Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Получение опухолевых органоидов и фибробластов рака поджелудочной железы из свежих тканей

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65229
Automatic Translation
*1,2,3,4, *5, 6, 6, 1,3, 6, 7, 6,8, 6,8, 3, 3, 2,9, 9, 10, 2,7, 11, 1,2, 1,2, 1,2,4, 3,12,13, 2,3,12,13, 3, 6, 1,2,3
1Molecular Epidemiology and Predictive Tumor Markers Group, Area 3, Ramón y Cajal Health Research Institute (IRYCIS), 2The Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC), 3Biobank and Biomodels Platform (PT20/0045), ISCIII research and development platforms in biomedicine and health sciences, BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS, Spanish National Biobanks Network (ISCIII Biobank Register No. B.0000678), Ramón y Cajal Health Research Institute (IRYCIS), 4Faculty of Medicine, University of Alcalá de Henares, 5Institute of Tissue Medicine and Pathology, University of Bern, 6Department of Molecular Oncology, Cancer Research Institute, Biomedical Research Center of the Slovak Academy of Sciences, 7Experimental Oncology, Molecular Oncology Program, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), 8Department of Surgical Oncology, National Cancer Institute, Slovak Medical University, 9Pancreatic and Biliopancreatic Surgery Unit, Hospital Universitario Ramón y Cajal, 10Department of Pathology, Hospital Universitario Ramón y Cajal, 11Department of Radiation Oncology, Hospital Universitario Ramón y Cajal, 12Department of Cancer, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” (IIBM), 13Cancer Stem Cell and Fibroinflammatory Group, Chronic Diseases and Cancer, Area 3, IRYCIS
* These authors contributed equally

Summary

Органоиды опухолей произвели революцию в исследованиях рака и подходе к персонализированной медицине. Они представляют собой клинически значимую модель опухоли, которая позволяет исследователям оставаться на шаг впереди опухоли в клинике. Этот протокол устанавливает опухолевые органоиды из свежих образцов ткани опухоли поджелудочной железы и ксенотрансплантатов, полученных от пациента при аденокарциноме поджелудочной железы.

Abstract

Опухолевые органоиды представляют собой трехмерные (3D) модели опухолей ex vivo , которые повторяют биологические ключевые особенности исходных первичных опухолевых тканей. Органоиды опухолей, полученные от пациентов, используются в трансляционных исследованиях рака и могут применяться для оценки чувствительности и резистентности к лечению, межклеточных взаимодействий и взаимодействий опухолевых клеток с микроокружением опухоли. Опухолевые органоиды представляют собой сложные системы культивирования, требующие передовых методов культивирования клеток и питательных сред со специфическими коктейлями факторов роста и биологической базальной мембраной, имитирующей внеклеточную среду. Возможность создания первичных опухолевых культур в значительной степени зависит от исходной ткани, клеточности и клинических особенностей опухоли, таких как степень опухоли. Кроме того, важнейшими элементами этой процедуры являются сбор образцов тканей, качество и количество материала, а также правильное биобанкирование и хранение. Технические возможности лаборатории также являются решающими факторами, которые следует учитывать. Здесь мы сообщаем о валидированной СОП/протоколе, который технически и экономически осуществим для культивирования опухолевых органоидов ex vivo из свежих образцов тканей происхождения из аденокарциномы поджелудочной железы, либо из свежей первичной резецированной донорской ткани пациента, либо из ксенотрансплантатов, полученных от пациента (PDX). Описанный здесь метод может быть выполнен в лабораториях с базовыми тканевыми культурами и оборудованием для мышей и адаптирован для широкого применения в области трансляционной онкологии.

Introduction

Опухолевые органоиды представляют собой трехмерные (3D) организованные культуры ex vivo, полученные из свежей опухолевой ткани и обеспечивающие модели рака. Опухолевые органоиды повторяют биологические ключевые особенности исходной первичной опухоли 1,2,3,4 и могут быть расширены на срок до нескольких месяцев и криоконсервированы, подобно обычным иммортализированным клеточным линиям. Органоиды опухолей представляют собой биобанк моделей опухолей, полученных от пациентов, для трансляционной/персонализированной медицины5 и представляют собой важный шаг вперед в системах/моделях биологии раковых клеток. Органоиды опухолей, полученные от пациентов, могут быть использованы в качестве моделей ex vivo для прогнозирования эффективности (нео)адъювантной онкологической/фармакологической терапии, для которой из свежей опухолевой ткани устанавливают культуры и проводят анализы на чувствительность к лекарственным препаратам или фармакотипирование на индивидуальной основе для выявления эффективных агентов для последующих линий терапии 1,4. Кроме того, опухолевые органоиды преодолевают ограниченность доступности первичной опухолевой ткани и, что более важно, представляют собой прекрасную альтернативу или комплементарную систему для мышиных моделей in vivo, таких как ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX)2. Сложность опухолевых органоидов увеличивается, если первичные опухолевые клетки сочетаются со стромальными клетками, которые находятся в опухолевом микроокружении (ТМЭ), такими как рак-ассоциированные фибробласты (CAF), эндотелиальные клетки и иммунные клетки, которые имитируют функционирование и сложную клеточность первичной опухоли. Органоиды опухолей были установлены для многих типов опухолей с использованием стандартизированных протоколов 6,7,8,9,10. Размножение органоидов из различных солидных опухолей, включая колоректальную ткань и ткань рака молочной железы, хорошо известно и технически доступно 11,12,13,14,15.

