Summary
Tumororganoider har revolusjonert kreftforskning og tilnærmingen til personlig medisin. De representerer en klinisk relevant tumormodell som gjør det mulig for forskere å ligge et skritt foran svulsten i klinikken. Denne protokollen etablerer tumororganoider fra ferske tumorvevsprøver fra bukspyttkjertelen og pasientavledede xenotransplantater av adenokarsinom opprinnelse i bukspyttkjertelen.
Abstract
Tumororganoider er tredimensjonale (3D) ex vivo tumormodeller som rekapitulerer de biologiske nøkkelfunksjonene i det opprinnelige primære tumorvevet. Pasientavledede tumororganoider har blitt brukt i translasjonell kreftforskning og kan brukes til å vurdere behandlingsfølsomhet og motstand, celle-celle-interaksjoner og tumorcelleinteraksjoner med tumormikromiljøet. Tumororganoider er komplekse kultursystemer som krever avanserte cellekulturteknikker og kulturmedier med spesifikke vekstfaktorcocktailer og en biologisk kjellermembran som etterligner det ekstracellulære miljøet. Evnen til å etablere primære tumorkulturer avhenger sterkt av opprinnelsesvevet, cellulariteten og de kliniske egenskapene til svulsten, som tumorgraden. Videre er vevsprøvetaking, materialkvalitet og kvantitet, samt korrekt biobanking og lagring viktige elementer i denne prosedyren. Laboratoriets tekniske evner er også avgjørende faktorer å vurdere. Her rapporterer vi en validert SOP/protokoll som er teknisk og økonomisk gjennomførbar for dyrkning av ex vivo tumororganoider fra ferske vevsprøver av pankreasadenokarsinom-opprinnelse, enten fra ferskt primært resektert pasientdonorvev eller pasientavledede xenotransplantater (PDX). Teknikken beskrevet her kan utføres i laboratorier med grunnleggende vevskultur og musefasiliteter og er skreddersydd for bred anvendelse innen translasjonell onkologi.
Introduction
Tumororganoider er ex vivo tredimensjonale (3D) organiserte kulturer som er avledet fra friskt tumorvev og gir kreftmodeller. Tumororganoider rekapitulerer de biologiske nøkkelfunksjonene til den opprinnelige primære svulsten 1,2,3,4 og kan utvides i opptil flere måneder og kryopreserveres, lik konvensjonelle immortaliserte cellelinjer. Tumororganoider gir en biobank av pasientavledede tumormodeller for translasjonell / personlig medisin5 og representerer et viktig fremskritt i kreftcellebiologiske systemer / modeller. Pasientavledede tumororganoider kan brukes som ex vivo-modeller for å forutsi effekten av (neo)adjuvante onkologiske/farmakologiske terapier, for hvilke kulturer etableres fra ferskt tumorvev og legemiddelsensitivitetsanalyser eller farmakotyping utføres på pasientspesifikt grunnlag for å identifisere effektive midler forpåfølgende behandlingslinjer1,4. Videre overvinner tumororganoider begrensningen av tilgjengeligheten av primærtumorvev og, enda viktigere, gir et utmerket alternativ eller komplementært system til in vivo musemodeller, slik som pasientavledede xenotransplantater (PDX)2. Kompleksiteten til tumororganoider økes dersom de primære tumorcellene kombineres med stromale celler som finnes i tumormikromiljøet (TME), slik som kreftassosierte fibroblaster (CAF), endotelceller og immunceller, som etterligner funksjonen og den komplekse cellulariteten til primærtumoren. Tumororganoider er etablert for mange tumortyper ved bruk av standardiserte protokoller 6,7,8,9,10. Organoid forplantning fra forskjellige solide svulster, inkludert kolorektal og brystkreftvev, er veletablert og teknisk rimelig 11,12,13,14,15.
Kirurgiske tumorreseksjoner eller tumorbiopsier gir primære tumorvevsprøver. Ideelt sett bør tumorvevsprøver komme fra midten av tumormassen eller den invaderende kanten av svulsten, så vel som normalt utseende vev ved siden av svulsten. Sammenlignet med konvensjonelle 2D-kulturer krever tumororganoider flere "tillegg", inkludert en biologisk kjellermembran (som Matrigel, hydrogel eller et kollagenbasert stillas), som etterligner den ekstracellulære TME, og et flytende vekstmedium som leverer spesifikke næringsstoffer og vekstfaktorer og støtter celleproliferasjon og levedyktighet i kultur16.
