Summary
종양 오가노이드는 암 연구와 개인 맞춤형 의학에 대한 접근 방식에 혁명을 일으켰습니다. 이는 임상적으로 관련성이 높은 종양 모델을 나타내며 이를 통해 연구자들은 임상에서 종양보다 한 발 앞서 나갈 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 췌장 종양 조직 샘플과 췌장 선암 기원의 환자 유래 이종이식에서 종양 오가노이드를 확립합니다.
Abstract
종양 오가노이드는 원래 원발성 종양 조직의 생물학적 주요 특징을 요약한 3차원(3D) 생체 외 종양 모델입니다. 환자 유래 종양 오가노이드는 중개 암 연구에 사용되어 왔으며 치료 민감도 및 내성, 세포 간 상호 작용 및 종양 미세환경과의 종양 세포 상호 작용을 평가하는 데 적용할 수 있습니다. 종양 오가노이드는 고급 세포 배양 기술과 특정 성장 인자 칵테일을 갖춘 배양 배지 및 세포 외 환경을 모방하는 생물학적 기저막이 필요한 복잡한 배양 시스템입니다. 원발성 종양 배양을 확립하는 능력은 기원 조직, 세포성 및 종양 등급과 같은 종양의 임상적 특징에 크게 좌우됩니다. 또한 조직 샘플 수집, 재료 품질 및 수량, 올바른 바이오뱅킹 및 보관은 이 절차의 중요한 요소입니다. 실험실의 기술적 역량도 고려해야 할 중요한 요소입니다. 여기에서는 췌장 선암 기원의 신선한 조직 샘플에서 새로운 1차 절제 환자 기증자 조직 또는 환자 유래 이종이식(PDX)에서 생체 외 종양 오가노이드를 배양하는 데 기술적으로나 경제적으로 실현 가능한 검증된 SOP/프로토콜을 보고합니다. 본원에 기술된 기술은 기본적인 조직 배양 및 마우스 시설을 갖춘 실험실에서 수행될 수 있으며, 중개 종양학 분야의 광범위한 응용을 위해 맞춤화되어 있다.
Introduction
종양 오가노이드는 신선한 종양 조직에서 유래하고 암 모델을 제공하는 체외 3차원(3D) 조직 배양물입니다. 종양 오가노이드는 원래 원발성 종양 1,2,3,4의 생물학적 주요 특징을 요약하고 기존의 불멸화된 세포주와 유사하게 최대 몇 개월 동안 증식하고 동결 보존할 수 있습니다. 종양 오가노이드는중개/개인 맞춤형 의학을 위한 환자 유래 종양 모델의 바이오뱅크를 제공하며5 암세포 생물학 시스템/모델의 중요한 발전을 나타냅니다. 환자 유래 종양 오가노이드는 (신)보조 종양학적/약리학적 요법의 효능을 예측하기 위한 생체 외 모델로 사용할 수 있으며, 이를 위해 신선한 종양 조직에서 배양이 확립되고 약물에 대한 민감성 분석 또는 약물형 분석이 환자별로 수행되어 후속 치료 라인에 효과적인 약제를 식별할 수 있습니다 1,4. 또한 종양 오가노이드는 원발성 종양 조직의 가용성 한계를 극복하고, 더 중요한 것은 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 생체 내 마우스 모델에 대한 우수한 대안 또는 보완 시스템을 제공한다는 것입니다2. 원발성 종양 세포가 원발성 종양의 기능과 복잡한 세포성을 모방하는 암 관련 섬유아세포(CAF), 내피세포, 면역세포와 같은 종양미세환경(TME)에서 발견되는 기질 세포와 결합하면 종양 오가노이드의 복잡성이 증가합니다. 종양 오가노이드는 표준화된 프로토콜 6,7,8,9,10을 사용하여 많은 종양 유형에 대해 확립되었습니다. 대장암 및 유방암 조직을 포함한 다양한 고형 종양으로부터의 오가노이드 증식은 잘 확립되어 있으며 기술적으로 저렴합니다 11,12,13,14,15.
외과적 종양 절제 또는 종양 생검은 원발성 종양 조직 표본을 제공합니다. 이상적으로 종양 조직 표본은 종양 덩어리의 중심 또는 종양의 침범 가장자리뿐만 아니라 종양에 인접한 정상으로 보이는 조직에서 가져와야 합니다. 기존의 2D 배양과 비교했을 때, 종양 오가노이드는 세포외 TME를 모방하는 생물학적 기저막(Matrigel, 하이드로겔 또는 콜라겐 기반 스캐폴드)과 특정 영양소 및 성장 인자를 공급하고 배양에서 세포 증식과 생존력을 지원하는 액체 성장 배지를 포함한 몇 가지 "애드온"이 필요합니다16.