Хирургическая резекция опухоли или биопсия опухоли позволяют получить первичные образцы опухолевой ткани. В идеале образцы опухолевой ткани должны поступать из центра опухолевой массы или вторгающегося края опухоли, а также из нормально выглядящей ткани, прилегающей к опухоли. По сравнению с обычными 2D-культурами, опухолевые органоиды требуют нескольких «дополнений», включая биологическую базальную мембрану (например, матригель, гидрогель или каркас на основе коллагена), которая имитирует внеклеточный TME, и жидкую питательную среду, которая поставляет определенные питательные вещества и факторы роста и поддерживает пролиферацию и жизнеспособность клеток в культуре16.

Наиболее основными этапами первичной клеточной культуры являются промывание тканей в физиологическом растворе для предотвращения загрязнения, механическое разрезание/расщепление опухоли на мелкие кусочки по 1-3мм3 и обработка коллагеназой для ферментативного расщепления ткани. Затем переваренную смесь фильтруют для удаления крупных фрагментов ткани, ресуспендируют в биологической базальной мембране, такой как Matrigel, и покрывают в виде куполов в культуральных планшетах с низким прикреплением для усиления роста без прикрепления. Матричные купола базальной мембраны покрыты жидкой питательной средой и дополнены глютамином и антибиотиками во избежание контаминации, а также специфическими факторами роста в зависимости от типа ткани 7,8,9,16,17. Другие соответствующие клетки, присутствующие в объемной опухоли и TME, также могут быть выделены, такие как ассоциированные с раком фибробласты (CAF) и иммунные клетки. Этот метод, который недавно был рассмотрен18, позволяет создавать кокультуры с различными типами клеток для изучения ответа на терапию в более «реалистичной» опухолевой среде. Кроме того, могут быть изучены межклеточные взаимодействия и взаимодействие между опухолевыми клетками и компонентами окружающего биологического матрикса.

Показатель успешности установления органоидов опухоли с использованием свежей ткани, полученной при биопсии или резецированной опухолевой ткани желудочно-кишечного тракта, составляет около 50%11, а вероятность успеха в последнем случае в значительной степени зависит от типа и происхождения ткани4, в частности, от степени опухоли и общей клеточности опухоли. Трехмерные модели опухолей имеют различную сложность, от простых одноклеточных агрегатов до очень сложных инженерных моделей, состоящих из различных типов клеток. Терминология, используемая для описания 3D-культур в литературе, крайне противоречива 19,20,21, поскольку используются разные термины, такие как сфероиды, опухолевые сферы и органоиды, хотя разница между ними неясна. Поскольку четкого консенсуса по определению еще не достигнуто, в данной статье опухолевый органоид описывается как организованная культура опухолевых клеток, встроенная в биологическую базальную мембрану.

В настоящем документе приводится валидированный протокол для установления опухолевых органоидов из свежих образцов тканей, полученных из свежей первичной резецированной или PDX-протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC), и этот протокол может быть выполнен в большинстве лабораторий, имеющих базовое оборудование для культивирования тканей. Этот протокол был адаптирован из нескольких современных протоколов, которые в настоящее время используются для установления опухолевых органоидов или опухолей из опухолевой ткани пищеварительной системы из групп Дэвида Тувесона9, Ханса Клеверса8 и Ауреля Перрена7.

В этом протоколе не обсуждается, как собирается свежая ткань. Для получения высококачественной свежей опухолевой ткани человека важна эффективная координация между хирургами, которые собирают ткань, и патологоанатомическим отделением, которое извлекает образец ткани для культивирования органоидов. Кроме того, при использовании PDX в качестве источника свежих тканей также важна эффективная координация с человеком, который собирает образец ткани. Очень важно получить образец ткани как можно быстрее (в течение 30-60 минут с момента забора), чтобы сохранить высокое качество.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были проведены в соответствии с институциональными руководящими принципами по благополучию экспериментальных животных, утвержденными Комитетом по этике Автономного университета Мадрида (CEI 103-1958-A337) и La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19), а также в соответствии с руководящими принципами этического поведения при уходе за животными и их использовании, изложенными в Международных руководящих принципах биомедицинских исследований с участием животных. разработан Советом международных организаций медицинских наук (CIOMS). Протокол следовал этическим принципам биомедицинских исследований с письменным информированным согласием. Было получено предварительное этическое одобрение на использование свежих тканей для создания опухолевых органоидных культур. Образцы были предоставлены больницей BioBank Ramón y Cajal-IRYCIS (Национальный реестр биобанков B.0000678), интегрированы в платформу биобанков и биомоделей ISCIII (PT20/00045) и обработаны в соответствии со стандартными операционными процедурами с соответствующим этическим одобрением. Опухоли были подкожно имплантированы,как описано ранее, 6-недельным самкам голых мышей NU-Foxn1nu с ослабленным иммунитетом (см. таблицу материалов) и пассированы in vivo для создания PDAC PDX.