De mest grunnleggende trinnene i primær cellekultur er å vaske vevet i saltoppløsning for å forhindre forurensning, mekanisk kutte / fordøye svulsten i små biter på 1-3 mm3, og behandling med kollagenase for enzymatisk fordøyelse av vevet. Den fordøyde blandingen blir deretter filtrert for å fjerne store vevfragmenter, resuspendert i en biologisk kjellermembran som Matrigel, og belagt som kupler i lavfestekulturplater for å forbedre ikke-vedleggsvekst. Kjellermembranmatrikskuplene er dekket med flytende kulturmedium og supplert med glutamin og antibiotika for å unngå forurensning, samt med spesifikke vekstfaktorer avhengig av vevstype 7,8,9,16,17. Andre relevante celler som er tilstede i bulktumoren og TME kan også isoleres, for eksempel kreftassosierte fibroblaster (CAF) og immunceller. Denne teknikken, som nylig har blitt gjennomgått18, tillater etablering av samkulturer med forskjellige celletyper for å studere responsen på terapi i et mer "realistisk" tumormiljø. Videre kan celle-celle-interaksjoner og samspillet mellom tumorceller og komponenter i den omkringliggende biologiske matrisen studeres.
Den rapporterte suksessraten for tumororganoid etablering ved bruk av ferskt vev fra biopsier eller resektert gastrointestinalt tumorvev er rundt 50%11, og suksessraten fra sistnevnte er i stor grad avhengig av vevstype og opprinnelse4, spesielt tumorgrad og total tumorcellularitet. Tredimensjonale tumormodeller har varierende kompleksitet, fra enkle encellede aggregater til svært komplekse konstruerte modeller bestående av ulike celletyper. Terminologien som brukes til å beskrive 3D-kulturer i litteraturen er svært inkonsekvent 19,20,21, da forskjellige begreper som sfæroider, tumorsfærer og organoider brukes, selv om forskjellen mellom dem er uklar. Siden en klar konsensus om definisjonen ennå ikke er nådd, er en tumororganoid i denne artikkelen beskrevet som en organisert tumorcellekultur innebygd i en biologisk kjellermembran.
Her rapporteres en validert protokoll for etablering av tumororganoider fra ferske vevsprøver utgått fra ferskt primært resektert eller PDX-avledet pankreasduktalt adenokarsinom (PDAC), og denne protokollen kan utføres i de fleste laboratorier med basale vevskulturfasiliteter. Denne protokollen er tilpasset fra flere toppmoderne rapporterte protokoller som for tiden brukes til å etablere tumororganoider eller tumoroider fra fordøyelsestumorvev fra gruppene David Tuveson9, Hans Clevers8 og Aurel Perren7.
Denne protokollen diskuterer ikke hvordan det ferske vevet høstes. For å oppnå ferskt humant tumorvev av høy kvalitet, er det viktig å ha effektiv koordinering mellom kirurgene som høster vevet og patologiavdelingen som trekker ut vevsprøven for organoidkultur. På samme måte, når du bruker PDX som en fersk vevskilde, er effektiv koordinering med personen som høster vevsprøven også viktig. Det er viktig å ta vevsprøven så raskt som mulig (innen 30-60 min fra høstetid) for å opprettholde høy kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjene for velferd for forsøksdyr godkjent av Universidad Autónoma de Madrid etiske komité (CEI 103-1958-A337) og La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) og i samsvar med retningslinjene for etisk oppførsel i omsorg og bruk av dyr som angitt i De internasjonale veiledende prinsippene for biomedisinsk forskning som involverer dyr, utviklet av Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS). Protokollen fulgte de etiske prinsippene for biomedisinsk forskning med skriftlig informert samtykke. Det ble på forhånd innhentet etisk godkjenning for bruk av ferskvev til etablering av tumororganoidkulturer. Prøvene ble levert av BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (National Registry of Biobanks B.0000678), integrert i Biobanks and Biomodels Platform of the ISCIII (PT20/00045), og behandlet etter standard operasjonsprosedyrer med riktig etisk godkjenning. Svulstene ble subkutant implantert, som tidligere beskrevet22, i immunkompromitterte 6 uker gamle kvinnelige NU-Foxn1nu nakne mus (se materialtabell) og passert in vivo for å etablere PDAC PDX.