일차 세포 배양의 가장 기본적인 단계는 오염을 방지하기 위해 식염수로 조직을 세척하고, 종양을 기계적으로 1-3mm3의 작은 조각으로 절단/소화하고, 조직의 효소 분해를 위해 콜라겐분해효소로 처리하는 것입니다. 그런 다음 분해된 혼합물을 여과하여 큰 조직 조각을 제거하고, Matrigel과 같은 생물학적 기저막에 재현탁하고, 비부착 성장을 향상시키기 위해 저부착 배양 플레이트에서 돔으로 도금합니다. 기저막 매트릭스 돔은 액체 배양 배지로 덮여 있고 오염을 방지하기 위해 글루타민과 항생제로 보충되며 조직 유형에 따라 특정 성장 인자 7,8,9,16,17이 보충됩니다. 벌크 종양 및 TME 내에 존재하는 다른 관련 세포, 예를 들어 암 관련 섬유아세포(CAF) 및 면역 세포도 분리할 수 있습니다. 최근 검토된이 기술은 18 보다 "현실적인" 종양 환경에서 치료에 대한 반응을 연구하기 위해 다양한 세포 유형을 가진 공동 배양을 확립할 수 있습니다. 또한 세포 간 상호 작용 및 종양 세포와 주변 생물학적 매트릭스 구성 요소 간의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.
생검 또는 절제된 위장관 종양 조직을 통해 신선한 조직을 이용한 종양 오가노이드 확립의 보고된 성공률은 약 50%11이며, 후자의 성공률은 조직 유형및 기원4, 특히 종양 등급과 전반적인 종양 세포성에 따라 크게 달라진다. 3차원 종양 모델은 단순한 단세포 응집체에서 다양한 세포 유형으로 구성된 매우 복잡한 엔지니어링 모델에 이르기까지 다양한 복잡성을 가지고 있습니다. 문헌에서 3D 배양을 설명하는 데 사용되는 용어는 스페로이드, 종양구 및 오가노이드와 같은 다른 용어가 사용되기 때문에 매우 일관성이 없습니다 19,20,21 정의에 대한 명확한 합의가 아직 이루어지지 않았기 때문에 이 논문에서는 종양 오가노이드를 생물학적 기저막에 내장된 조직화된 종양 세포 배양으로 설명합니다.
본 연구에서는 신선한 1차 절제 또는 PDX 유래 췌관 선암(PDAC)에서 유래한 신선한 조직 샘플로부터 종양 오가노이드를 확립하기 위해 검증된 프로토콜이 보고되며, 이 프로토콜은 기본적인 조직 배양 시설을 갖춘 대부분의 실험실에서 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 David Tuveson9, Hans Clevers8 및 Aurel Perren7 그룹의 소화 종양 조직에서 종양 오가노이드 또는 튜머로이드를 확립하는 데 현재 사용되는 여러 최첨단 보고 프로토콜에서 채택되었습니다.
이 프로토콜은 신선한 조직을 수확하는 방법에 대해 설명하지 않습니다. 고품질의 신선한 인간 종양 조직을 얻기 위해서는 조직을 채취하는 외과의와 오가노이드 배양을 위해 조직 샘플을 추출하는 병리과 간의 효율적인 조정이 중요합니다. 마찬가지로, PDX를 신선한 조직 공급원으로 사용할 때는 조직 샘플을 채취하는 사람과의 효율적인 조정도 중요합니다. 고품질을 유지하기 위해서는 가능한 한 빨리(채취 후 30-60분 이내) 조직 샘플을 얻는 것이 중요합니다.
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Protocol
모든 절차는 Universidad Autónoma de Madrid 윤리 위원회(CEI 103-1958-A337) 및 La Comunidad de Madrid(PROEX 294/19)에서 승인한 실험 동물의 복지를 위한 제도적 지침과 동물과 관련된 생물의학 연구를 위한 국제 지침 지침에 명시된 동물 관리 및 사용의 윤리적 행동 지침에 따라 수행되었습니다. 국제의학기구협의회(CIOMS)에서 개발했습니다. 이 프로토콜은 서면 동의서와 함께 생물 의학 연구에 대한 윤리 원칙을 따랐습니다. 종양 오가노이드 배양 확립을 위한 신선한 조직의 사용에 대한 사전 윤리적 승인을 획득했습니다. 샘플은 BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS(National Registry of Biobanks B.0000678)에서 제공했으며, ISCIII(PT20/00045)의 Biobanks and Biomodels Platform에 통합되었으며 적절한 윤리적 승인과 함께 표준 운영 절차에 따라 처리되었습니다. 종양은, 앞서 기술한 바와 같이,22, 면역력이 저하된 6주령의 암컷 NU-Foxn1nu 누드 마우스( 재료표 참조)에 피하 이식하고, PDAC PDX를 확립하기 위해 생체내에서 통과시켰다.