1. Подготовка эксперимента

  1. Работайте с образцами для людей в шкафу биологической безопасности класса II.
  2. Носите лабораторный халат, защитные перчатки и очки на протяжении всей процедуры, чтобы избежать инфицирования тканевыми патогенами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимум 3 часа требуется для обработки свежего образца ткани и нанесения органоидов и фибробластов.
  3. Свежие образцы тканей 22 обрабатывают в течение максимум24 ч после сбора и хранят при 4 °С в питательной среде для тканей (DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина) до обработки.
  4. Держите все образцы и реагенты на льду в течение всей процедуры, а также убедитесь, что охлаждаемая центрифуга предварительно настроена на 4 °C и используется на низкой скорости, чтобы не повредить заготовку ячейки.
  5. Храните наконечники для дозаторов P1 000 и P200 в морозильной камере с температурой −20 °C, чтобы использовать их во время протокола.
  6. Перед использованием аквотируйте матрицу базальной мембраны (см. Таблицу материалов). Для этого протокола рекомендуется 250 мл аликвот.

2. Обработка свежей первичной опухолевой ткани для создания опухолевых органоидов и первичных фибробластов

ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется не менее 3 часов для обработки свежего образца ткани (либо первичных резектабельных опухолей человека, либо PDX) и планшетирования опухолевых органоидов и фибробластов. Схема процесса подготовки органоидов показана на рисунке 1, от расщепления тканей до покрытия органоидов опухоли. Перед началом протокола выньте аликвоту матрицы базальной мембраны из морозильной камеры с температурой −20 °C и оставьте на льду примерно на 30-60 минут перед использованием.

  1. Поместите 6-луночный культуральный планшет в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 °C за 3 часа до нанесения органоидов.
  2. Отмерьте, сфотографируйте и промойте ткань (шаг 1.3) 3 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) и питательной смеси Dulbecco F-12 Ham (F12) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 15 мМ Hepes, 1% L-глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина, 125 нг/мл амфотерицина B, 0,1 мг/мл нормоцина) (см. Таблицу материалов) путем пипетирования вверх и вниз, а затем промывания 3 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) путем пипетирования вверх и вниз.
  3. Извлеките среду путем аспирации из планшета для культивирования тканей и разрежьте ткань на3 части размером 1 мм в стерильной планшете для культуры тканей с помощью двух стерильных лезвий и 2 мл питательной среды (усовершенствованный DMEM-F12 + 10 мг коллагеназы внутривенно/мл, 0,000625% трипсина-ЭДТА и 10 мкг/мл ДНКазы). Соберите ткань в пробирку объемом 50 мл с общим количеством питательной среды 5 мл и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C с механическим разложением на имеющемся в продаже оборудовании (см. таблицу материалов) или с периодическим перемешиванием образца путем пипетирования образца вверх и вниз.
  4. Добавьте 5 мл Advanced DMEM-F12, чтобы инактивировать трипсин, и отфильтруйте образец через ситечко для пор 70 мкм, чтобы удалить крупный мусор.
  5. Добавьте 2 мл DMEM с 10% FBS в верхнюю часть фильтра и соберите мусор и остатки тканей для создания культур фибробластов (см. шаг 5).
  6. Центрифугируют фильтрат при 200-300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирируют надосадочную жидкость, оставляя только клеточную гранулу. Добавьте 5 мл Advanced DMEM-F12 и центрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g.
  7. Ресуспендируйте гранулу в 4 мл аммонийно-хлоридно-калийного буфера (ACK, см. таблицу материалов). Пропустите смесь в пробирку объемом 15 мл и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 минут, чтобы лизировать эритроциты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта стадия лизиса эритроцитов может быть удалена, когда нет видимых признаков загрязнения.
  8. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирировать надосадочную жидкость. Добавьте 5 мл Advanced DMEM-F12 и центрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g.
  9. Добавьте 1 мл коммерчески доступного реагента для диссоциации клеток (см. таблицу материалов) с добавлением ДНКазы (1 мкг/мл) к клеточной грануле и инкубируйте в течение 2-3 минут при комнатной температуре.
  10. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин и аспирировать надосадочную жидкость. Добавьте 5 мл Advanced DMEM-F12 и повторно суспендируйте клеточную гранулу.
  11. Пипетку вверх и вниз 30 раз с помощью пипетки P1,000 для диссоциации клеток, центрифугируйте в течение 5 минут при 300 x g и удалите надосадочную жидкость.
  12. Возьмите наконечники для пипеток P1 000 и P200 из морозильной камеры с температурой −20 °C и повторно суспендируйте гранулы в мембранной матрице с помощью пипетки P1 000 и холодных наконечников (50 мкл на каплю с учетом объема гранул, шесть-семь куполов на лунку). Выньте из инкубатора предварительно нагретую пластину. Установите пипетку P200 на 48 мкл и используйте холодные наконечники для создания куполов матрицы базальной мембраны в предварительно нагретой 6-луночной планшете.
  13. Поместите планшет с матрицей-куполами матрицы базальной мембраны в инкубатор с 5%CO2 при температуре 37 °C на 15 минут для затвердевания матрицы базальной мембраны.
  14. Добавьте 2-2,5 мл Advanced DMEM-F12 с добавлением 20 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (EGF), 100 нг/мл человеческого фактора роста плаценты (PlGF), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (bFGF), 769 нг/мл инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) и 10,5 мкМ ингибитора ROCK (расширенный DMEM-F12 + факторы роста) (см. таблицу материалов).