1. Eksperimentell forberedelse
- Håndter menneskelige prøver i et klasse II biosikkerhetsskap.
- Bruk en laboratoriefrakk, vernehansker og briller gjennom hele prosedyren for å unngå infeksjon av vevbårne patogener.
MERK: Minst 3 timer er nødvendig for å behandle den ferske vevsprøven og plate organoider og fibroblaster. - Behandle de ferske vevsprøvene22 innen maksimalt 24 timer fra høsting, og oppbevar ved 4 °C i vevskulturmedium (DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin) til behandling.
- Oppbevar alle prøver og reagenser på isen under hele prosedyren, og sørg for å forhåndsinnstille en nedkjølt sentrifuge til 4 °C og bruk den på lav hastighet for å unngå å skade cellepreparatet.
- Oppbevar P1,000 og P200 pipettespisser i en -20 ° C fryser for bruk under protokollen.
- Aliquot kjellermembranmatrisen (se Materialtabell) før bruk. For denne protokollen anbefales 250 ml alikoter.
2. Behandling av friskt primært tumorvev for å etablere tumororganoider og primære fibroblaster
MERK: Minst 3 timer er nødvendig for å behandle den ferske vevsprøven (enten primære humane resektabel svulster eller PDX) og å plate tumororganoider og fibroblaster. En oversikt over organoidpreparasjonsprosessen er vist i figur 1, fra vevsfordøyelse til plettering av tumororganoider. Før du starter protokollen, ta ut en alikot av kjellermembranmatrisen fra fryseren på -20 °C, og la den ligge på is i ca. 30-60 minutter før bruk.
- Sett en 6-brønns kulturplate i en 37 ° C cellekulturinkubator 3 timer før plating av organoider.
- Mål, fotografer og vask vevet (trinn 1.3) med 3 ml avansert DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / Nutrient Mix F-12 Ham (F12), supplert med 5% føtal bovint serum (FBS), 15 mM Hepes, 1% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin, 125 ng / ml amfotericin B, 0,1 mg / ml Normocin) (se materialfortegnelse) ved å pipettere opp og ned og deretter vaske med 3 ml fosfatbufret saltvann (PBS) ved å pipettere opp og ned.
- Fjern mediet ved aspirasjon fra vevskulturplaten og kutt vevet i 1 mm3 stykker i en steril vevskulturplate ved hjelp av to sterile kniver og 2 ml fordøyelsesmedium (avansert DMEM-F12 + 10 mg kollagenase IV / ml, 0,000625% trypsin-EDTA og 10 μg / ml DNase). Samle vevet i et 50 ml rør med 5 ml totalt fordøyelsesmedier og inkuber i 1 time ved 37 °C med mekanisk fordøyelse med kommersielt tilgjengelig utstyr (se materialtabellen) eller med periodisk blanding av prøven, ved å pipetere prøven opp og ned.
- Legg til 5 ml avansert DMEM-F12 for å deaktivere trypsinet, og filtrer prøven gjennom en 70 μm poresil for å fjerne store rusk.
- Tilsett 2 ml DMEM med 10% FBS til toppen av filteret, og samle rusk og vevrester for å etablere kulturer av fibroblaster (se trinn 5).
- Sentrifuge filtratet ved 200-300 x g i 5 minutter ved romtemperatur, og aspirer supernatanten, slik at bare cellepelleten blir igjen. Tilsett 5 ml avansert DMEM-F12, og sentrifuge i 5 minutter ved 300 x g.
- Resuspender pelleten i 4 ml ammoniumkloridkalium (ACK, se materialtabell) lysisbuffer. Før blandingen til et 15 ml rør, og inkuber ved romtemperatur i 2 minutter for å lyse de røde blodcellene.
MERK: Dette lysetrinnet i røde blodlegemer kan fjernes når det ikke er synlige tegn på forurensning. - Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur, og aspirer supernatanten. Tilsett 5 ml avansert DMEM-F12, og sentrifuge i 5 minutter ved 300 x g.
- Tilsett 1 ml kommersielt tilgjengelig celledissosiasjonsreagens (se materialfortegnelse) supplert med DNase (1 μg / ml) til cellepelleten, og inkuber i 2-3 minutter ved romtemperatur.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min, og aspirer supernatanten. Tilsett 5 ml avansert DMEM-F12, og resuspender cellepelleten.