1. 실험 준비
- 2등급 생물안전 작업대에서 인체 검체를 취급합니다.
- 조직 매개 병원체에 의한 감염을 피하기 위해 절차 내내 실험실 가운, 보호 장갑 및 안경을 착용하십시오.
참고: 신선한 조직 샘플을 처리하고 오가노이드 및 섬유아세포를 도금하는 데 최소 3시간이 필요합니다. - 신선한 조직 샘플 22를 수확 후 최대24 시간 이내에 처리하고, 처리할 때까지 조직 배양 배지(10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM)에서 4°C에서 보관합니다.
- 전체 절차 동안 모든 샘플과 시약을 얼음 위에 보관하고 냉장 원심분리기를 4°C로 사전 설정하고 세포 준비의 손상을 방지하기 위해 저속으로 사용하십시오.
- P1,000 및 P200 피펫 팁을 -20°C 냉동고에 보관하여 프로토콜 중에 사용하십시오.
- 사용하기 전에 기저막 매트릭스( 재료 표 참조)를 분취하십시오. 이 프로토콜의 경우 250mL 부분 표본이 권장됩니다.
2. 종양 오가노이드 및 일차 섬유아세포를 확립하기 위한 새로운 일차 종양 조직 처리
참고: 신선한 조직 샘플(원발성 인간 절제 가능한 종양 또는 PDX)을 처리하고 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 도금하는 데 최소 3시간이 필요합니다. 조직 분해에서 종양 오가노이드의 도금에 이르는 오가노이드 준비 과정의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 프로토콜을 시작하기 전에 -20°C 냉동고에서 기저막 매트릭스의 부분 표본을 꺼내 사용하기 전에 약 30-60분 동안 얼음 위에 두십시오.
- 오가노이드를 플레이팅하기 3시간 전에 37°C 세포 배양 인큐베이터에 6웰 배양 플레이트를 넣습니다.
- 3mL의 Advanced DMEM-F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)/Nutrient Mixture F-12 Ham(F12), 5% 소 태아 혈청(FBS), 15mM Hepes, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 125ng/mL 암포테리신 B, 0.1mg/mL 노르모신)(재료 표 참조)로 조직을 측정, 사진 촬영 및 세척(단계 1.3)한 다음 위아래로 피펫팅하여 3mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.
- 조직 배양 플레이트에서 흡인에 의해 배지를 제거하고 2개의 멸균 블레이드와 2mL의 분해 배지(고급 DMEM-F12 + 10mg 콜라겐분해효소 IV/mL, 0.000625% 트립신-EDTA 및 10μg/mL DNase)를 사용하여 멸균 조직 배양 플레이트에서 조직을1mm 3조각으로 자릅니다. 총 5mL의 분해 배지가 있는 50mL 튜브에 조직을 수집하고 시중에서 판매되는 장비( 재료 표 참조)를 사용하여 기계적 분해를 사용하거나 샘플을 위아래로 피펫팅하여 주기적으로 혼합하여 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 5mL의 Advanced DMEM-F12를 추가하여 트립신을 비활성화하고 70μm 공극 스트레이너를 통해 샘플을 여과하여 큰 파편을 제거합니다.
- 필터 상단에 10% FBS가 포함된 DMEM 2mL를 추가하고 파편과 조직 잔여물을 수집하여 섬유아세포 배양을 설정합니다(5단계 참조).
- 실온에서 200-300 x g 에서 5분 동안 여과액을 원심분리하고 상층액을 흡인하고 세포 펠릿만 남깁니다. Advanced DMEM-F12 5mL를 넣고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 펠릿을 4mL의 염화암모늄-염화물 칼륨(ACK, 재료 표 참조) 용해 완충액에 재현탁시킵니다. 혼합물을 15mL 튜브에 넣고 실온에서 2분 동안 배양하여 적혈구를 용해합니다.
알림: 이 적혈구 용해 단계는 눈에 띄는 오염의 증거가 없을 때 제거할 수 있습니다. - 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡입합니다. Advanced DMEM-F12 5mL를 넣고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- DNase(1μg/mL)가 보충된 시판되는 세포 해리 시약 1mL( 재료 표 참조)를 세포 펠릿에 추가하고 실온에서 2-3분 동안 배양합니다.
- 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡입합니다. Advanced DMEM-F12 5mL를 첨가하고 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
- P1,000 피펫으로 피펫을 30회 위아래로 움직여 세포를 해리하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.