3. Мониторинг органоидов

  1. Визуальный контроль культуры органоидов опухоли в течение первых 7 дней, а затем три раза в неделю.
  2. Меняйте среду два раза в неделю с помощью Advanced DMEM-F12, содержащего 20 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (EGF), 100 нг/мл человеческого фактора роста плаценты (PlGF), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (bFGF), 769 нг/мл инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) и ингибитора ROCK 10,5 мкМ (Advanced DMEM-F12 + факторы роста).
  3. Периодически делайте снимки культуры органоидов опухоли на 1-й, 3-й, 7-й, 10-й и 15-й день после обработки образца и нанесения культуры в матрицу, чтобы наблюдать за ростом и жизнеспособностью.

4. Прохождение и криохранение органоидов

  1. Извлеките питательную среду из 6-луночного планшета.
  2. Добавьте 1 мл соответствующего реагента для восстановления клеток (см. Таблицу материалов), чтобы диссоциировать матрицу базальной мембраны и получить клеточную суспензию, и восстановите надосадочную жидкость в пробирке объемом 15 мл. Если матрица не диссоциирует сразу, инкубируют образец при 4 °С в течение 15-20 мин до полного растворения.
  3. Добавьте 1 мл того же реагента для восстановления клеток, который использовался на этапе 4.2, в лунку планшета для извлечения дополнительных диссоциированных клеток и добавьте надосадочную жидкость в ту же пробирку объемом 15 мл, что и на этапе 4.2.
  4. Добавьте 5 мл холодного Advanced DMEM-F12 и центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут.
  5. Удалите надосадочную жидкость и тщательно высушите гранулы, удалив оставшуюся жидкость пипеткой объемом 5 мл; По возможности избегайте перемещения трубки. Ресуспендируйте клеточную гранулу в удвоенном объеме матрицы базальной мембраны, чтобы получить пассаж 1:2.
  6. Для криохранения органоидных культур гранулы, полученные на стадии 4,5, ресуспендируют в 1 мл замораживающей среды (10% ДМСО, 20% ФБС, 50% ДМЕМ-Ф12, ингибитор РОК 10,5 мкМ) и хранят при −80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем матрицы базовой мембраны может быть отрегулирован для выполнения различных проходов, например, 1:1 (используя тот же объем матрицы базальной мембраны, что и исходный) или 1:3 (добавляя в три раза больше исходного объема матрицы базальной мембраны).

5. Создание фибробластов

  1. После извлечения обломков и остатков тканей в 2 мл DMEM с 10% FBS, добавьте его в 6-луночную планшет и инкубируйте при 37 °C с 5% CO2.
  2. Удалить остатки тканей из культур фибробластов с этапа 2,5 путем аспирации среды через 2 дня или 3 дня после нанесения покрытия и заменить свежим ДМЕМ с 10% FBS.
  3. Визуальный контроль посева фибробластов проводится три раза в неделю и не реже двух раз в неделю меняется питательная среда, используя ДМЕМ с добавлением 10% FBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Важно задокументировать, как культивирование органоидов опухоли прогрессирует с течением времени, особенно в первые несколько недель, чтобы оценить, как культура будет вести себя в последующих анализах. На рисунке 2 показан пример оптимального выделения опухолевых клеток и создания опухолевого органоида из свежей ткани в течение 15 дней. Иногда в образце присутствует большой объем клеточного мусора, и трудно разглядеть развивающиеся опухолевые органоиды, как показано на рисунке 3. Кроме того, фенотип развивающихся органоидов может варьироваться от изолированных, округлых органоидов (рис. 4A) до сфероидных/агрегатоподобных культур (рис. 4B-D), и это зависит от происхождения опухоли. Фибробласты являются распространенным побочным продуктом создания первичной культуры опухолевых клеток из солидных опухолей, особенно с высоким содержанием стромы, и часто могут контаминировать органоидную культуру. На рисунке 5 показано, как эти клетки мигрировали из матричных куполов базальной мембраны и прилипли к культуральным планшетам примерно через 7 дней. Эти клетки потребляют питательные вещества из питательной среды, тем самым нарушая оптимальный рост органоидов.