- Pipett opp og ned 30 ganger med en P1000-pipette for å dissosiere cellene, sentrifuger i 5 minutter ved 300 x g, og fjern supernatanten.
- Ta P1,000 og P200 pipettespisser fra fryseren på -20 °C, og resuspender cellepelleten i membranmatrisen ved hjelp av en P1,000-pipette og kuldespisser (50 μL per dråpe, med tanke på pelletsvolumet, seks til syv kupler per brønn). Ta ut den tidligere oppvarmede platen fra inkubatoren. Sett en P200-pipette til 48 μL, og bruk kalde tips for å lage kupler av kjellermembranmatrisen i den forvarmede 6-brønnsplaten.
- Sett platen med kjellermembranmatrise-cellekuplene i 37 ° C 5% CO2 -inkubatoren i 15 minutter for å størkne kjellermembranmatrisen.
- Legg til 2-2,5 ml avansert DMEM-F12, supplert med 20 ng / ml rekombinant human epidermal vekstfaktor (EGF), 100 ng / ml human placenta vekstfaktor (PlGF), 10 ng / ml rekombinant human basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF), 769 ng / ml insulinlignende vekstfaktor-1 (IGF-1) og 10,5 μM ROCK-hemmer (avansert DMEM-F12 + vekstfaktorer) (se materialfortegnelse).
3. Overvåking av organoider
- Overvåk tumororganoidkulturen visuelt de første 7 dagene og deretter tre ganger per uke.
- Bytt medium to ganger per uke med avansert DMEM-F12 som inneholder 20 ng/ml rekombinant human epidermal vekstfaktor (EGF), 100 ng/ml human placenta vekstfaktor (PlGF), 10 ng/ml rekombinant human basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF), 769 ng/ml insulinlignende vekstfaktor-1 (IGF-1) og 10,5 μM ROCK-hemmer (avansert DMEM-F12 + vekstfaktorer).
- Ta bilder av tumororganoidkulturen med jevne mellomrom på dag 1, dag 3, dag 7, dag 10 og dag 15 etter behandling av prøven og plating av kulturen i matrisen for å observere veksten og levedyktigheten.
4. Passasje og kryolagring av organoider
- Fjern kulturmediet fra 6-brønnsplaten.
- Tilsett 1 ml av et egnet cellegjenvinningsreagens (se materialfortegnelse) for å løsrive matrisen av kjellermembranen og oppnå en cellesuspensjon, og gjenvinne supernatanten i et 15 ml rør. Hvis matriksen ikke løsner umiddelbart, inkuberes prøven ved 4 °C i 15-20 minutter til den er helt oppløst.
- Tilsett 1 ml av det samme cellegjenvinningsreagenset som ble brukt i trinn 4.2 til brønnen på platen for å gjenvinne ytterligere dissosierte celler, og tilsett supernatanten til det samme 15 ml røret som i trinn 4.2.
- Tilsett 5 ml kald Advanced DMEM-F12, og sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og tørk pelleten forsiktig ved å fjerne gjenværende væske med en 5 ml pipette. Unngå å flytte røret så mye som mulig. Resuspender cellepelleten i to ganger det opprinnelige volumet av kjellermembranmatrise for å oppnå en passasje på 1: 2.
- For kryolagring av organoidkulturer, resuspender pelleten oppnådd i trinn 4,5 i 1 ml frysemedium (10% DMSO, 20% FBS, 50% DMEM-F12, 10,5 μM ROCK-hemmer), og oppbevares ved -80 ° C.
MERK: Volumet av kjellermembranmatrise kan justeres for å utføre forskjellige passasjer, for eksempel 1: 1 (ved bruk av samme volum av kjellermembranmatrise som originalen) eller 1: 3 (legger til tre ganger det opprinnelige volumet av kjellermembranmatrise).
5. Etablering av fibroblaster
- Etter å ha gjenvunnet rusk og vevrester i 2 ml DMEM med 10% FBS, legg dette til en 6-brønnsplate og inkuber ved 37 ° C med 5% CO2.
- Fjern vevrestene fra fibroblastkulturene fra trinn 2.5 ved aspirasjon av mediet 2 dager eller 3 dager etter plating, og erstatt med fersk DMEM med 10% FBS.