- -20°C 냉동고에서 P1,000 및 P200 피펫 팁을 꺼내 P1,000 피펫과 콜드 팁(펠릿 부피를 고려한 방울당 50μL, 웰당 6-7개의 돔)을 사용하여 세포 펠릿을 멤브레인 매트릭스에 재현탁시킵니다. 인큐베이터에서 이전에 가열된 플레이트를 꺼냅니다. P200 피펫을 48 μL로 설정하고 콜드 팁을 사용하여 예열된 6웰 플레이트에 기저막 매트릭스의 돔을 만듭니다.
- 기저막 매트릭스-셀 돔이 있는 플레이트를 37°C 5%CO2 인큐베이터에 15분 동안 넣어 기저막 매트릭스를 응고시킵니다.
- 20ng/mL 재조합 인간 표피 성장 인자(EGF), 100ng/mL 인간 태반 성장 인자(PlGF), 10ng/mL 재조합 인간 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 769ng/mL 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1) 및 10.5μM ROCK 억제제(고급 DMEM-F12 + 성장 인자)가 보충된 2-2.5mL의 Advanced DMEM-F12를 추가합니다( 자료표 참조).
3. 오가노이드 모니터링
- 처음 7일 동안은 종양 오가노이드 배양을 육안으로 모니터링한 후 일주일에 세 번 모니터링합니다.
- 20ng/mL 재조합 인간 표피 성장 인자(EGF), 100ng/mL 인간 태반 성장 인자(PlGF), 10ng/mL 재조합 인간 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 769ng/mL 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1) 및 10.5μM ROCK 억제제(고급 DMEM-F12 + 성장 인자)를 함유한 Advanced DMEM-F12로 일주일에 두 번 배지를 교체합니다.
- 샘플을 처리하고 매트릭스에 배양물을 도금한 후 1일, 3일, 7일, 10일, 15일에 주기적으로 종양 오가노이드 배양 이미지를 캡처하여 성장과 생존율을 관찰합니다.
4. 오가노이드의 통과 및 냉동 보관
- 6웰 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다.
- 적절한 세포 회수 시약 1mL( 재료 표 참조)를 첨가하여 기저막 매트릭스를 분리하고 세포 현탁액을 얻은 다음 15mL 튜브에서 상층액을 회수합니다. 매트릭스가 즉시 해리되지 않으면 샘플을 4°C에서 완전히 용해될 때까지 15-20분 동안 배양합니다.
- 4.2단계에서 사용한 것과 동일한 세포 회수 시약 1mL를 플레이트의 웰에 추가하여 해리된 세포를 추가로 회수하고, 상층액을 4.2단계에서와 동일한 15mL 튜브에 추가합니다.
- 저온 Advanced DMEM-F12 5mL를 넣고 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 5mL 피펫으로 남아 있는 액체를 제거하여 펠릿을 조심스럽게 건조시킵니다. 가능한 한 튜브를 움직이지 마십시오. 1:2의 통로를 얻기 위해 기저막 매트릭스의 원래 부피의 두 배에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 오가노이드 배양물의 냉동 보관을 위해 4.5단계에서 얻은 펠릿을 1mL의 동결 배지(10% DMSO, 20% FBS, 50% DMEM-F12, 10.5μM ROCK 억제제)에 재현탁시키고 -80°C에서 보관합니다.
알림: 기저막 매트릭스의 부피는 1:1(원본과 동일한 부피의 기저막 매트릭스 사용) 또는 1:3(기저막 매트릭스의 원래 부피의 3배 추가)과 같은 다양한 통로를 수행하도록 조정할 수 있습니다.
5. 섬유아세포의 확립
- 10 % FBS로 2 mL의 DMEM에서 파편과 조직 잔여물을 회수 한 후이를 6 웰 플레이트에 넣고 5 % CO2 로 37 ° C에서 배양합니다.
- 도금 후 2일 또는 3일 후에 배지의 흡인에 의해 2.5단계에서 섬유아세포 배양에서 조직 잔여물을 제거하고 10% FBS가 있는 신선한 DMEM으로 교체합니다.
- 섬유아세포 배양을 일주일에 세 번 육안으로 모니터링하고, 10% FBS가 보충된 DMEM을 사용하여 일주일에 최소 두 번 배양 배지를 교체합니다.