Первичные фибробласты могут быть получены в виде изолированной культуры, когда они мигрируют из срезов ткани, прикрепляются к культуральным планшетам и растут как монослойная культура, как показано на рисунке 6. Этот протокол рекомендует использовать стандартную среду DMEM с 10% FBS для культивирования фибробластов. Однако можно использовать и специализированную среду для фибробластов. Адгезивные фибробласты видны примерно через 7 дней после нанесения покрытия (рис. 6).

Figure 1
Рисунок 1: Обработка свежих образцов тканей для установления опухолевых органоидов. Показана схема процесса подготовки опухолевого органоида, от расщепления тканей до покрытия органоидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Культура органоида опухоли, полученная из PDX, происходящей из свежей опухоли PDAC. Показано развитие культуры органоидов опухоли в течение нескольких дней с изображениями органоидов в одной микроскопической плоскости на 1-й, 3-й, 7-й, 10-й и 15-й день. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Примеры неоптимальной культуры органоидов опухоли на 2-е сутки с избытком клеточного мусора. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Установленные опухолевые органоиды из различных тканей PDAC PDX, демонстрирующие различия в размерах и морфологии. Опухолевые органоиды могут иметь (A) классический округлый фенотип или (B-D) более сфероидный/агрегатный вид. Средний размер органоидов колеблется от 80 мкМ до 100 мкм, хотя некоторые органоиды могут достигать 200 мкМ. Масштабная линейка: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Примеры неоптимальной культуры органоидов опухоли (А-С), контаминированной CAF/фибробластами после 30 дней культивирования. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Примеры первичных культур фибробластов, созданных из остатков переваренной первичной опухолевой ткани . (А) Конфлюентная культура. (Б) Неконфлюидная культура. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Устранение неполадок при культивировании органоидов опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Значительные достижения в фармакологической терапии рака являются сложной задачей, поскольку вероятность одобрения лекарств в клинических исследованиях I фазы онкологии составляет 5,1%, что является самым низким показателем среди всех типов заболевания23. Основная причина заключается в том, что рак очень неоднороден, и поэтому когорты пациентов не одинаково реагируют на данное лечение, как ожидалось, что подчеркивает необходимость более персонализированного подхода. Двумерные (2D) культуры использовались в трансляционных исследованиях рака в течение многих лет, но им не хватает структурной трехмерной организации, характерной для первичных опухолей. Таким образом, они неточно отражают реакцию пациента на терапию и коммуникацию опухолевых клеток друг с другом или с их микроокружением 3,23. Основной принцип всех систем 3D-культивирования заключается в том, чтобы способствовать взаимодействию клеток с окружающей средой и организовывать клетки пространственно значимым образом, подобно тому, как в первичной опухоли (in situ). Морфология опухолевых органоидов варьируется от круглых, массообразных и виноградовидных до звездчатых в зависимости от присущей культивируемым клеткам природы и условий культивирования, как показано на рисунке 4. Установленные опухолевые органоидные культуры, полученные от пациента, могут быть обработаны с помощью той же терапии первой линии, которая использовалась у пациента, чтобы подтвердить, что органоид опухоли повторяет клиническую ситуацию (т.е. ответ на клиническую терапию)1,13,24,25.

Органоиды опухоли также могут быть обработаны новыми фармакологическими агентами, что обеспечивает исследовательский подход к выявлению новых методов лечения, которые могут быть использованы в последующих линиях лечения в клинике, когда стандартные варианты терапии будут исчерпаны. Бактериологическое исследование проводится непрерывно для оценки реакции опухолевых органоидных культур на препарат в режиме реального времени. Технико-экономическое обоснование молекулярной и иммуногистохимической характеристики опухоли ксенотрансплантата пациента (PDX) и органоидов, полученных из PDX, показало, что морфология, экспрессия белка и геномные изменения были сопоставимы между двумя моделями. Кроме того, исследование фармакотипирования, подтверждающее концепцию, показало, что прогнозы in vivo и ex vivo также сопоставимы, и, таким образом, был сделан вывод о том, что использование органоидов опухоли в качестве модели рака/заболевания является осуществимым и надежным подходом, который может быть применен в клинических условиях2.