- Overvåk fibroblastkulturen visuelt tre ganger per uke, og bytt kulturmediet minst to ganger i uken ved hjelp av DMEM supplert med 10% FBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er viktig å dokumentere hvordan dyrkning av tumororganoider utvikler seg over tid, spesielt de første ukene, for å kunne estimere hvordan dyrkningen vil oppføre seg i nedstrømsanalyser. Figur 2 viser et eksempel på optimal tumorcelleisolering og tumororganoid etablering fra ferskt vev over en 15 dagers periode. Noen ganger er det store mengder cellerester i prøven, og det er vanskelig å se de utviklende tumororganoidene, som vist i figur 3. Videre kan fenotypen til de utviklende organoidene variere fra isolerte, avrundede organoider (figur 4A) til sfæroide/aggregerte kulturer (figur 4B-D), og dette avhenger av svulstens opprinnelse. Fibroblaster er et vanlig biprodukt av primær tumorcellekulturetablering fra solide svulster, spesielt de med høyt sromainnhold, og kan ofte forurense organoidkulturen. Figur 5 viser hvordan disse cellene migrerte fra kjellermembranmatrikskuplene og festet seg til dyrkningsplatene etter ca. 7 dager. Disse cellene forbruker næringsstoffene fra kulturmediet, og kompromitterer dermed den optimale veksten av organoider.
Primære fibroblaster kan oppnås som en isolert kultur når de migrerer ut av vevsseksjonene, fester seg til kulturplatene og vokser som en monolagskultur, som vist i figur 6. Denne protokollen anbefaler å bruke standard DMEM-medium med 10% FBS for kulturen til fibroblastene. Imidlertid kan et spesialisert medium for fibroblaster også brukes. Adherente fibroblaster er synlige ca. 7 dager etter plating (figur 6).
Figur 1 Behandling av ferske vevsprøver for å etablere tumororganoider. En oversikt over tumororganoidpreparasjonsprosessen er vist, fra vevsfordøyelse til plettering av organoider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Dyrkning av tumororganoider påvist fra PDX med utspring i fersk PDAC-tumor. Progresjonen av tumororganoidkulturen over flere dager er vist, med bilder av organoidene i ett mikroskopisk plan på dag 1, dag 3, dag 7, dag 10 og dag 15. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempler på ikke-optimal tumororganoidkultur dag 2 med overskudd av celleavfall. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Etablerte tumororganoider fra ulike PDAC PDX-vev med forskjeller i størrelse og morfologi. Tumororganoider kan ha en (A) klassisk avrundet fenotype eller (B-D) et mer sfæroid / aggregat-type utseende. Den gjennomsnittlige størrelsen på organoider varierer fra 80 uM til 100 uM, selv om noen organoider kan være så store som 200 uM. Skala bar: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempler på ikke-optimal tumororganoidkultur (A-C) forurenset med CAF/fibroblaster etter 30 dager i kultur. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksempler på primære fibroblastkulturer etablert fra restene av fordøyd primærtumorvev . (A) Konfluent kultur. (B) Ikke-sammenflytende kultur. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Feilsøking av etablering av tumororganoid dyrkning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Store fremskritt innen farmakologisk kreftbehandling er utfordrende, da sannsynligheten for godkjenning av legemidler i fase I onkologiske kliniske studier er 5,1%, som er den laveste av alle sykdomstyper23. Hovedårsaken er at kreft er svært heterogen, og derfor reagerer pasientkohorter ikke jevnt som forventet på den gitte behandlingen, noe som fremhever at en mer personlig tilnærming er nødvendig. Todimensjonale (2D) kulturer har blitt brukt i translasjonell kreftforskning i mange år, men mangler den strukturelle 3D-organisasjonen som finnes i primære svulster. Dermed reflekterer de ikke nøyaktig pasientterapiresponser og tumorcellekommunikasjon med hverandre eller med deres mikromiljø 3,23. Det underliggende kjerneprinsippet for alle 3D-kultursystemer er å fremme cellulær interaksjon med omgivelsene og å organisere celler på en romlig relevant måte, lik i primærtumoren (in situ). Morfologien til tumororganoider varierer fra rund, masse og druelignende til stellat avhengig av den iboende naturen til dyrkede celler og kulturbetingelsene som brukes, som vist i figur 4. Etablerte pasientavledede tumororganoidkulturer kan behandles med samme førstelinjebehandling som brukes hos pasienten for å bekrefte at tumororganoid rekapitulerer den kliniske situasjonen (dvs. klinisk terapirespons)1,13,24,25.