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Representative Results
시간이 지남에 따라, 특히 처음 몇 주 동안 종양 오가노이드 배양이 어떻게 진행되는지 문서화하여 배양이 다운스트림 분석에서 어떻게 작용하는지 추정하는 것이 중요합니다. 그림 2는 15일 동안 신선한 조직에서 최적의 종양 세포 분리 및 종양 오가노이드 확립의 예를 보여줍니다. 때로는 샘플에 많은 양의 세포 파편이 있어 그림 3과 같이 종양 오가노이드가 발생하는 것을 확인하기가 어렵습니다. 또한 발달 중인 오가노이드의 표현형은 분리되고 둥근 오가노이드(그림 4A)에서 스페로이드/응집체 유사 배양(그림 4B-D)에 이르기까지 다양할 수 있으며, 이는 종양의 기원에 따라 다릅니다. 섬유아세포는 고형 종양, 특히 기질 함량이 높은 종양에서 원발성 종양 세포 배양 확립의 일반적인 부산물이며 종종 오가노이드 배양을 오염시킬 수 있습니다. 그림 5는 이러한 세포가 기저막 매트릭스 돔에서 어떻게 이동하고 약 7일 후에 배양 플레이트에 부착되었는지 보여줍니다. 이 세포는 배양 배지에서 영양분을 소비하여 오가노이드의 최적 성장을 저해합니다.
1차 섬유아세포는 그림 6과 같이 조직 절편에서 이동하여 배양판에 부착하고 단층 배양으로 성장할 때 분리된 배양물로 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 섬유아세포 배양을 위해 FBS가 10%인 표준 DMEM 배지를 사용할 것을 권장합니다. 그러나 섬유아세포에 특화된 배지도 사용할 수 있습니다. 부착성 섬유아세포는 도금 후 약 7일 후에 볼 수 있습니다(그림 6).
그림 1: 종양 오가노이드를 확립하기 위한 신선한 조직 샘플 처리. 조직 분해에서 오가노이드 도금에 이르기까지 종양 오가노이드 준비 과정의 개요가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 새로운 PDAC 종양에서 유래한 PDX에서 확립된 종양 오가노이드 배양. 며칠에 걸친 종양 오가노이드 배양의 진행을 1일, 3일, 7일, 10일, 15일에 하나의 현미경 평면에서 오가노이드 이미지와 함께 보여줍니다. 척도 막대: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 과도한 세포 파편이 있는 2일차에 최적이 아닌 종양 오가노이드 배양의 예. 척도 막대: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 크기와 형태에서 차이를 보여주는 다양한 PDAC PDX 조직에서 확립된 종양 오가노이드. 종양 오가노이드는 (A) 고전적인 둥근 표현형 또는 (B-D) 더 많은 스페로이드/응집체 유형의 모양을 가질 수 있습니다. 오가노이드의 평균 크기는 80uM에서 100uM 사이이지만 일부 오가노이드는 200uM까지 클 수 있습니다. 척도 막대: 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 배양 30일 후 CAF/섬유아세포로 오염된 최적이 아닌 종양 오가노이드 배양(A-C)의 예. 척도 막대: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 소화된 일차 종양 조직의 잔해에서 확립된 일차 섬유아세포 배양의 예 . (A) 융합 문화. (B) 비융합 문화. 척도 막대: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 종양 오가노이드 배양 확립의 문제 해결. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
종양학 임상 1상에서 약물이 승인될 가능성은 5.1%로 모든 질병 유형 중 가장 낮기 때문에 약리학적 암 치료의 주요 발전은 도전적입니다23. 주된 이유는 암이 매우 이질적이기 때문에 환자 코호트가 주어진 치료에 예상대로 균일하게 반응하지 않기 때문에 보다 개인화된 접근 방식이 필요하다는 것을 강조합니다. 2차원(2D) 배양은 수년 동안 중개 암 연구에 사용되어 왔지만 원발성 종양에서 발견되는 구조적 3D 조직이 부족합니다. 따라서, 이들은 환자의 치료 반응 및 종양 세포가 서로 또는 미세환경과의 통신을 정확하게 반영하지 못한다 3,23. 모든 3D 배양 시스템의 기본 핵심 원리는 주변 환경과의 세포 상호 작용을 촉진하고 원발성 종양(in situ)에서와 유사하게 공간적으로 적절한 방식으로 세포를 구성하는 것입니다. 종양 오가노이드의 형태는 그림 4와 같이 배양된 세포의 고유한 특성과 사용된 배양 조건에 따라 둥글고, 덩어리 같고, 포도 모양에서 별모양까지 다양합니다. 확립된 환자 유래 종양 오가노이드 배양은 종양 오가노이드가 임상 상황(즉, 임상 치료 반응)을 재현하는지 확인하기 위해 환자에게 사용된 것과 동일한 1차 치료제로 치료할 수 있습니다1,13,24,25.