Ряд проблем, связанных с созданием опухолевых органоидных культур, происходящих из различных типов опухолей, был освещен в настоящем документе и недавно рассмотрен26,27,28. Основные проблемы включают в себя «загрязнение/чрезмерный рост» здоровыми клетками, которые образуют органоиды с более высокой скоростью роста, чем раковые клетки, высокую стоимость культивирования по сравнению с 2D-культурами, низкую скорость укоренения, несоответствия в профиле соматических мутаций и гистологии между культурой ex vivo и опухолью происхождения, первичную гетерогенность опухоли, использование мышиного внеклеточного матрикса, которые могут быть неоптимальными для клеток человека и препятствовать доставке лекарств, отсутствие ТМЭ и ассоциированных клеток, интерференция факторов роста или молекулярных ингибиторов с реакцией на лекарственное средство, а также отсутствие стандартизированных и валидированных протоколов для создания и поддержания опухолевых органоидов. Тем не менее, с годами использование моделей первичных опухолей в исследованиях рака расширилось, а методы культивирования и поддержания первичных культур улучшились. Эти деликатные культуры ex vivo создаются и поддерживаются путем добавления добавок, способствующих росту и стабильности клеток. Ингибитор Ро-киназы (РОК) в настоящее время рутинно добавляют в первичные культуры, чтобы избежать апоптоза и усилить клеточную адгезию, тем самым способствуя долгосрочному распространению стабильных первичных культур in vitro 29. Кроме того, он также увеличивает выживаемость размороженных криоконсервированных стволовых клеток, что важно при создании замороженных запасов органоидных культур29. Добавки с гепарином также могут быть использованы для усиления экспансии стволовых клеток за счет увеличения передачи сигналов WNT и FGF и, таким образом, пролиферации клеток30. Другие важные реагенты, используемые в этом валидированном протоколе для оптимизации установления органоидов опухоли, включают аккутазу и ДНКазу. Аккутаза - это щадящий реагент для пищеварения, рекомендуемый для сегрегации отдельных стволовых клеток или отделения их от поверхности культуры, и он помогает поддерживать жизнеспособность клеток лучше, чем использование других реагентов, предназначенных для этой цели, таких как трипсин31. Тем не менее, коллагеназы также могут быть использованы для специфического воздействия на тип коллагена, встроенный в мембрану биологического основания. ДНКаза используется в методах выделения клеток в течение многих лет32 для удаления остатков ДНК из мертвых и некротизированных клеток во время протокола экстракции и, таким образом, предотвращения слипания/агрегации клеток из-за повышенной вязкости пробоподготовки. Клеточные гранулы часто обрабатывают лизисным буфером, но этот этап может быть исключен, если нет видимых признаков загрязнения образца ткани эритроцитами8 (Дополнительный файл 1).

Успешное создание органоидов опухоли не обходится без присущих ему биологических осложнений. В идеале ткани для опухолевых органоидных культур должны быть обработаны в тот же день, что и забор, чтобы оптимизировать жизнеспособность клеток. Замораживание тканей не всегда рекомендуется, так как это может значительно снизить жизнеспособность клеток. Тем не менее, опухолевые органоиды могут быть установлены с использованием образцов, которые были мгновенно заморожены или медленно криоконсервированы в ДМСО-содержащей замораживающей среде33,34, что позволяет отправлять образцы и хранить их в биобанкинге. В некоторых случаях возможно получение 2D-культур из культур органоидов опухолей, которые были пассированы несколько раз, путем восстановления опухолевых клеток, прикрепленных к пластинам, после удаления куполов матрицы базальной мембраны. По нашему опыту, вероятность успешного установления органоидов опухоли значительно выше при использовании ткани PDX PDAC, чем при использовании свежей ткани PDAC, полученной из резецированного образца4. Это связано с тем, что обычно доступны более крупные куски свежей ткани PDX PDAC, и эта ткань имеет более высокую клеточность, вероятно, из-за более гостеприимной среды in vivo, обеспечиваемой моделью PDX по сравнению с подходами, основанными на ex vivo. В питательную среду можно добавлять нетоксичные агенты для контроля жизнеспособности клеток и пролиферации культуры. Кроме того, необходимо избегать чрезмерного роста неопухолевых органоидов с помощью селективных условий35,36. Ткань поджелудочной железы может содержать пищеварительные ферменты, которые могут повлиять на жизнеспособность изолированных опухолевых клеток; Таким образом, трипсин может быть добавлен на стадию пищеварения, чтобы преодолеть эту проблему4. Многие другие факторы, такие как состояние пациента/ткани (т.е. лечено или не лечено онкологической терапией), тип опухоли, загрязнение образца из операционной и исходная степень опухоли, также могут существенно влиять на способность установить органоид опухоли. Кроме того, не каждая ткань имеет достаточное количество жизнеспособных опухолевых клеток для создания первичных культур. Это особенно верно для опухолей PDAC, которые, как известно, богаты стромой (примерно 90%-95%) и содержат небольшой процент эпителиальных опухолевых клеток. Кроме того, ткани с высоким содержанием стромы может быть трудно разрезать и диссоциировать для получения единичных опухолевых клеток для культивирования. Могут быть добавлены специализированные и коммерчески доступные среды для пищеварения, или также может быть использовано оборудование для механической диссоциации, если ткань не полностью переваривается. В качестве альтернативы можно добиться полной диссоциации тканей путем непрерывного разрезания двумя лезвиями скальпеля до тех пор, пока ткань не приобретет полужидкий вид (см. видеодемонстрацию).

