सेल-सेल इंटरैक्शन और ट्यूमर कोशिकाओं और आसपास के जैविक मैट्रिक्स के घटकों के बीच बातचीत का अध्ययन किया जा सकता है।

बायोप्सी या संरक्षित गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्यूमर ऊतक से ताजा ऊतक का उपयोग करके ट्यूमर ऑर्गेनॉइड स्थापना की सफलता दर लगभग 50% 11 है, और उत्तरार्द्ध से सफलता दर काफी हद तक ऊतक प्रकार और उत्पत्ति4, विशेष रूप से ट्यूमर ग्रेड और समग्र ट्यूमर सेलुलरिटी पर निर्भर है। त्रि-आयामी ट्यूमर मॉडल में अलग-अलग जटिलता होती है, सरल एककोशिकीय समुच्चय से लेकर विभिन्न सेल प्रकारों से युक्त अत्यधिक जटिल इंजीनियर मॉडल तक। साहित्य में 3 डी संस्कृतियों का वर्णन करने के लिए उपयोग की जाने वाली शब्दावली अत्यधिक असंगत 19,20,21 है, क्योंकि विभिन्न शब्दों जैसे स्फेरॉइड, ट्यूमरस्फीयर और ऑर्गेनोइड का उपयोग किया जाता है, हालांकि उनके बीच का अंतर स्पष्ट नहीं है। जैसा कि परिभाषा पर एक स्पष्ट सहमति अभी तक नहीं पहुंची है, इस लेख में, एक ट्यूमर ऑर्गनॉइड को एक जैविक तहखाने झिल्ली में एम्बेडेड एक संगठित ट्यूमर सेल संस्कृति के रूप में वर्णित किया गया है।

यहां, ताजा प्राथमिक या पीडीएक्स-व्युत्पन्न अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) से उत्पन्न ताजा ऊतक नमूनों से ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के लिए एक मान्य प्रोटोकॉल की सूचना दी गई है, और यह प्रोटोकॉल बुनियादी ऊतक संवर्धन सुविधाओं के साथ अधिकांश प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को कई अत्याधुनिक रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया है जो वर्तमान में डेविड ट्यूवसन9, हंस क्लेवर्स8 और ऑरेल पेरेन7 के समूहों से पाचन ट्यूमर ऊतक से ट्यूमर ऑर्गेनोइड ्स या ट्यूमरोइड्स स्थापित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं।

यह प्रोटोकॉल इस बात पर चर्चा नहीं करता है कि ताजा ऊतक कैसे काटा जाता है। उच्च गुणवत्ता वाले ताजा मानव ट्यूमर ऊतक प्राप्त करने के लिए, ऊतक की कटाई करने वाले सर्जनों और पैथोलॉजी विभाग के बीच कुशल समन्वय होना महत्वपूर्ण है जो ऑर्गनॉइड कल्चर के लिए ऊतक का नमूना निकालता है। इसी तरह, एक ताजा ऊतक स्रोत के रूप में पीडीएक्स का उपयोग करते समय, ऊतक के नमूने की कटाई करने वाले व्यक्ति के साथ कुशल समन्वय भी महत्वपूर्ण है। उच्च गुणवत्ता बनाए रखने के लिए ऊतक का नमूना जितनी जल्दी हो सके (कटाई के समय से 30-60 मिनट के भीतर) प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को Universidad Autonoma de Madrid आचार समिति (CEI 103-1958-A337) और La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) द्वारा अनुमोदित प्रयोगात्मक जानवरों के कल्याण के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में किया गया था और जानवरों की देखभाल और उपयोग में नैतिक आचरण के लिए दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था, जैसा कि जानवरों से जुड़े जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए अंतर्राष्ट्रीय मार्गदर्शक सिद्धांतों में कहा गया है। काउंसिल फॉर इंटरनेशनल ऑर्गनाइजेशन ऑफ मेडिकल साइंसेज (CIOMS) द्वारा विकसित। प्रोटोकॉल ने लिखित सूचित सहमति के साथ जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए नैतिक सिद्धांतों का पालन किया। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की स्थापना के लिए ताजा ऊतक के उपयोग के लिए पूर्व नैतिक अनुमोदन प्राप्त किया गया था। नमूने बायोबैंक अस्पताल रेमन वाई काजल-आईआरवाईसीआईएस (बायोबैंक की राष्ट्रीय रजिस्ट्री बी.0000678) द्वारा प्रदान किए गए थे, जो आईएससीIII (पीटी 20/00045) के बायोबैंक और बायोमॉडल प्लेटफॉर्म में एकीकृत थे, और उचित नैतिक अनुमोदन के साथ मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करते हुए संसाधित किए गए थे। ट्यूमर को चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित22 था, 6 सप्ताह की महिला एनयू-फॉक्सएन1एनयू नग्न चूहों ( सामग्री की तालिका देखें) में और पीडीएसी पीडीएक्स स्थापित करने के लिए विवो में पारित किया गया था।

1. प्रायोगिक तैयारी

  1. द्वितीय श्रेणी के जैव सुरक्षा कैबिनेट में मानव नमूने संभालें।
  2. ऊतक-जनित रोगजनकों द्वारा संक्रमण से बचने के लिए पूरी प्रक्रिया में एक प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक दस्ताने और चश्मा पहनें।
    नोट: ताजा ऊतक के नमूने को संसाधित करने और ऑर्गेनोइड ्स और फाइब्रोब्लास्ट ्स को प्लेट करने के लिए न्यूनतम 3 घंटे की आवश्यकता होती है।
  3. कटाई से अधिकतम 24 घंटेके भीतर ताजा ऊतक के नमूनों को संसाधित करें, और प्रसंस्करण तक ऊतक संवर्धन माध्यम (डीएमईएम 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर सभी नमूने और अभिकर्मक रखें, और एक प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-निर्धारित करना सुनिश्चित करें और सेल की तैयारी को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए इसे कम गति से उपयोग करें।
  5. प्रोटोकॉल के दौरान उपयोग करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पी 1,000 और पी 200 पिपेट युक्तियों को स्टोर करें।
  6. उपयोग से पहले तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ( सामग्री की तालिका देखें) का विश्लेषण करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, 250 एमएल एलिकोट की सिफारिश की जाती है।

2. ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स और प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट स्थापित करने के लिए ताजा प्राथमिक ट्यूमर ऊतक को संसाधित करना।

नोट: ताजा ऊतक के नमूने (या तो प्राथमिक मानव बचाव योग्य ट्यूमर या पीडीएक्स) को संसाधित करने और ट्यूमर ऑर्गेनोइड ्स और फाइब्रोब्लास्ट ्स को प्लेट करने के लिए न्यूनतम 3 घंटे की आवश्यकता होती है। ऑर्गनॉइड तैयारी प्रक्रिया की एक रूपरेखा चित्रा 1 में दिखाई गई है, ऊतक पाचन से ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स के चढ़ाना तक। प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का एक एलिकोट निकालें, और उपयोग से पहले इसे लगभग 30-60 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें।

  1. ऑर्गेनोइड्स चढ़ाने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 3 घंटे में 6-वेल कल्चर प्लेट डालें।
  2. उन्नत डीएमईएम-एफ 12 (डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम)/पोषक तत्व मिश्रण एफ -12 हैम (एफ 12), 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 15 एमएम हेप्स, 1% एल-ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 125 एनजी / एमएल एम्फोटेरिसिन बी, 0.1 मिलीग्राम /
  3. ऊतक संवर्धन प्लेट से आकांक्षा द्वारा मीडिया को हटा दें और दो बाँझ ब्लेड और 2 मिलीलीटर पाचन माध्यम (उन्नत डीएमईएम-एफ 12 + 10 मिलीग्राम कोलेजनेस IV / एमएल, 0.000625% ट्रिप्सिन-ईडीटीए, और 10 μg / mL DNase) का उपयोग करके बाँझ ऊतक कल्चर प्लेट में ऊतक को 1 मिमी3 टुकड़ों में काट लें। ऊतक को 50 एमएल ट्यूब में कुल 5 एमएल पाचन मीडिया के साथ इकट्ठा करें और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ यांत्रिक पाचन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें या नमूने के आवधिक मिश्रण के साथ, नमूने को ऊपर और नीचे पाइप करके।
  4. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए उन्नत डीएमईएम-एफ 12 के 5 एमएल जोड़ें, और बड़े मलबे को हटाने के लिए 70 μm पोर छन्नी के माध्यम से नमूने को फ़िल्टर करें।
  5. फिल्टर के शीर्ष पर 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के 2 एमएल जोड़ें, और फाइब्रोब्लास्ट की संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए मलबे और ऊतक अवशेषों को इकट्ठा करें (चरण 5 देखें)।
  6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200-300 x g पर छानना सेंट्रीफ्यूज करें, और केवल सेल गोली छोड़ते हुए सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। उन्नत डीएमईएम-एफ 12 के 5 एमएल जोड़ें, और 300 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. अमोनियम-क्लोराइड पोटेशियम (एसीके, सामग्री की तालिका देखें) लाइसिस बफर के 4 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। मिश्रण को 15 एमएल ट्यूब में पारित करें, और लाल रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस लाल रक्त कोशिका लाइसिस चरण को हटाया जा सकता है जब संदूषण का कोई दृश्य प्रमाण नहीं होता है।
  8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। उन्नत डीएमईएम-एफ 12 के 5 एमएल जोड़ें, और 300 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. सेल गोली में DNase (1 μg / mL) के साथ पूरक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल पृथक्करण अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। उन्नत डीएमईएम-एफ 12 के 5 एमएल जोड़ें, और सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  11. कोशिकाओं को अलग करने के लिए पी 1,000 पिपेट के साथ 30 बार ऊपर और नीचे पिपेट, 300 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  12. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से पी 1,000 और पी 200 पिपेट युक्तियां लें, और पी 1,000 पिपेट और कोल्ड टिप्स (50 μL प्रति बूंद, पेलेट की मात्रा, छह से सात गुंबद प्रति कुएं को ध्यान में रखते हुए) का उपयोग करके झिल्ली मैट्रिक्स में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। इनक्यूबेटर से पहले से गर्म प्लेट निकालें। P200 पिपेट को 48 μL पर सेट करें, और पूर्व-गर्म 6-वेल प्लेट में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के गुंबद बनाने के लिए ठंडे सुझावों का उपयोग करें।
  13. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को ठोस बनाने के लिए 15 मिनट के लिए बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-सेल गुंबद के साथ प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  14. 2-2.5 एमएल उन्नत डीएमईएम-एफ 12 जोड़ें, 20 एनजी / एमएल पुनः संयोजक मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), 100 एनजी / एमएल मानव प्लेसेंटा ग्रोथ फैक्टर (पीएलजीएफ), 10 एनजी / एमएल पुनः संयोजक मानव बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (बीएफजीएफ), 769 एनजी / एमएल इंसुलिन जैसे विकास कारक -1 (आईजीएफ -1), और 10.5 μM रॉक अवरोधक (उन्नत डीएमईएम-एफ 12 + विकास कारक) (सामग्री की तालिका देखें)।

3. ऑर्गेनोइड्स की निगरानी

  1. पहले 7 दिनों के लिए और फिर प्रति सप्ताह तीन बार ट्यूमर ऑर्गेनॉइड कल्चर की निगरानी करें।
  2. 20 एनजी/एमएल रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), 100 एनजी/एमएल ह्यूमन प्लेसेंटा ग्रोथ फैक्टर (पीएलजीएफ), 10 एनजी/एमएल रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ), 769 एनजी/एमएल इंसुलिन जैसे ग्रोथ फैक्टर-1 (आईजीएफ-1), और 10.5 μM रॉक इनहिबिटर (एडवांस्ड डीएमईएम-एफ12 + ग्रोथ फैक्टर्स) युक्त एडवांस्ड डीएमईएम-एफ12 के साथ प्रति सप्ताह दो बार माध्यम बदलें।
  3. नमूना संसाधित करने और विकास और व्यवहार्यता का निरीक्षण करने के लिए मैट्रिक्स में संस्कृति को चढ़ाने के बाद समय-समय पर दिन 1, दिन 3, दिन 7, दिन 10 और दिन 15 पर ट्यूमर ऑर्गेनॉइड कल्चर की छवियों को कैप्चर करें।

4. ऑर्गेनोइड्स का मार्ग और क्रायोस्टोरेज

  1. 6-वेल प्लेट से संस्कृति माध्यम को हटा दें।
  2. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को अलग करने और सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त सेल रिकवरी अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) के 1 एमएल जोड़ें, और 15 एमएल ट्यूब में सुपरनैटेंट को पुनर्प्राप्त करें। यदि मैट्रिक्स तुरंत विघटित नहीं होता है, तो नमूने को 15-20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरी तरह से घुलने तक इनक्यूबेट करें।
  3. अतिरिक्त विघटित कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए चरण 4.2 में उपयोग किए जाने वाले समान सेल रिकवरी अभिकर्मक के 1 एमएल को प्लेट के कुएं में जोड़ें, और सुपरनैटेंट को चरण 4.2 के समान 15 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
  4. 5 एमएल ठंडा उन्नत डीएमईएम-एफ 12 जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सतह पर तैरने वाला को हटा दें, और 5 एमएल पिपेट के साथ किसी भी शेष तरल को हटाकर गोली को सावधानी से सुखाएं; जितना संभव हो ट्यूब को हिलाने से बचें। 1: 2 का मार्ग प्राप्त करने के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की मूल मात्रा से दोगुने में सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
  6. ऑर्गनॉइड संस्कृतियों के क्रायोस्टोरेज के लिए, चरण 4.5 में प्राप्त गोली को 1 एमएल फ्रीजिंग माध्यम (10% डीएमएसओ, 20% एफबीएस, 50% डीएमईएम-एफ 12, 10.5 μM रॉक अवरोधक) में पुन: निलंबित करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स की मात्रा को विभिन्न मार्गों को करने के लिए समायोजित किया जा सकता है, जैसे कि 1: 1 (मूल के समान तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की समान मात्रा का उपयोग करके) या 1: 3 (तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की मूल मात्रा का तीन गुना जोड़ना)।

5. फाइब्रोब्लास्ट ्स की स्थापना

  1. 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम के 2 एमएल में मलबे और ऊतक अवशेषों को पुनर्प्राप्त करने के बाद, इसे 6-वेल प्लेट में जोड़ें, और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. चढ़ाना के 2 दिन या 3 दिन बाद माध्यम की आकांक्षा से चरण 2.5 से फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों से ऊतक अवशेषों को हटा दें, और 10% एफबीएस के साथ ताजा डीएमईएम के साथ बदलें।
  3. प्रति सप्ताह तीन बार फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति की निगरानी करें, और 10% एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम का उपयोग करके प्रति सप्ताह कम से कम दो बार संस्कृति माध्यम को बदलें।

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Representative Results

यह दस्तावेज करना महत्वपूर्ण है कि ट्यूमर ऑर्गेनॉइड कल्चर समय के साथ कैसे प्रगति करता है, विशेष रूप से पहले कुछ हफ्तों में, यह अनुमान लगाने के लिए कि संस्कृति डाउनस्ट्रीम परख में कैसे व्यवहार करेगी। चित्रा 2 15 दिनों की अवधि में ताजा ऊतक से इष्टतम ट्यूमर सेल अलगाव और ट्यूमर ऑर्गेनॉइड स्थापना का एक उदाहरण दिखाता है। कभी-कभी, नमूने में सेल मलबे की एक बड़ी मात्रा होती है, और विकासशील ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स को देखना मुश्किल होता है, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। इसके अलावा, विकासशील ऑर्गेनोइड्स के फेनोटाइप अलग-थलग, गोल ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 4 ए) से लेकर स्फेरॉइड / एग्रीगेट-जैसी संस्कृतियों (चित्रा 4 बी-डी) तक भिन्न हो सकते हैं, और यह ट्यूमर की उत्पत्ति पर निर्भर करता है। फाइब्रोब्लास्ट ठोस ट्यूमर से प्राथमिक ट्यूमर सेल संस्कृति स्थापना का एक सामान्य उप-उत्पाद है, विशेष रूप से उच्च स्ट्रोमा सामग्री वाले, और अक्सर ऑर्गनॉइड संस्कृति को दूषित कर सकते हैं। चित्र 5 दिखाता है कि कैसे ये कोशिकाएं तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबदों से चली गईं और लगभग 7 दिनों के बाद संस्कृति प्लेटों का पालन किया। ये कोशिकाएं संस्कृति माध्यम से पोषक तत्वों का उपभोग करती हैं, इस प्रकार ऑर्गेनोइड्स के इष्टतम विकास से समझौता करती हैं।

प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट को एक पृथक संस्कृति के रूप में प्राप्त किया जा सकता है जब वे ऊतक वर्गों से बाहर निकलते हैं, संस्कृति प्लेटों का पालन करते हैं, और एक मोनो-लेयर संस्कृति के रूप में विकसित होते हैं, जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है। यह प्रोटोकॉल फाइब्रोब्लास्ट की संस्कृति के लिए 10% एफबीएस के साथ मानक डीएमईएम माध्यम का उपयोग करने की सिफारिश करता है। हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट के लिए एक विशेष माध्यम का भी उपयोग किया जा सकता है। अनुयायी फाइब्रोब्लास्ट लगभग 7 दिनों के बाद दिखाई देते हैं (चित्रा 6)।

Figure 1
चित्रा 1: ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स स्थापित करने के लिए ताजा ऊतक के नमूनों को संसाधित करना। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड तैयारी प्रक्रिया की एक रूपरेखा दिखाई गई है, ऊतक पाचन से ऑर्गेनोइड्स की चढ़ाना तक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक ताजा पीडीएसी ट्यूमर से उत्पन्न पीडीएक्स से स्थापित एक ट्यूमर ऑर्गनॉइड संस्कृति। कई दिनों में ट्यूमर ऑर्गेनॉइड कल्चर की प्रगति को दिखाया गया है, जिसमें दिन 1, दिन 3, दिन 7, दिन 10 और दिन 15 पर एक सूक्ष्म विमान में ऑर्गेनोइड की छवियां हैं। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अतिरिक्त सेल मलबे के साथ दिन 2 पर एक गैर-इष्टतम ट्यूमर ऑर्गनॉइड कल्चर के उदाहरण। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न पीडीएसी पीडीएक्स ऊतकों से स्थापित ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स आकार और आकृति विज्ञान में अंतर दिखाते हैं। ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स में (ए) शास्त्रीय गोल फेनोटाइप या (बी-डी) अधिक गोलाकार / कुल प्रकार की उपस्थिति हो सकती है। ऑर्गेनोइड्स का औसत आकार 80 यूएम से 100 यूएम तक होता है, हालांकि कुछ ऑर्गेनोइड 200 यूएम जितना बड़ा हो सकता है। स्केल बार: 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: संस्कृति में 30 दिनों के बाद सीएएफ / फाइब्रोब्लास्ट से दूषित एक गैर-इष्टतम ट्यूमर ऑर्गनॉइड कल्चर (ए-सी) के उदाहरण। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: पचे हुए प्राथमिक ट्यूमर ऊतक के अवशेषों से स्थापित प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों के उदाहरण । (ए) कंफ्लुएंट संस्कृति। (बी) गैर-सामंजस्यपूर्ण संस्कृति। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: ट्यूमर ऑर्गनॉइड कल्चर स्थापना का समस्या निवारण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

फार्माकोलॉजिकल कैंसर उपचारों में प्रमुख प्रगति चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि चरण 1 ऑन्कोलॉजी नैदानिक परीक्षणों में दवाओं के अनुमोदन की संभावना 5.1% है, जो सभी रोग प्रकारोंमें सबसे कम है। मुख्य कारण यह है कि कैंसर बहुत ही विषम है, और इसलिए, रोगी समूह दिए गए उपचार के लिए समान रूप से प्रतिक्रिया नहीं देते हैं, जो इस बात पर प्रकाश डालता है कि अधिक व्यक्तिगत दृष्टिकोण की आवश्यकता है। दो-आयामी (2 डी) संस्कृतियों का उपयोग कई वर्षों से ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान में किया गया है, लेकिन प्राथमिक ट्यूमर में पाए जाने वाले संरचनात्मक 3 डी संगठन की कमी है। इस प्रकार, वे एक दूसरे के साथ या उनके माइक्रोएन्वायरमेंट 3,23 के साथ रोगी चिकित्सा प्रतिक्रियाओं और ट्यूमर सेल संचार को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। सभी 3 डी संस्कृति प्रणालियों का अंतर्निहित मूल सिद्धांत परिवेश के साथ सेलुलर बातचीत को बढ़ावा देना और कोशिकाओं को स्थानिक रूप से प्रासंगिक तरीके से व्यवस्थित करना है, प्राथमिक ट्यूमर (सीटू में) के समान। ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की आकृति विज्ञान सुसंस्कृत कोशिकाओं की अंतर्निहित प्रकृति और उपयोग की जाने वाली संस्कृति स्थितियों के आधार पर गोल, द्रव्यमान और अंगूर की तरह से स्टेलेट तक भिन्न होता है, जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। स्थापित रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों का इलाज रोगी में उपयोग किए जाने वाले उसी प्रथम-पंक्ति उपचार के साथ किया जा सकता है ताकि यह पुष्टि की जा सके कि ट्यूमर ऑर्गेनॉइड नैदानिक स्थिति (यानी, नैदानिक चिकित्सा प्रतिक्रिया) 1,13,24,25 को पुन: उत्पन्न करता है।

ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स का इलाज नए औषधीय एजेंटों के साथ भी किया जा सकता है, जो नए उपचारों की पहचान करने के लिए एक खोजपूर्ण दृष्टिकोण प्रदान करता है जो क्लिनिक में बाद की उपचार लाइनों में उपयोग किए जा सकते हैं जब मानक चिकित्सा विकल्प समाप्त हो गए हैं। वास्तविक समय में एजेंट के लिए ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए संस्कृति की लगातार निगरानी की जाती है। रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट ट्यूमर (पीडीएक्स) और पीडीएक्स-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के आणविक और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल लक्षण वर्णन के एक व्यवहार्यता अध्ययन से पता चला है कि आकृति विज्ञान, प्रोटीन अभिव्यक्ति और जीनोमिक परिवर्तन दो मॉडलों के बीच तुलनीय थे। इसके अलावा, एक फार्माकोटाइपिंग प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन से पता चला है कि विवो और एक्स विवो भविष्यवाणियां भी तुलनीय थीं और इस प्रकार, निष्कर्ष निकाला कि कैंसर / रोग मॉडल के रूप में ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करना एक व्यवहार्य और मजबूत दृष्टिकोण है जिसे नैदानिक सेटिंग2 में लागू किया जा सकता है।

विभिन्न ट्यूमर प्रकारों से उत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की स्थापना से संबंधित चुनौतियों की एक श्रृंखला को यहां उजागर किया गया है और हाल ही में 26,27,28 की समीक्षा की गई है। मुख्य मुद्दों में स्वस्थ कोशिकाओं द्वारा "संदूषण / अतिवृद्धि" शामिल है, जो कैंसर कोशिकाओं की तुलना में उच्च विकास दर के साथ ऑर्गेनोइड बनाते हैं, 2 डी संस्कृतियों की तुलना में संस्कृति रखरखाव की उच्च लागत, कम स्थापना दर, दैहिक उत्परिवर्तन प्रोफ़ाइल और पूर्व विवो संस्कृति और उत्पत्ति के ट्यूमर के बीच हिस्टोलॉजी में विसंगतियां, प्राथमिक ट्यूमर विषमता, मुराइन-आधारित बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग, जो मानव कोशिकाओं के लिए इष्टतम नहीं हो सकता है और दवा वितरण में बाधा डाल सकता है, टीएमई और संबंधित कोशिकाओं की अनुपस्थिति, दवा प्रतिक्रिया के साथ विकास कारकों या आणविक अवरोधकों का हस्तक्षेप, और ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की स्थापना और रखरखाव के लिए मानकीकृत और मान्य प्रोटोकॉल की कमी। हालांकि, वर्षों से, कैंसर अनुसंधान में प्राथमिक ट्यूमर मॉडल का उपयोग बढ़ गया है, और प्राथमिक संस्कृतियों को संस्कृति और बनाए रखने की तकनीकों में सुधार हुआ है। इन नाजुक पूर्व विवो संस्कृतियों को सेल विकास और स्थिरता को बढ़ावा देने के लिए पूरक जोड़कर स्थापित और बनाए रखा जाता है। एपोप्टोसिस से बचने और सेल-सेल आसंजन को बढ़ाने के लिए अब रोकाइनेज इनहिबिटर (रॉक) को नियमित रूप से प्राथमिक संस्कृतियों में जोड़ा जाता है, इस प्रकार स्थिर प्राथमिक इन विट्रो संस्कृतियों के दीर्घकालिक विस्तार को बढ़ावा मिलता है। इसके अलावा, यह पिघले हुए क्रायोसंरक्षित स्टेम कोशिकाओं के अस्तित्व को भी बढ़ाता है, जो ऑर्गेनॉइड संस्कृतियोंके जमे हुए स्टॉक उत्पन्न करते समय महत्वपूर्ण है। हेपरिन के साथ पूरक का उपयोग डब्ल्यूएनटी और एफजीएफ सिग्नलिंग को बढ़ाकर स्टेम कोशिकाओं के विस्तार को बढ़ाने के लिए भी किया जा सकता है और इस प्रकार, सेल प्रसार30। ट्यूमर ऑर्गेनॉइड स्थापना को अनुकूलित करने के लिए इस मान्य प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अन्य महत्वपूर्ण अभिकर्मकों में एक्यूटेस और डीनेस शामिल हैं। Accutase एक सौम्य पाचन अभिकर्मक है जो व्यक्तिगत स्टेम कोशिकाओं को अलग करने या उन्हें संस्कृति सतहों से अलग करने की सिफारिश करता है, और यह इस उद्देश्य के लिए डिज़ाइन किए गए अन्य अभिकर्मकों का उपयोग करने से बेहतर सेल व्यवहार्यता बनाए रखने में मदद करता है, जैसे कि ट्रिप्सिन31। हालांकि, कोलेजनेज का उपयोग विशेष रूप से जैविक तहखाने झिल्ली में शामिल कोलेजन प्रकार को लक्षित करने के लिए भी किया जा सकता है। निष्कर्षण प्रोटोकॉल के दौरान मृत और नेक्रोटिक कोशिकाओं से डीएनए अवशेषों को खत्म करने के लिए कई वर्षों से सेल अलगाव विधियों में DNase का उपयोग किया गया है और इस प्रकार, नमूना तैयारी की बढ़ी हुई चिपचिपाहट के कारण कोशिकाओं के झुरमुट / एकत्रीकरणको रोकता है। सेल छर्रों को अक्सर लाइसिस बफर के साथ इलाज किया जाता है, लेकिन इस कदम को बाहर रखा जा सकता है जब ऊतक के नमूने8 (पूरक फ़ाइल 1) के लाल रक्त कोशिका संदूषण का कोई दृश्य प्रमाण नहीं होता है।

ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की सफल स्थापना अंतर्निहित जैविक जटिलताओं के बिना नहीं आती है। आदर्श रूप से, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के लिए ऊतकों को सेल व्यवहार्यता को अनुकूलित करने के लिए कटाई के दिन ही संसाधित किया जाना चाहिए। ऊतकों के ठंड की हमेशा सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह सेल व्यवहार्यता को काफी कम कर सकता है। हालांकि, ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स को उन नमूनों का उपयोग करके स्थापित किया जा सकता है जो डीएमएसओ युक्त फ्रीजिंग माध्यम33,34 में फ्लैश-जमे हुए या धीरे-धीरे क्रायोसंरक्षित किए गए हैं, जो नमूना शिपमेंट और बायोबैंकिंग की अनुमति देता है। कुछ मामलों में, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों से 2 डी संस्कृतियों को प्राप्त करना संभव है जो तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबदों को हटाने के बाद प्लेटों से जुड़ी ट्यूमर कोशिकाओं की वसूली से कई बार पारित हुए हैं। हमारे अनुभव में, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड स्थापना की सफलता दर पीडीएक्स पीडीएसी ऊतक के साथ एक संरक्षित नमूना4 से प्राप्त ताजा पीडीएसी ऊतक की तुलना में बहुत अधिक है। यह इस तथ्य के कारण है कि ताजा पीडीएक्स पीडीएसी ऊतक के बड़े टुकड़े आमतौर पर उपलब्ध होते हैं, और इस ऊतक में उच्च सेलुलरता होती है, संभवतः पूर्व विवो-आधारित दृष्टिकोणों की तुलना में पीडीएक्स मॉडल द्वारा प्रदान किए गए विवो वातावरण में अधिक मेहमाननवाज के कारण। सेल व्यवहार्यता और संस्कृति के प्रसार की निगरानी के लिए गैर-विषाक्त एजेंटों को संस्कृति माध्यम में जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, गैर-नियोप्लास्टिक ऑर्गेनोइड्स के अतिवृद्धि को चयनात्मक स्थितियों35,36 का उपयोग करके टाला जाना चाहिए। अग्न्याशय ऊतक में पाचन एंजाइम हो सकते हैं जो पृथक ट्यूमर कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं; इस प्रकार, ट्रिप्सिन को इस समस्या को दूर करने के लिए पाचन चरण में जोड़ा जा सकताहै। ऊतक की स्थिति (यानी, ऑन्कोलॉजिकल थेरेपी के साथ इलाज या अनुपचारित), ट्यूमर का प्रकार, ऑपरेटिंग रूम से नमूने का संदूषण, और ट्यूमर का मूल ग्रेड जैसे कई अन्य कारक भी ट्यूमर ऑर्गेनॉइड स्थापित करने की क्षमता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकते हैं। इसी तरह, प्रत्येक ऊतक में प्राथमिक संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए पर्याप्त व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाएं नहीं होती हैं। यह पीडीएसी ट्यूमर के लिए विशेष रूप से सच है, जो कुख्यात स्ट्रोमा-समृद्ध (लगभग 90% -95%) हैं और उपकला ट्यूमर कोशिकाओं का एक छोटा प्रतिशत है। इसके अलावा, उच्च स्ट्रोमा सामग्री वाले ऊतकों को संस्कृति के लिए एकल ट्यूमर कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए काटना और अलग करना मुश्किल हो सकता है। विशेष और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पाचन मीडिया को जोड़ा जा सकता है, या यांत्रिक पृथक्करण उपकरण का भी उपयोग किया जा सकता है यदि ऊतक पूरी तरह से पच नहीं रहा है। वैकल्पिक रूप से, दो स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके निरंतर काटने से एक संपूर्ण ऊतक पृथक्करण प्राप्त किया जा सकता है जब तक कि ऊतक में अर्ध-तरल उपस्थिति न हो (वीडियो प्रदर्शन देखें)।

प्रक्रिया के दौरान कई तकनीकी नुकसान हैं जिन्हें भी उजागर किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, ऊतक अवशेष फ़िल्टर को अवरुद्ध कर सकते हैं, और फ़िल्टर को तब बदला जाना चाहिए, क्योंकि अवशेष तरल सतह पर तैरने वाले के पारित होने में बाधा डालते हैं। विघटित ट्यूमर कोशिकाओं की अधिकतम मात्रा को पुनर्प्राप्त करने के लिए निस्पंदन चरण को कई बार दोहराया जा सकता है। इसके अलावा, प्रत्येक सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के बाद सेल गोली की जांच करना महत्वपूर्ण है क्योंकि कभी-कभी यह देखना मुश्किल होता है कि कम सेल संख्या कब है। सेल छर्रों की पाइपिंग को धीरे-धीरे और धीरे-धीरे किया जाना चाहिए, क्योंकि आक्रामक पाइपिंग के परिणामस्वरूप कोशिकाओं का नुकसान हो सकता है या सेल व्यवहार्यता में कमी हो सकती है। इसके अलावा, मैट्रिक्स-सेल मिश्रण तैयार करते समय, मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस तक प्रीकूल्ड किया जाता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्रशीतित युक्तियों का उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि मैट्रिक्स जल्दी से जम जाता है। अंत में, और जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, DNase नमूना तैयारी के दौरान कोशिकाओं के झुरमुट को रोकने में मदद करता है। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों को उद्धृत करना और अभिकर्मकों के दोहराव वाले फ्रीज-पिघलने से बचने के लिए विकास कारक मिश्रण तैयार करने की भी सिफारिश की जाती है।

प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव रुचि का है, क्योंकि वे पीडीएसी में एक महत्वपूर्ण सेल प्रकार हैं और ट्यूमर सेल के विकास पर टीएमई के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए बाद के सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है। लगभग 1 सप्ताह के बाद, फाइब्रोब्लास्ट ऊतक वर्गों से बाहर चले गए हैं और आमतौर पर संस्कृति प्लेटों से जुड़े हुए और एक मोनोलेयर संस्कृति के रूप में बढ़ते हुए देखे जा सकते हैं। हालांकि, संस्कृति में फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति के नुकसान भी हैं, क्योंकि वे संस्कृति माध्यम से पोषक तत्वों का उपभोग करते हैं और इस प्रकार, ट्यूमर ऑर्गेनोइड ्स के इष्टतम विकास से समझौता करते हैं। फाइब्रोब्लास्ट विकास को सीमित करने के लिए ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स के संवर्धन के लिए अल्ट्रा-लो अटैचमेंट (यूएलए) प्लेटों की अक्सर सिफारिश की जाती है, क्योंकि वे आसानी से मानक सेल कल्चर-उपचारित प्लेटों से जुड़ जाते हैं। यह मान्य प्रोटोकॉल प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट की संस्कृति के लिए 10% एफबीएस के साथ मानक डीएमईएम मीडिया के उपयोग की सिफारिश करता है, हालांकि फाइब्रोब्लास्ट के लिए विशेष मीडिया का भी उपयोग किया जा सकता है।

समय के साथ ट्यूमर ऑर्गनॉइड कल्चर की स्थिति का दस्तावेजीकरण करना महत्वपूर्ण है, खासकर पहले सप्ताह के दौरान, क्योंकि संस्कृति ऊतक की गुणवत्ता, मात्रा और स्रोत (प्राथमिक मानव बचाव योग्य ट्यूमर बनाम पीडीएक्स) के आधार पर अलग-अलग व्यवहार करती है। सेल व्यवहार्यता और संस्कृति के प्रसार की निगरानी के लिए गैर-विषाक्त एजेंटों को संस्कृति माध्यम में जोड़ा जा सकता है। संस्कृतियों को पहले 7 दिनों के दौरान दैनिक रूप से और फिर प्रति सप्ताह दो से तीन बार नेत्रहीन निगरानी की जानी चाहिए। इसके अलावा, माध्यम को हर 4-5 दिनों में या जब यह अम्लीय दिखाई देता है (पीला दिखाई देता है) बदलना चाहिए, तो तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबदों को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखें। सबसे पहले, उच्च कोशिका घनत्व के कारण बड़े भूरे रंग के झुरमुट दिखाई दे सकते हैं। हालांकि, यह पहले मार्ग के बाद गायब हो जाना चाहिए, इस प्रकार तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की स्पष्ट पृष्ठभूमि पर स्पष्ट रूप से परिभाषित ट्यूमर ऑर्गेनोइड प्राप्त करने की अनुमति देता है। ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स की तस्वीरें लेने की सिफारिश की जाती है, खासकर पहले 3 हफ्तों के दौरान, ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स के दृश्य फेनोटाइप और विकास दर को निर्धारित करने के लिए। ट्यूमर ऑर्गनॉइड कल्चर का पारित होना भी एक तकनीकी चुनौती है। आम तौर पर, संस्कृति माध्यम को हटा दिया जाता है, और मैट्रिक्स गुंबदों को 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्रिप्सिन-आधारित या विशेष अभिकर्मकों के साथ अलग कर दिया जाता है जब तक कि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पूरी तरह से भंग नहीं हो जाता। सेल गोली को फिर से ताजा मैट्रिक्स में पुन: निलंबित कर दिया जाता है, और वॉल्यूम को वांछित मार्ग करने के लिए समायोजित किया जाता है, जैसे कि 1: 1 (मूल के समान मैट्रिक्स वॉल्यूम का उपयोग करके) या 1: 3 (दृष्टिकोण के मूल वॉल्यूम का तीन गुना जोड़ना)। डेविड ट्यूवसन का समूह, जिसमें अग्नाशय ी ऑर्गेनोइड्स के विशेषज्ञ शामिल हैं, अग्नाशय ी ऑर्गेनोइड्स37 को स्थापित करने, बनाए रखने और धुंधला करने के लिए प्रोटोकॉल के साथ ऑनलाइन संसाधन प्रदान करता है।

रोगी-व्युत्पन्न पूर्व विवो ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स व्यक्तिगत चिकित्सा में आवेदन के लिए रोगी-विशिष्ट उपचार संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान प्रीक्लिनिकल मॉडल प्रदान करते हैं। इसके अलावा, ये मॉडल पारंपरिक 2 डी अनुयायी सेल मोनोलेयर की तुलना में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक ट्यूमर मॉडल हैं। ट्यूमर मॉडल क्षेत्र में संस्कृति के आवधिक फोटोग्राफिक और वर्णनात्मक अनुवर्ती के साथ 3 डी ट्यूमर मॉडल का एक स्पष्ट और सुसंगत नामकरण आवश्यक है। इसके अलावा, रोगी-विशिष्ट आधार पर दवा संवेदनशीलता निर्धारित करने में क्लिनिक में इस तकनीक की सफलता के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल के साथ काम करना अत्यंत महत्वपूर्ण है। इस तकनीक का उपयोग करने वाले शोधकर्ताओं को इन संवेदनशील और जटिल मॉडलों की बाधाओं और नुकसान के बारे में पता होना चाहिए। हालांकि, एक मान्य प्रोटोकॉल और स्पष्ट रूप से परिभाषित शर्तों और समस्या निवारण विकल्पों के साथ काम करना तकनीकी मुद्दों से बचने और संस्कृति की स्थापना और रखरखाव को अनुकूलित करने में सहायता करेगा। यहां, ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स स्थापित करने और फाइब्रोब्लास्ट ्स को अलग करने के लिए एक मान्य प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है जिसे मानक उपकरण और ऊतक संस्कृति अनुभव के साथ कई ट्रांसलेशनल ऑन्कोलॉजी प्रयोगशालाओं में आसानी से लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को प्लाटाफॉर्मा बायोबैंकोस वाई बायोमॉडेलोस - यूनिडाड्स डी लास प्लाटाफॉर्मस आईएससीIII डी एपोयो अला आई + डी + आई एन बायोमेडिसिना वाई सिएनसियास डी ला सालुद (पीटी 20/00045), यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से अनुदान समझौते संख्या 857381, परियोजना विजन (गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर के प्रारंभिक निदान के लिए वैज्ञानिक उत्कृष्टता और नवाचार क्षमता को मजबूत करने के लिए रणनीतियों) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। नैदानिक शोधकर्ताओं और उभरते अनुसंधान समूहों आईआरवाईसीआईएस (2021/0446), रोगी व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स 2.0 प्रोजेक्ट (सीआईबेरोएनसी) और ट्रांसकैन II परियोजना जेटीसी 2017 के लिए नई शोध परियोजनाओं के लिए इंट्राम्यूरल कॉल "अग्नाशयी न्यूरोएंडोक्राइन ट्यूमर (एनईएक्सटी) के रोगियों के प्रारंभिक निदान और अनुवर्ती के लिए एक एल्गोरिदम की स्थापना", अनुदान संख्या 1.1.1.5 / ईआरएनईटी / इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए जैविक नमूने बायोबैंक अस्पताल रेमन वाई कैजल-आईआरवाईसीआईएस (बी.0000678) द्वारा प्रदान किए गए थे और आईएससीIII (पीटी 20/00045) के बायोबैंक और बायोमॉडल प्लेटफॉर्म में एकीकृत किए गए थे। हम इस प्रोटोकॉल को नेक्सटी और विजन परियोजनाओं के हिस्से के रूप में विकसित करने के लिए अपने अमूल्य समर्थन के लिए यवोन कोल, अगापी काटाकी वीटा रोविटा और थोर्स्टन नोल को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well Costar Ultra-low Attachment plates Biofil TCP011006
70 μm pore strainer VWR 732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer Gibco A10492-01
Amphotericin B Gibco 15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) Nuaire NU-4750E
Cell recovery solution Corning  354253
Collagenase IV Gibco 17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES Gibco 31330-038
DNase Roche 10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-079-CV
Freezing container, Nalgene Merck C1562
gentleMACS Octo Dissociator Milteny Biotec 130-096-427
HEPES Gibco 15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF) enQuireBio QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice Janvier, France 
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) Invitrogen RP10931
L-Glutamine Corning 354235
Matrigel Basement Membrane Matrix  Corning 356234
Normocin InvivoGen ant-nr-2
Pasteur pipettes Deltalab 200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x) Corning 30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Gibco PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Gibco PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL 72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501
Surgical Blades Nahita FMB018
Trypsin Gibco 25300054

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References

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