종양 오가노이드는 또한 새로운 약리학적 제제로 치료할 수 있으며, 이는 표준 치료 옵션이 소진되었을 때 임상에서 후속 치료 라인에서 사용할 수 있는 새로운 치료법을 식별하기 위한 탐색적 접근 방식을 제공합니다. 종양 오가노이드 배양액의 약제에 대한 반응을 실시간으로 평가하기 위해 배양을 지속적으로 모니터링합니다. 환자 유래 이종이식 종양(PDX) 및 PDX 유래 오가노이드의 분자 및 면역조직화학적 특성 분석에 대한 타당성 연구는 형태, 단백질 발현 및 게놈 변형이 두 모델 간에 유사한 것으로 나타났습니다. 또한, 약물형 분석 개념 증명 연구에서는 in vivo 및 ex vivo 예측도 비교할 수 있는 것으로 나타났으며, 따라서 종양 오가노이드를 암/질병 모델로 사용하는 것이 임상 환경에 적용할 수 있는 실현 가능하고 강력한 접근 방식이라는 결론을 내렸습니다2.
상이한 종양 유형으로부터 유래한 종양 오가노이드 배양의 확립과 관련된 다양한 도전과제들이 본 명세서에서 강조되었으며, 최근에검토되었다 26,27,28. 주요 쟁점으로는 암세포보다 높은 성장률로 오가노이드를 형성하는 건강한 세포에 의한 "오염/과증식", 2D 배양에 비해 높은 배양 유지 비용, 낮은 확립률, 체세포 돌연변이 프로파일의 불일치 및 체외 배양과 기원 종양 간의 조직학, 원발성 종양 이질성, 쥐 기반 세포외 기질의 사용, 이는 인간 세포에 최적이 아닐 수 있으며 약물 전달, TME 및 관련 세포의 부재, 성장 인자 또는 분자 억제제와 약물 반응의 간섭, 종양 오가노이드의 확립 및 유지를 위한 표준화되고 검증된 프로토콜의 부족을 방해할 수 있습니다. 그러나 수년에 걸쳐 암 연구에서 원발성 종양 모델의 사용이 증가했으며 일차 배양을 배양하고 유지하는 기술이 개선되었습니다. 이러한 섬세한 생체 외 배양은 세포 성장과 안정성을 촉진하기 위해 보충제를 첨가하여 확립되고 유지됩니다. Rho 키나아제 억제제(Rho kinase inhibitor, ROCK)는 이제 세포사멸(apoptosis)을 피하고 세포-세포 접착을 강화하기 위해 일차 배양에 일상적으로 첨가되어 안정적인 1차 시험관 내 배양의 장기 확장을 촉진한다29. 또한, 해동된 냉동 보존된 줄기 세포의 생존율도 증가하는데, 이는 오가노이드 배양물의 동결 스톡을 생성할 때 중요하다29. 헤파린을 첨가하는 것은 또한 WNT 및 FGF 신호전달을 증가시킴으로써 줄기세포의 증식을 증진시키는데 사용될 수 있다30. 종양 오가노이드 확립을 최적화하기 위해 이 검증된 프로토콜에 사용되는 다른 중요한 시약으로는 Accutase 및 DNase가 있습니다. 아큐타제(Accutase)는 개별 줄기세포를 분리하거나 배양 표면에서 분리하는 데 권장되는 부드러운 소화 시약이며, 트립신31과 같이 이러한 목적으로 설계된 다른 시약을 사용하는 것보다 세포 생존력을 더 잘 유지하는 데 도움이 됩니다. 그러나, 콜라겐 분해 효소는 또한 생물학적 기저막에 통합된 콜라겐 유형을 특이적으로 표적으로 삼는 데 사용될 수 있다. DNase는 추출 프로토콜 중에 죽은 세포와 괴사한 세포에서 DNA 잔류물을 제거하고, 따라서 시료 전처리의 점도 증가로 인한 세포의 응집/응집을 방지하기 위해 수년 동안 세포 분리 방법에 사용되어 왔습니다(32). 세포 펠릿은 종종 용해 완충액으로 처리되지만, 조직 샘플8의 적혈구 오염에 대한 가시적인 증거가 없는 경우 이 단계를 제외할 수 있다(보충 파일 1).
종양 오가노이드의 성공적인 확립은 내재된 생물학적 합병증 없이는 이루어지지 않습니다. 이상적으로는 종양 오가노이드 배양을 위한 조직을 채취 당일에 처리하여 세포 생존율을 최적화해야 합니다. 조직을 동결하는 것은 세포 생존력을 크게 감소시킬 수 있으므로 항상 권장되는 것은 아닙니다. 그러나 종양 오가노이드는 DMSO 함유 동결 배지33,34에서 급속 동결 또는 서서히 동결된 시료를 사용하여 확립할 수 있으며, 이를 통해 시료 배송 및 바이오뱅킹이 가능합니다. 경우에 따라서는 기저막 매트릭스 돔을 제거한 후 플레이트에 부착된 종양 세포를 회수하여 여러 번 통과한 종양 오가노이드 배양물로부터 2D 배양을 얻을 수 있습니다. 경험상, 종양 오가노이드 확립의 성공률은 절제된 검체에서 유래한 새로운 PDAC 조직보다 PDX PDAC 조직에서 훨씬 더 높다4. 이는 일반적으로 더 큰 PDX PDAC 조직 조각을 사용할 수 있고 이 조직이 더 높은 세포성을 갖기 때문이며, 이는 체외 기반 접근 방식에 비해 PDX 모델이 제공하는 생체 내 환경이 더 쾌적하기 때문일 수 있습니다. 무독성 제제를 배양 배지에 첨가하여 세포 생존율과 배양 증식을 모니터링할 수 있습니다. 또한, 비종양성 오가노이드의 과잉 증식은 선택적 조건35,36을 사용하여 피해야 합니다. 췌장 조직에는 분리된 종양 세포의 생존력에 영향을 미칠 수 있는 소화 효소가 포함될 수 있습니다. 따라서, 트립신은 이 문제를 극복하기 위해 소화 단계에 첨가될 수 있다4. 환자/조직의 상태(즉, 종양학 요법으로 치료 또는 치료되지 않음), 종양의 유형, 수술실에서 채취한 샘플의 오염, 종양의 원래 등급과 같은 다른 많은 요인도 종양 오가노이드를 확립하는 능력에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 마찬가지로, 모든 조직이 1차 배양을 확립하기에 충분한 생존 가능한 종양 세포를 가지고 있는 것은 아닙니다. 이는 특히 기질이 풍부하고(약 90%-95%) 상피 종양 세포의 비율이 적은 PDAC 종양의 경우 더욱 그렇습니다. 또한, 기질 함량이 높은 조직은 배양을 위한 단일 종양 세포를 얻기 위해 절단 및 해리가 어려울 수 있습니다. 전문적이고 상업적으로 이용 가능한 분해 배지를 첨가하거나 조직이 완전히 분해되지 않은 경우 기계적 해리 장비를 사용할 수도 있습니다. 대안적으로, 조직이 반액체 모양이 될 때까지 두 개의 메스 블레이드를 사용하여 연속 절단하여 철저한 조직 해리를 달성할 수 있습니다(비디오 데모 참조).
절차 중에는 강조해야 할 많은 기술적 함정이 있습니다. 예를 들어, 조직 잔여물이 필터를 막을 수 있으며, 잔여물이 액체 상층액의 통과를 방해하므로 필터를 교체해야 합니다. 여과 단계를 여러 번 반복하여 해리된 종양 세포의 최대량을 회수할 수 있습니다. 또한, 세포 수가 적을 때 때때로 보기 어렵기 때문에 각 원심분리 단계 후에 세포 펠릿을 확인하는 것이 중요합니다. 세포 펠릿의 피펫팅은 공격적인 피펫팅으로 인해 세포가 손실되거나 세포 생존율이 감소할 수 있으므로 부드럽고 천천히 수행해야 합니다. 또한 매트릭스-셀 혼합물을 준비할 때 매트릭스가 빠르게 응고되므로 4°C로 사전 냉각된 매체와 -20°C에서 보관된 냉장 팁을 사용해야 합니다. 마지막으로, 위에서 언급했듯이 DNase는 시료 전처리 중 세포가 뭉치는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 프로토콜에 사용된 시약을 분취하고 성장 인자 혼합물을 준비하는 것도 시약의 반복적인 동결-해동을 피하기 위해 권장됩니다.
일차 섬유아세포의 분리는 PDAC에서 중요한 세포 유형이며 종양 세포 성장에 대한 TME의 효과를 결정하기 위한 후속 공동 배양 실험에 사용할 수 있기 때문에 흥미롭습니다. 약 1주일 후, 섬유아세포는 조직 절편에서 이동하며 일반적으로 배양판에 부착되어 단층 배양으로 성장하는 것을 볼 수 있습니다. 그러나 배양물에 섬유아세포가 존재하면 배양 배지의 영양분을 소비하여 종양 오가노이드의 최적 성장을 손상시키는 단점도 있습니다. ULA(Ultra-Low Attachment) 플레이트는 표준 세포 배양 처리 플레이트에 쉽게 부착되기 때문에 섬유아세포 성장을 제한하기 위해 종양 오가노이드를 배양하는 데 권장되는 경우가 많습니다. 이 검증된 프로토콜은 섬유아세포에 특화된 배지를 사용할 수도 있지만 1차 섬유아세포 배양을 위해 10% FBS가 있는 표준 DMEM 배지의 사용을 권장합니다.