Во время процедуры есть много технических подводных камней, которые также необходимо выделить. Например, остатки тканей могут заблокировать фильтр, и тогда фильтр необходимо заменить, так как остатки препятствуют прохождению жидкой надосадочной жидкости. Этап фильтрации можно повторять несколько раз, чтобы восстановить максимальное количество диссоциированных опухолевых клеток. Кроме того, важно проверять гранулы клеток после каждого этапа центрифугирования, так как иногда трудно заметить низкое количество клеток. Пипетирование гранул клеток должно выполняться осторожно и медленно, так как агрессивное пипетирование может привести к потере клеток или снижению жизнеспособности клеток. Кроме того, при приготовлении смеси матрикс-ячейка следует использовать среду, предварительно охлажденную до 4 °C, и охлажденные наконечники, хранящиеся при температуре −20 °C, так как матрица быстро затвердевает. Наконец, как упоминалось выше, ДНКаза помогает предотвратить слипание клеток во время подготовки образцов. Также рекомендуется аликвотировать реагенты, используемые в протоколе, и готовить смеси факторов роста, чтобы избежать повторного замораживания-оттаивания реагентов.

Выделение первичных фибробластов представляет интерес, так как они являются важным типом клеток в PDAC и могут быть использованы для последующих экспериментов по кокультуре для определения влияния TME на рост опухолевых клеток. Примерно через 1 неделю фибробласты мигрируют из срезов ткани, и обычно их можно увидеть прикрепленными к культуральным планшетам и растущими в виде монослойной культуры. Однако наличие фибробластов в культуре имеет и недостатки, так как они потребляют питательные вещества из питательной среды и, таким образом, нарушают оптимальный рост опухолевых органоидов. Планшеты со сверхнизким прикреплением (ULA) часто рекомендуются для культивирования опухолевых органоидов для ограничения роста фибробластов, поскольку они легко прикрепляются к стандартным планшетам, обработанным клеточной культурой. Этот валидированный протокол рекомендует использовать стандартные среды DMEM с 10% FBS для культивирования первичных фибробластов, хотя могут также использоваться специализированные среды для фибробластов.

Важно документировать состояние опухолевой органоидной культуры с течением времени, особенно в течение первой недели, поскольку культура ведет себя по-разному в зависимости от качества, количества и источника ткани (первичные операбельные опухоли человека и PDX). В питательную среду можно добавлять нетоксичные агенты для контроля жизнеспособности клеток и пролиферации культуры. Посевы необходимо визуально контролировать ежедневно в течение первых 7 дней, а затем два-три раза в неделю. Кроме того, среду необходимо менять каждые 4-5 дней или когда она становится кислой (желтой), стараясь не повредить матричные купола мембраны основания. Сначала из-за высокой плотности клеток могут появляться крупные коричневые комки. Однако он должен исчезнуть после первого пассажа, что позволит получить четко очерченные опухолевые органоиды на четком фоне матрицы базальной мембраны. Рекомендуется фотографировать органоиды опухоли, особенно в течение первых 3 недель, чтобы определить визуальный фенотип и скорость роста органоидов опухоли. Прохождение культуры органоидов опухоли также является технической проблемой. Как правило, питательная среда удаляется, а купола матрицы дисассоциируются трипсиновыми или специализированными реагентами при 4 °C до полного растворения матрицы базальной мембраны. Затем гранула ячейки ресуспендируется в свежей матрице, и объем регулируется для выполнения желаемого прохода, например, 1:1 (используя тот же объем матрицы, что и исходный) или 1:3 (добавляя в три раза больше первоначального объема подхода). Группа Дэвида Тувесона, состоящая из экспертов в области органоидов поджелудочной железы, предоставляет онлайн-ресурсы с протоколами для создания, поддержания и окрашивания органоидов поджелудочной железы37.