Tumororganoidene kan også behandles med nye farmakologiske midler, noe som gir en utforskende tilnærming for å identifisere nye terapier som kan brukes i påfølgende behandlingslinjer i klinikken når standard terapialternativer er oppbrukt. Kulturen overvåkes kontinuerlig for å vurdere responsen av tumororganoidkulturer til midlet i sanntid. En mulighetsstudie av molekylær og immunhistokjemisk karakterisering av pasientavledet xenografttumor (PDX) og PDX-avledede organoider viste at morfologi, proteinuttrykk og genomiske endringer var sammenlignbare mellom de to modellene. Videre viste en farmakotyping proof-of-concept-studie at in vivo og ex vivo prediksjonene også var sammenlignbare, og konkluderte dermed med at bruk av tumororganoider som kreft / sykdomsmodell er en gjennomførbar og robust tilnærming som kan brukes i klinisk setting2.
En rekke utfordringer knyttet til etablering av tumororganoidkulturer med utspring i ulike tumortyper er belyst her og nylig gjennomgått26,27,28. Sentrale spørsmål inkluderer "forurensning / overvekst" av friske celler, som danner organoider med høyere vekstrate enn kreftceller, høye kostnader for kulturvedlikehold sammenlignet med 2D-kulturer, lav etableringsrate, inkonsekvenser i den somatiske mutasjonsprofilen og histologi mellom ex vivo-kulturen og opprinnelsessvulsten, primærtumorheterogenitet, bruk av en murinbasert ekstracellulær matrise, som kanskje ikke er optimal for humane celler og kan hindre legemiddellevering, fravær av TME og tilhørende celler, interferens av vekstfaktorer eller molekylære hemmere med legemiddelresponsen og mangelen på standardiserte og validerte protokoller for etablering og vedlikehold av tumororganoider. Men gjennom årene har bruken av primære tumormodeller i kreftforskning økt, og teknikker for å dyrke og vedlikeholde primære kulturer har blitt bedre. Disse delikate ex vivo kulturer er etablert og vedlikeholdt ved å legge kosttilskudd for å fremme cellevekst og stabilitet. Rhokinasehemmeren (ROCK) blir nå rutinemessig tilsatt primærkulturer for å unngå apoptose og øke celle-celleadhesjon, og dermed fremme langsiktig ekspansjon av stabile primære in vitro-kulturer 29. Videre øker det også overlevelsen av tinte kryopreserverte stamceller, noe som er viktig når man genererer frosne lagre av organoidkulturer29. Tilskudd med heparin kan også brukes til å forbedre utvidelsen av stamceller ved å øke WNT- og FGF-signalering og dermed celleproliferasjon30. Andre viktige reagenser som brukes i denne validerte protokollen for å optimalisere tumororganoid etablering inkluderer Accutase og DNase. Accutase er et mildt fordøyelsesreagens som anbefales for å skille individuelle stamceller eller løsne dem fra kulturoverflatene, og det bidrar til å opprettholde celle levedyktighet bedre enn å bruke andre reagenser designet for dette formålet, for eksempel trypsin31. Imidlertid kan kollagenaser også brukes til å spesifikt målrette kollagentypen innlemmet i den biologiske kjellermembranen. DNase har blitt brukt i celleisolasjonsmetoder i mange år32 for å eliminere DNA-rester fra døde og nekrotiske celler under ekstraksjonsprotokollen og dermed forhindre klumping / aggregering av celler på grunn av økt viskositet av prøvepreparatet. Cellepellets behandles ofte med lysisbuffer, men dette trinnet kan utelukkes når det ikke er synlige holdepunkter for erytrocyttkontaminering av vevsprøve8 (tilleggsfil 1).
Den vellykkede etableringen av tumororganoider kommer ikke uten iboende biologiske komplikasjoner. Ideelt sett bør vev for tumororganoidkulturer behandles samme dag som høstingen for å optimalisere cellens levedyktighet. Frysing av vev anbefales ikke alltid, da det kan redusere cellens levedyktighet betydelig. Imidlertid kan tumororganoider etableres ved hjelp av prøver som er flashfryst eller langsomt kryopreservert i DMSO-inneholdende frysemedium33,34, noe som tillater prøveforsendelse og biobanking. I noen tilfeller er det mulig å oppnå 2D-kulturer fra tumororganoidkulturer som har blitt passert flere ganger ved utvinning av tumorcellene festet til platene etter fjerning av kjellermembranmatrikskuplene. Vår erfaring er at suksessraten for tumororganoid etablering er mye høyere med PDX PDAC-vev enn med ferskt PDAC-vev avledet fra resektert prøve4. Dette skyldes det faktum at større biter av ferskt PDX PDAC-vev vanligvis er tilgjengelige, og dette vevet har høyere cellularitet, sannsynligvis på grunn av det mer gjestfrie in vivo-miljøet som tilbys av PDX-modellen sammenlignet med ex vivo-baserte tilnærminger. Ikke-giftige stoffer kan tilsettes til kulturmediet for å overvåke cellens levedyktighet og spredning av kulturen. Videre må gjengroing av ikke-neoplastiske organoider unngås ved bruk av selektive forhold35,36. Vev i bukspyttkjertelen kan inneholde fordøyelsesenzymer som kan påvirke levedyktigheten til de isolerte tumorcellene; Dermed kan trypsin legges til fordøyelsestrinnet for å overvinne dette problemet4. Mange andre faktorer, for eksempel pasientens / vevets status (dvs. behandlet eller ubehandlet med onkologisk terapi), typen svulst, forurensningen av prøven fra operasjonssalen og den opprinnelige karakteren av svulsten, kan også påvirke evnen til å etablere en tumororganoid betydelig. På samme måte har ikke alle vev nok levedyktige tumorceller til å etablere primære kulturer. Dette gjelder spesielt for PDAC-svulster, som er notorisk stromarike (ca. 90% -95%) og inneholder en liten prosentandel av epiteltumorceller. I tillegg kan vev med høyt stromainnhold være vanskelig å kutte og dissosiere for å oppnå enkelttumorceller for kultur. Spesialiserte og kommersielt tilgjengelige fordøyelsesmedier kan tilsettes, eller mekanisk dissosiasjonsutstyr kan også brukes hvis vevet ikke er fullstendig fordøyd. Alternativt kan en grundig vevsdissosiasjon oppnås ved kontinuerlig skjæring med to skalpellblad til vevet har et halvflytende utseende (se videodemonstrasjon).
Det er mange tekniske fallgruver under prosedyren som også må fremheves. For eksempel kan vevsrester blokkere filteret, og filteret må da endres, da restene hindrer passasjen av væskesupernatanten. Filtreringstrinnet kan gjentas flere ganger for å gjenopprette maksimal mengde dissosierte tumorceller. Videre er det viktig å sjekke cellepelleten etter hvert sentrifugeringstrinn, da det noen ganger er vanskelig å se når det er lavt celletall. Pipetteringen av cellepellets bør utføres forsiktig og sakte, da aggressiv pipettering kan føre til tap av celler eller en reduksjon i cellens levedyktighet. Videre, ved tilberedning av matrikscelleblandingen, bør medier forkjølt til 4 ° C og kjølespisser lagret ved -20 ° C brukes, da matrisen størkner raskt. Til slutt, og som nevnt ovenfor, bidrar DNase til å forhindre klumping av celler under prøvepreparering. Aliquoting av reagensene som brukes i protokollen og klargjøring av vekstfaktorer, blandinger anbefales også for å unngå repeterende frysetining av reagensene.
Isoleringen av primære fibroblaster er av interesse, da de er en viktig celletype i PDAC og kan brukes til påfølgende samkultureksperimenter for å bestemme effekten av TME på tumorcellevekst. Etter ca. 1 uke har fibroblastene migrert ut av vevsseksjonene og kan vanligvis sees festet til kulturplatene og vokser som en monolagskultur. Tilstedeværelsen av fibroblaster i kulturen har imidlertid også ulemper, da de forbruker næringsstoffene fra kulturmediet og dermed kompromitterer den optimale veksten av tumororganoider. Ultra-lav vedlegg (ULA) plater anbefales ofte for dyrking av tumororganoider for å begrense fibroblastvekst, da de lett festes til standard cellekulturbehandlede plater. Denne validerte protokollen anbefaler bruk av standard DMEM-medier med 10% FBS for kulturen av primære fibroblaster, selv om spesialiserte medier for fibroblaster også kan brukes.
Det er viktig å dokumentere tilstanden til tumororganoidkulturen over tid, spesielt i løpet av den første uken, da kulturen oppfører seg forskjellig avhengig av vevskvalitet, mengde og kilde (primære humane resektabel svulster versus PDX). Ikke-giftige stoffer kan tilsettes til kulturmediet for å overvåke cellens levedyktighet og spredning av kulturen. Kulturene må overvåkes visuelt daglig i løpet av de første 7 dagene og deretter to til tre ganger per uke. Videre må mediet skiftes hver 4-5 dag eller når det virker surt (ser gult ut), pass på at du ikke skader kjellermembranmatrikskuplene. I begynnelsen kan store brune klumper oppstå på grunn av høy celletetthet. Dette bør imidlertid forsvinne etter den første passasjen, slik at klart definerte tumororganoider kan oppnås på en klar bakgrunn av kjellermembranmatrisen. Det anbefales å ta bilder av tumororganoider, spesielt i løpet av de første 3 ukene, for å bestemme den visuelle fenotypen og veksthastigheten til tumororganoidene. Passasjen av tumororganoidkulturen er også en teknisk utfordring. Vanligvis fjernes kulturmediet, og matrikskuplene disassociated med trypsinbaserte eller spesialiserte reagenser ved 4 ° C til kjellermembranmatrisen helt oppløses. Cellepelleten resuspenderes deretter i fersk matrise, og volumet justeres for å utføre ønsket passasje, for eksempel 1: 1 (med samme matrisevolum som originalen) eller 1: 3 (legger til tre ganger det opprinnelige volumet av tilnærmingen). Gruppen av David Tuveson, bestående av eksperter i bukspyttkjertelorganoider, gir elektroniske ressurser med protokoller for å etablere, vedlikeholde og fargelegge bukspyttkjertelorganoider37.
Pasientavledede ex vivo tumororganoider gir en verdifull preklinisk modell for å vurdere pasientspesifikk behandlingsfølsomhet for anvendelse i personlig medisin. Videre er disse modellene mer fysiologisk relevante tumormodeller sammenlignet med tradisjonelle 2D-adherente cellemonolag. En klar og konsistent nomenklatur av 3D-tumormodeller med periodisk fotografisk og beskrivende oppfølging av kulturen er nødvendig i tumormodellfeltet. Videre er arbeid med standardiserte protokoller av største betydning for suksessen til denne teknologien i klinikken for å bestemme legemiddelfølsomhet på pasientspesifikk basis. Forskere som bruker denne teknologien bør være oppmerksomme på hindringene og fallgruvene til disse følsomme og komplekse modellene. Arbeid med en validert protokoll og klart definerte forhold og feilsøkingsalternativer vil imidlertid hjelpe til med å unngå tekniske problemer og optimalisere etableringen og vedlikeholdet av kulturen. Her er det gitt en validert protokoll for etablering av tumororganoider og isolering av fibroblaster som lett kan implementeres i mange translasjonelle onkologiske laboratorier med standardutstyr og vevskulturerfaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av finansiering fra Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I + D + i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), EUs Horizon 2020 Research and Innovation Programme under tilskuddsavtale nr. 857381, prosjekt VISION (Strategier for å styrke vitenskapelig fortreffelighet og innovasjonskapasitet for tidlig diagnose av gastrointestinale kreft), Intramural utlysning av nye forskningsprosjekter for kliniske forskere og nye forskningsgrupper IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) og TRANSCAN II-prosjektet JTC 2017 kaller "Etablering av en algoritme for tidlig diagnose og oppfølging av pasienter med pankreasnevroendokrine svulster (NExT)", stipendnummer 1.1.1.5/ERANET/20/03. De biologiske prøvene som ble brukt i denne protokollen ble levert av BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) og integrert i ISCIII Biobanks and Biomodels Platform (PT20/00045). Vi vil også takke Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita og Thorsten Knoll for deres uvurderlige støtte til å utvikle denne protokollen som en del av NExT- og VISION-prosjektene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
References
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids - A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al.
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H.
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab. , Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023).