시간이 지남에 따라, 특히 첫 주에는 배양이 조직의 품질, 양 및 출처(1차 인간 절제 가능한 종양 대 PDX)에 따라 다르게 작용하기 때문에 종양 오가노이드 배양 상태를 문서화하는 것이 중요합니다. 무독성 제제를 배양 배지에 첨가하여 세포 생존율과 배양 증식을 모니터링할 수 있습니다. 배양은 처음 7일 동안 매일 육안으로 모니터링해야 하며 그 이후에는 일주일에 2-3번 모니터링해야 합니다. 또한, 배지는 4-5일마다 또는 산성(노란색으로 나타남)으로 나타날 때 교체해야 하며, 기저막 매트릭스 돔이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 처음에는 높은 세포 밀도로 인해 큰 갈색 덩어리가 나타날 수 있습니다. 그러나 이것은 첫 번째 통과 후에 사라져야 하므로 기저막 기질의 명확한 배경에서 명확하게 정의된 종양 오가노이드를 얻을 수 있습니다. 종양 오가노이드의 시각적 표현형과 성장 속도를 결정하기 위해 특히 처음 3주 동안 종양 오가노이드의 사진을 촬영하는 것이 좋습니다. 종양 오가노이드 배양의 통과는 기술적인 과제이기도 합니다. 일반적으로, 배양 배지를 제거하고, 기저막 매트릭스가 완전히 용해될 때까지 4°C에서 매트릭스 돔을 트립신 기반 또는 특수 시약과 분리합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 새로운 매트릭스에 재현탁시키고 1:1(원본과 동일한 매트릭스 부피 사용) 또는 1:3(접근 방식의 원래 부피의 3배 추가)과 같이 원하는 통과를 수행하도록 부피를 조정합니다. 췌장 오가노이드 전문가로 구성된 David Tuveson 그룹은 췌장 오가노이드37을 설정, 유지 및 염색하기 위한 프로토콜이 포함된 온라인 리소스를 제공합니다.
환자 유래 체외 종양 오가노이드는 개인 맞춤형 의학에 적용하기 위해 환자별 치료 민감도를 평가하기 위한 귀중한 전임상 모델을 제공합니다. 또한, 이러한 모델은 기존의 2D 부착 세포 단층에 비해 생리학적으로 더 관련성이 높은 종양 모델입니다. 종양 모델 분야에서는 주기적인 사진 및 배양 기술 추적 관찰과 함께 3D 종양 모델의 명확하고 일관된 명명법이 필요합니다. 또한, 표준화된 프로토콜을 사용하는 것은 환자별 약물 민감도를 결정하는 데 있어 클리닉에서 이 기술의 성공을 위해 가장 중요합니다. 이 기술을 사용하는 연구원은 이러한 민감하고 복잡한 모델의 장애물과 함정을 알고 있어야 합니다. 그러나 검증된 프로토콜과 명확하게 정의된 조건 및 문제 해결 옵션을 사용하면 기술적 문제를 방지하고 문화의 확립 및 유지를 최적화하는 데 도움이 됩니다. 여기에서 종양 오가노이드를 확립하고 섬유아세포를 분리하기 위한 검증된 프로토콜이 제공되며, 이는 표준 장비 및 조직 배양 경험이 있는 많은 중개 종양학 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
이 연구는 Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), 보조금 계약 No. 857381에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램, 프로젝트 VISION(위암 조기 진단을 위한 과학적 우수성 및 혁신 역량 강화 전략)의 자금 지원을 받았습니다. 임상 연구자 및 신흥 연구 그룹을 위한 새로운 연구 프로젝트에 대한 교내 요청 IRYCIS(2021/0446), 환자 유래 오가노이드 2.0 프로젝트(CIBERONC) 및 TRANSCAN II 프로젝트 JTC 2017 "췌장 신경내분비 종양(NExT) 환자의 조기 진단 및 후속 조치를 위한 알고리즘 확립", 허가 번호 1.1.1.5/ERANET/20/03. 이 프로토콜에 사용된 생물학적 샘플은 BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS(B.0000678)에서 제공했으며 ISCIII(PT20/00045)의 Biobanks 및 Biomodels Platform에 통합되었습니다. 또한 NExT 및 VISION 프로젝트의 일환으로 이 프로토콜을 개발하는 데 귀중한 지원을 해주신 Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Robita 및 Thorsten Knoll에게도 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
References
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids - A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al.
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H.
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab. , Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023).