Органоиды опухолей ex vivo , полученные от пациентов, представляют собой ценную доклиническую модель для оценки чувствительности пациента к лечению для применения в персонализированной медицине. Кроме того, эти модели являются более физиологически значимыми моделями опухолей по сравнению с традиционными 2D-монослоями адгезивных клеток. В области моделирования опухолей необходима четкая и последовательная номенклатура 3D-моделей опухолей с периодическим фотографическим и описательным наблюдением за культурой. Кроме того, работа со стандартизированными протоколами имеет первостепенное значение для успеха этой технологии в клинике при определении чувствительности к лекарственным препаратам в зависимости от конкретного пациента. Исследователи, использующие эту технологию, должны знать о препятствиях и подводных камнях этих чувствительных и сложных моделей. Тем не менее, работа с проверенным протоколом и четко определенными условиями и вариантами устранения неполадок поможет избежать технических проблем и оптимизировать установление и поддержание культуры. Здесь предоставляется валидированный протокол для создания опухолевых органоидов и выделения фибробластов, который может быть легко внедрен во многих трансляционных онкологических лабораториях со стандартным оборудованием и опытом культивирования тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никакой.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано финансированием Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), Программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 857381, проект VISION (Стратегии укрепления научного превосходства и инновационного потенциала для ранней диагностики рака желудочно-кишечного тракта), Очный конкурс на новые исследовательские проекты для клинических исследователей и новых исследовательских групп IRYCIS (2021/0446), Проект органоидов, полученных из пациентов 2.0 (CIBERONC) и проект TRANSCAN II JTC 2017 «Создание алгоритма ранней диагностики и последующего наблюдения за пациентами с нейроэндокринными опухолями поджелудочной железы (NExT)», номер гранта 1.1.1.5/ERANET/20/03. Биологические образцы, использованные в этом протоколе, были предоставлены больницей BioBank Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) и интегрированы в платформу биобанков и биомоделей ISCIII (PT20/00045). Мы также хотели бы поблагодарить Ивонн Коль (Yvonne Kohl), Агапи Катаки (Agapi Kataki Vita Rovita) и Торстена Кнолла (Thorsten Knoll) за их неоценимую поддержку в разработке этого протокола в рамках проектов NExT и VISION.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well Costar Ultra-low Attachment plates Biofil TCP011006
70 μm pore strainer VWR 732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer Gibco A10492-01
Amphotericin B Gibco 15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) Nuaire NU-4750E
Cell recovery solution Corning  354253
Collagenase IV Gibco 17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES Gibco 31330-038
DNase Roche 10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-079-CV
Freezing container, Nalgene Merck C1562
gentleMACS Octo Dissociator Milteny Biotec 130-096-427
HEPES Gibco 15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF) enQuireBio QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice Janvier, France 
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) Invitrogen RP10931
L-Glutamine Corning 354235
Matrigel Basement Membrane Matrix  Corning 356234
Normocin InvivoGen ant-nr-2
Pasteur pipettes Deltalab 200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x) Corning 30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Gibco PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Gibco PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL 72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501
Surgical Blades Nahita FMB018
Trypsin Gibco 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
  2. Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids - A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
  3. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  4. Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
  5. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
  6. Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
  7. April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
  8. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
  9. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  10. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
  11. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
  12. Barbáchano, A., et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers. 13 (11), 2657 (2021).
  13. Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
  14. Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H. Current concepts in tumour-derived organoids. British Journal of Cancer. 123 (8), 1209-1218 (2020).
  17. Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
  18. Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
  19. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  20. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  21. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  22. Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
  23. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  24. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
  25. Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
  26. Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
  27. Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
  28. Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
  29. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  30. Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
  31. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
  32. Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
  33. Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
  34. Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
  35. Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
  36. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  37. Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab. , Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023).

Tags

Исследование рака выпуск 195 Фибробласты Модели опухолей ex vivo Первичные опухолевые ткани Трансляционные исследования рака Чувствительность и резистентность к лечению Межклеточные взаимодействия Микроокружение опухоли Методы культивирования Коктейли факторов роста Биологическая базальная мембрана Сбор образцов тканей Биобанкинг и хранение Лабораторные возможности СОП/протокол Аденокарцинома поджелудочной железы Ксенотрансплантаты пациента (PDX) Культура тканей Средства для мышей
Получение опухолевых органоидов и фибробластов рака поджелудочной железы из свежих тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Díaz-Alejo, J. F., April-Monn,… More

Díaz-Alejo, J. F., April-Monn, S., Cihova, M., Buocikova, V., Villalón López, J., Urbanova, M., Lechuga, C. G., Tomas, M., Dubovan, P., Sánchez, B. L., Páez, S. C., Sanjuanbenito, A., Lobo, E., Romio de la Heras, E., Guerra, C., de la Pinta, C., Barreto Melian, E., Rodríguez Garrote, M., Carrato, A., Ruiz-Cañas, L., Sainz, Jr., B., Torres, A., Smolkova, B., Earl, J. Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue. J. Vis. Exp. (195), e65229, doi:10.3791/65229 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter