Summary
Los organoides tumorales han revolucionado la investigación del cáncer y el enfoque de la medicina personalizada. Representan un modelo tumoral clínicamente relevante que permite a los investigadores estar un paso por delante del tumor en la clínica. Este protocolo establece organoides tumorales a partir de muestras frescas de tejido tumoral pancreático y xenoinjertos derivados de pacientes de origen adenocarcinoma de páncreas.
Abstract
Los organoides tumorales son modelos tumorales ex vivo tridimensionales (3D) que recapitulan las características biológicas clave de los tejidos tumorales primarios originales. Los organoides tumorales derivados de pacientes se han utilizado en la investigación traslacional del cáncer y se pueden aplicar para evaluar la sensibilidad y la resistencia al tratamiento, las interacciones entre células y las interacciones de las células tumorales con el microambiente tumoral. Los organoides tumorales son sistemas de cultivo complejos que requieren técnicas avanzadas de cultivo celular y medios de cultivo con cócteles específicos de factores de crecimiento y una membrana basal biológica que imita el entorno extracelular. La capacidad de establecer cultivos tumorales primarios depende en gran medida del tejido de origen, la celularidad y las características clínicas del tumor, como el grado tumoral. Además, la recogida de muestras de tejido, la calidad y cantidad del material, así como el correcto biobanco y almacenamiento son elementos cruciales de este procedimiento. Las capacidades técnicas del laboratorio también son factores cruciales a tener en cuenta. Aquí, reportamos un SOP/protocolo validado que es técnica y económicamente factible para el cultivo de organoides tumorales ex vivo a partir de muestras de tejido fresco de origen adenocarcinoma de páncreas, ya sea a partir de tejido fresco de donante de paciente resecado primario o xenoinjertos derivados del paciente (PDX). La técnica descrita en este documento se puede realizar en laboratorios con instalaciones básicas de cultivo de tejidos y ratones y está diseñada para una amplia aplicación en el campo de la oncología traslacional.
Introduction
Los organoides tumorales son cultivos organizados tridimensionales (3D) ex vivo que se derivan de tejido tumoral fresco y proporcionan modelos de cáncer. Los organoides tumorales recapitulan las características biológicas clave del tumor primario original 1,2,3,4 y pueden expandirse hasta varios meses y criopreservarse, de forma similar a las líneas celulares inmortalizadas convencionales. Los organoides tumorales proporcionan un biobanco de modelos tumorales derivados de pacientes para la medicina traslacional/personalizada5 y representan un avance importante en los sistemas/modelos de biología de células cancerosas. Los organoides tumorales derivados del paciente pueden utilizarse como modelos ex vivo para predecir la eficacia de las terapias oncológicas/farmacológicas (neo)adyuvantes, para las cuales se establecen cultivos a partir de tejido tumoral fresco y se realizan ensayos de sensibilidad a los fármacos o farmacotipado específicos para cada paciente con el fin de identificar agentes eficaces para las líneas terapéuticas posteriores 1,4. Además, los organoides tumorales superan la limitación de la disponibilidad de tejido tumoral primario y, lo que es más importante, proporcionan un excelente sistema alternativo o complementario a los modelos de ratón in vivo, como los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX)2. La complejidad de los organoides tumorales aumenta si las células tumorales primarias se combinan con células estromales que se encuentran en el microambiente tumoral (TME), como los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), las células endoteliales y las células inmunitarias, que imitan el funcionamiento y la celularidad compleja del tumor primario. Se han establecido organoides tumorales para muchos tipos de tumores utilizando protocolos estandarizados 6,7,8,9,10. La propagación de organoides a partir de diferentes tumores sólidos, incluyendo tejido colorrectal y de cáncer de mama, está bien establecida y es técnicamente asequible 11,12,13,14,15.
Las resecciones quirúrgicas de tumores o biopsias tumorales proporcionan muestras de tejido tumoral primario. Idealmente, las muestras de tejido tumoral deben provenir del centro de la masa tumoral o del borde invasor del tumor, así como del tejido de aspecto normal adyacente al tumor. En comparación con los cultivos 2D convencionales, los organoides tumorales requieren varios "complementos", incluida una membrana basal biológica (como Matrigel, hidrogel o un andamio a base de colágeno), que imita la TME extracelular, y un medio de crecimiento líquido que suministra nutrientes y factores de crecimiento específicos y apoya la proliferación celular y la viabilidad en el cultivo16.
Los pasos más básicos en el cultivo celular primario son el lavado del tejido en solución salina para evitar la contaminación, el corte/digestión mecánica del tumor en pequeños trozos de 1-3mm3 y el tratamiento con colagenasa para la digestión enzimática del tejido. A continuación, la mezcla digerida se filtra para eliminar fragmentos de tejido grandes, se resuspende en una membrana basal biológica como Matrigel, y se siembra como cúpulas en placas de cultivo de baja adherencia para mejorar el crecimiento sin adherencia. Los domos de la matriz de la membrana basal se cubren con medio de cultivo líquido y se suplementan con glutamina y antibióticos para evitar la contaminación, así como con factores de crecimiento específicos según el tipo de tejido 7,8,9,16,17. También se pueden aislar otras células relevantes presentes en el tumor a granel y en la EMT, como los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y las células inmunitarias. Esta técnica, que ha sido revisada recientemente18, permite el establecimiento de cocultivos con diferentes tipos celulares para estudiar la respuesta a la terapia en un entorno tumoral más "realista". Además, se pueden estudiar las interacciones célula-célula y la interacción entre las células tumorales y los componentes de la matriz biológica circundante.
La tasa de éxito reportada para el establecimiento de organoides tumorales utilizando tejido fresco de biopsias o tejido tumoral gastrointestinal resecado es de alrededor del 50%11, y la tasa de éxito de este último depende en gran medida del tipo de tejido y el origen4, particularmente el grado tumoral y la celularidad general del tumor. Los modelos tumorales tridimensionales tienen una complejidad variable, desde simples agregados unicelulares hasta modelos de ingeniería altamente complejos que constan de varios tipos de células. La terminología utilizada para describir los cultivos 3D en la literatura es muy inconsistente 19,20,21, ya que se utilizan diferentes términos como esferoides, tumoresferas y organoides, aunque la diferencia entre ellos no está clara. Como aún no se ha llegado a un consenso claro sobre la definición, en este artículo se describe un organoide tumoral como un cultivo organizado de células tumorales incrustado en una membrana basal biológica.
En este artículo, se presenta un protocolo validado para el establecimiento de organoides tumorales a partir de muestras de tejido fresco procedentes de adenocarcinoma ductal de páncreas (PDAC) resecado primario fresco o derivado de PDX, y este protocolo se puede realizar en la mayoría de los laboratorios con instalaciones básicas de cultivo de tejidos. Este protocolo ha sido adaptado de varios protocolos reportados de última generación que se utilizan actualmente para establecer organoides tumorales o tumoroides a partir de tejido tumoral digestivo de los grupos de David Tuveson9, Hans Clevers8 y Aurel Perren7.
Este protocolo no analiza cómo se recolecta el tejido fresco. Para obtener tejido tumoral humano fresco de alta calidad, es importante tener una coordinación eficiente entre los cirujanos que extraen el tejido y el departamento de patología que extrae la muestra de tejido para el cultivo de organoides. Del mismo modo, cuando se utiliza PDX como fuente de tejido fresco, también es importante una coordinación eficiente con la persona que recolecta la muestra de tejido. Es fundamental obtener la muestra de tejido lo más rápido posible (dentro de los 30-60 minutos posteriores al momento de la recolección) para mantener una alta calidad.
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Protocol
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el bienestar de los animales de experimentación aprobadas por el Comité de Ética de la Universidad Autónoma de Madrid (CEI 103-1958-A337) y la Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) y de acuerdo con las directrices de Conducta Ética en el Cuidado y Uso de los Animales recogidas en los Principios Rectores Internacionales para la Investigación Biomédica con Animales. desarrollado por el Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas (CIOMS). El protocolo siguió los principios éticos para la investigación biomédica con el consentimiento informado por escrito. Se obtuvo la aprobación ética previa para el uso de tejido fresco para el establecimiento de los cultivos de organoides tumorales. Las muestras fueron proporcionadas por el Biobanco Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (Registro Nacional de Biobancos B.0000678), integradas en la Plataforma de Biobancos y Biomodelos del ISCIII (PT20/00045), y procesadas siguiendo procedimientos normalizados de operación con la oportuna aprobación ética. Los tumores se implantaron por vía subcutánea, como se describió anteriormente22, en ratones desnudos hembra NU-Foxn1nu de 6 semanas de edad inmunocomprometidos (ver Tabla de materiales) y se dejaron pasar in vivo para establecer PDAC PDX.
1. Preparación experimental
- Manipule muestras humanas en una cabina de bioseguridad de clase II.
- Use una bata de laboratorio, guantes protectores y anteojos durante todo el procedimiento para evitar la infección por patógenos transmitidos por los tejidos.
NOTA: Se requiere un mínimo de 3 h para procesar la muestra de tejido fresco y colocar la placa en los organoides y fibroblastos. - Procesar las muestras de tejido fresco 22 en un plazo máximo de24 h desde la recolección, y almacenar a 4 °C en medio de cultivo de tejidos (DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina) hasta su procesamiento.
- Mantenga todas las muestras y reactivos en el hielo durante todo el procedimiento, y asegúrese de preajustar una centrífuga refrigerada a 4 °C y utilizarla a baja velocidad para evitar dañar la preparación de la célula.
- Guarde las puntas de pipeta P1.000 y P200 en un congelador a -20 °C para utilizarlas durante el protocolo.
- Alícuota la matriz de la membrana basal (ver Tabla de Materiales) antes de su uso. Para este protocolo, se recomiendan alícuotas de 250 ml.
2. Procesamiento de tejido tumoral primario fresco para establecer organoides tumorales y fibroblastos primarios
NOTA: Se requiere un mínimo de 3 h para procesar la muestra de tejido fresco (ya sean tumores humanos primarios resecables o PDX) y para colocar placas en los organoides tumorales y fibroblastos. En la Figura 1 se muestra un esquema del proceso de preparación de los organoides, desde la digestión de los tejidos hasta la siembra de los organoides tumorales. Antes de iniciar el protocolo, saque una alícuota de la matriz de la membrana basal del congelador a -20 °C y déjela en hielo durante aproximadamente 30-60 minutos antes de su uso.
- Coloque una placa de cultivo de 6 pocillos en una incubadora de cultivo celular a 37 °C 3 h antes de sembrar los organoides.
- Mida, fotografíe y lave el tejido (paso 1.3) con 3 ml de Advanced DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mix F-12 Ham (F12), suplementado con 5 % de suero fetal bovino (FBS), 15 mM de Hepes, 1 % de L-glutamina, 1 % de penicilina-estreptomicina, 125 ng/ml de anfotericina B, 0,1 mg/ml de normocina) (consulte la Tabla de materiales) pipeteando hacia arriba y hacia abajo y luego lave con 3 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Retire el medio por aspiración de la placa de cultivo de tejidos y corte el tejido en trozos de1 mm 3 en una placa de cultivo de tejidos estéril utilizando dos cuchillas estériles y 2 ml de medio de digestión (DMEM-F12 avanzado + 10 mg de colagenasa IV/ml, 0,000625 % de tripsina-EDTA y 10 μg/ml de DNasa). Recoger el tejido en un tubo de 50 ml con un total de 5 ml de medios de digestión e incubar durante 1 h a 37 °C con digestión mecánica con equipos disponibles en el mercado (véase la tabla de materiales) o con mezcla periódica de la muestra, pipeteando la muestra hacia arriba y hacia abajo.
- Agregue 5 ml de DMEM-F12 avanzado para inactivar la tripsina y filtre la muestra a través de un filtro de poros de 70 μm para eliminar los desechos grandes.
- Agregue 2 ml de DMEM con FBS al 10% en la parte superior del filtro y recoja los desechos y restos de tejido para establecer cultivos de fibroblastos (consulte el paso 5).
- Centrifugar el filtrado a 200-300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante, dejando solo el gránulo de la célula. Agregue 5 ml de Advanced DMEM-F12 y centrifugue durante 5 minutos a 300 x g.
- Vuelva a suspender el gránulo en 4 ml de tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio (ACK, consulte la Tabla de materiales). Pasar la mezcla a un tubo de 15 ml e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos para lisar los glóbulos rojos.
NOTA: Este paso de lisis de glóbulos rojos se puede eliminar cuando no hay evidencia visible de contaminación. - Centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Agregue 5 ml de Advanced DMEM-F12 y centrifugue durante 5 minutos a 300 x g.
- Añada 1 ml de reactivo de disociación celular disponible en el mercado (consulte la tabla de materiales) suplementado con DNasa (1 μg/ml) al gránulo celular e incube durante 2-3 minutos a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min, y aspirar el sobrenadante. Agregue 5 ml de Advanced DMEM-F12 y vuelva a suspender el gránulo celular.
- Pipetear hacia arriba y hacia abajo 30 veces con una pipeta P1.000 para disociar las células, centrifugar durante 5 minutos a 300 x g y eliminar el sobrenadante.
- Tome las puntas de pipeta P1.000 y P200 del congelador a -20 °C y vuelva a suspender el gránulo celular en la matriz de membrana utilizando una pipeta P1.000 y puntas frías (50 μL por gota, teniendo en cuenta el volumen del gránulo, de seis a siete cúpulas por pocillo). Saque la placa previamente calentada de la incubadora. Ajuste una pipeta P200 a 48 μL y utilice puntas frías para crear cúpulas de la matriz de la membrana basal en la placa precalentada de 6 pocillos.
- Coloque la placa con las cúpulas de la matriz de la membrana basal en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 15 minutos para solidificar la matriz de la membrana basal.
- Añadir 2-2,5 ml de DMEM-F12 avanzado, suplementado con 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF), 100 ng/ml de factor de crecimiento de placenta humana (PlGF), 10 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos recombinantes (bFGF), 769 ng/ml de factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1) y 10,5 μM de inhibidor de ROCK (DMEM-F12 avanzado + factores de crecimiento) (ver Tabla de materiales).
3. Seguimiento de los organoides
- Monitoree visualmente el cultivo de organoides tumorales durante los primeros 7 días y luego tres veces por semana a partir de entonces.
- Cambie el medio dos veces por semana con DMEM-F12 avanzado que contiene 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano (EGF) recombinante, 100 ng/ml de factor de crecimiento de placenta humana (PlGF), 10 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos recombinantes (bFGF), 769 ng/ml de factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1) y 10,5 μM de inhibidor de ROCK (DMEM-F12 avanzado + factores de crecimiento).
- Capturar imágenes del cultivo de organoides tumorales periódicamente los días 1, 3, 7, 10 y 15 después de procesar la muestra y sembrar el cultivo en la matriz para observar el crecimiento y la viabilidad.
4. Paso y crioalmacenamiento de los organoides
- Retire el medio de cultivo de la placa de 6 pocillos.
- Añadir 1 mL de un reactivo de recuperación celular apropiado (ver Tabla de Materiales) para disociar la matriz de la membrana basal y obtener una suspensión celular, y recuperar el sobrenadante en un tubo de 15 mL. Si la matriz no se disocia inmediatamente, incubar la muestra a 4 °C durante 15-20 min hasta que se disuelva por completo.
- Añada 1 ml del mismo reactivo de recuperación celular utilizado en el paso 4.2 al pocillo de la placa para recuperar células disociadas adicionales y añada el sobrenadante al mismo tubo de 15 ml que en el paso 4.2.
- Añadir 5 ml de DMEM-F12 avanzado frío y centrifugar a 200 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y seque el gránulo con cuidado eliminando cualquier resto de líquido con una pipeta de 5 ml; Evite mover el tubo tanto como sea posible. Resuspender el pellet celular en el doble del volumen original de la matriz de la membrana basal para obtener un paso de 1:2.
- Para el crioalmacenamiento de los cultivos de organoides, resuspender el pellet obtenido en el paso 4.5 en 1 mL de medio de congelación (10% DMSO, 20% FBS, 50% DMEM-F12, 10.5 μM inhibidor de ROCK) y almacenar a -80 °C.
NOTA: El volumen de la matriz de la membrana basal se puede ajustar para realizar diferentes pasos, como 1:1 (usando el mismo volumen de matriz de la membrana basal que el original) o 1:3 (agregando tres veces el volumen original de la matriz de la membrana basal).
5. Establecimiento de fibroblastos
- Después de recuperar los restos de residuos y tejidos en 2 mL de DMEM con 10% de FBS, añadir esto a una placa de 6 pocillos e incubar a 37 °C con 5% de CO2.
- Eliminar los restos de tejido de los cultivos de fibroblastos del paso 2.5 mediante la aspiración del medio 2 días o 3 días después de la siembra, y reemplazarlos con DMEM fresco con FBS al 10%.
- Monitorizar visualmente el cultivo de fibroblastos tres veces por semana, y cambiar el medio de cultivo al menos dos veces por semana utilizando DMEM suplementado con FBS al 10%.
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Representative Results
Es importante documentar cómo progresa el cultivo de organoides tumorales a lo largo del tiempo, especialmente en las primeras semanas, para estimar cómo se comportará el cultivo en los ensayos posteriores. La figura 2 muestra un ejemplo de aislamiento óptimo de células tumorales y establecimiento de organoides tumorales a partir de tejido fresco durante un período de 15 días. A veces, hay un gran volumen de restos celulares en la muestra y es difícil ver los organoides tumorales en desarrollo, como se muestra en la Figura 3. Además, el fenotipo de los organoides en desarrollo puede variar desde organoides aislados y redondeados (Figura 4A) hasta cultivos esferoides/agregados (Figura 4B-D), y esto depende del origen del tumor. Los fibroblastos son un subproducto común del establecimiento de cultivos de células tumorales primarias a partir de tumores sólidos, especialmente aquellos con un alto contenido de estroma, y a menudo pueden contaminar el cultivo de organoides. La Figura 5 muestra cómo estas células migraron desde los domos de la matriz de la membrana basal y se adhirieron a las placas de cultivo después de aproximadamente 7 días. Estas células consumen los nutrientes del medio de cultivo, comprometiendo así el crecimiento óptimo de los organoides.
Los fibroblastos primarios se pueden obtener como un cultivo aislado cuando migran fuera de las secciones de tejido, se adhieren a las placas de cultivo y crecen como un cultivo de una sola capa, como se muestra en la Figura 6. Este protocolo recomienda el uso de medio DMEM estándar con 10% de FBS para el cultivo de los fibroblastos. Sin embargo, también se puede utilizar un medio especializado para fibroblastos. Los fibroblastos adherentes son visibles aproximadamente 7 días después de la siembra (Figura 6).
Figura 1: Procesamiento de muestras de tejido fresco para establecer organoides tumorales. Se muestra un esquema del proceso de preparación de organoides tumorales, desde la digestión de los tejidos hasta la siembra de los organoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cultivo de organoides tumorales establecido a partir de una PDX originada en un tumor PDAC fresco. Se muestra la progresión del cultivo de organoides tumorales a lo largo de varios días, con imágenes de los organoides en un plano microscópico en el día 1, el día 3, el día 7, el día 10 y el día 15. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de un cultivo de organoides tumorales no óptimo en el día 2 con exceso de restos celulares. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Organoides tumorales establecidos de diferentes tejidos PDAC PDX que muestran diferencias en tamaño y morfología. Los organoides tumorales pueden tener un fenotipo redondeado clásico (A) o (B-D) una apariencia más esferoide/de tipo agregado. El tamaño promedio de los organoides oscila entre 80 uM y 100 uM, aunque algunos organoides pueden ser tan grandes como 200 uM. Barra de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplos de un cultivo de organoides tumorales (A-C) no óptimo contaminado con CAFs/fibroblastos después de 30 días en cultivo. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ejemplos de cultivos primarios de fibroblastos establecidos a partir de los restos del tejido tumoral primario digerido . (A) Cultivo confluente. (B) Cultura no confluente. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Solución de problemas del establecimiento de cultivo de organoides tumorales. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Los grandes avances en las terapias farmacológicas contra el cáncer son un reto, ya que la probabilidad de aprobación de fármacos en ensayos clínicos oncológicos de fase I es del 5,1%, que es la más baja de todos los tipos de enfermedades23. La razón principal es que el cáncer es muy heterogéneo y, por lo tanto, las cohortes de pacientes no responden de manera uniforme como se espera al tratamiento dado, lo que pone de manifiesto que se necesita un enfoque más personalizado. Los cultivos bidimensionales (2D) se han utilizado en la investigación traslacional del cáncer durante muchos años, pero carecen de la organización estructural 3D que se encuentra en los tumores primarios. Por lo tanto, no reflejan con precisión las respuestas terapéuticas de los pacientes y la comunicación de las células tumorales entre sí o con su microambiente 3,23. El principio básico subyacente de todos los sistemas de cultivo 3D es promover la interacción celular con el entorno y organizar las células de una manera espacialmente relevante, similar a la del tumor primario (in situ). La morfología de los organoides tumorales varía de redonda, masiva y parecida a uva a estrellada, dependiendo de la naturaleza inherente de las células cultivadas y de las condiciones de cultivo utilizadas, como se muestra en la Figura 4. Los cultivos de organoides tumorales derivados de pacientes establecidos pueden tratarse con el mismo tratamiento de primera línea utilizado en el paciente para confirmar que el organoide tumoral recapitula la situación clínica (es decir, la respuesta clínica al tratamiento)1,13,24,25.
Los organoides tumorales también se pueden tratar con nuevos agentes farmacológicos, lo que proporciona un enfoque exploratorio para identificar nuevas terapias que podrían usarse en líneas de tratamiento posteriores en la clínica cuando se hayan agotado las opciones terapéuticas estándar. El cultivo se monitoriza continuamente para evaluar la respuesta de los cultivos de organoides tumorales al agente en tiempo real. Un estudio de factibilidad de la caracterización molecular e inmunohistoquímica de tumores de xenoinjerto (PDX) derivados de pacientes y organoides derivados de PDX mostró que la morfología, la expresión de proteínas y las alteraciones genómicas fueron comparables entre los dos modelos. Además, un estudio de prueba de concepto de farmacotipado mostró que las predicciones in vivo y ex vivo también eran comparables y, por lo tanto, concluyó que el uso de organoides tumorales como modelo de cáncer/enfermedad es un enfoque factible y robusto que se puede aplicar en el entorno clínico2.
En este trabajo se han destacado una serie de desafíos relacionados con el establecimiento de cultivos de organoides tumorales procedentes de diferentes tipos de tumores, que han sido revisados recientemente26,27,28. Entre las cuestiones clave se encuentran la "contaminación/sobrecrecimiento" por células sanas, que forman organoides con una tasa de crecimiento superior a la de las células cancerosas, el elevado coste del mantenimiento del cultivo en comparación con los cultivos 2D, la baja tasa de establecimiento, las inconsistencias en el perfil de mutaciones somáticas y la histología entre el cultivo ex vivo y el tumor de origen, la heterogeneidad del tumor primario, el uso de una matriz extracelular de base murina, que pueden no ser óptimos para las células humanas y pueden impedir la administración del fármaco, la ausencia de la EMT y las células asociadas, la interferencia de los factores de crecimiento o inhibidores moleculares con la respuesta al fármaco, y la falta de protocolos estandarizados y validados para el establecimiento y mantenimiento de organoides tumorales. Sin embargo, a lo largo de los años, el uso de modelos de tumores primarios en la investigación del cáncer ha aumentado, y las técnicas para cultivar y mantener cultivos primarios han mejorado. Estos delicados cultivos ex vivo se establecen y mantienen mediante la adición de suplementos para promover el crecimiento y la estabilidad celular. En la actualidad, el inhibidor de la Rho quinasa (ROCK) se añade de forma rutinaria a los cultivos primarios para evitar la apoptosis y mejorar la adhesión célula-célula, promoviendo así la expansión a largo plazo de los cultivos primarios in vitro estables29. Además, también aumenta la supervivencia de las células madre criopreservadas descongeladas, lo que es importante a la hora de generar existencias congeladas de cultivos de organoides29. La suplementación con heparina también puede utilizarse para mejorar la expansión de las células madre mediante el aumento de la señalización de WNT y FGF y, por lo tanto, la proliferación celular30. Otros reactivos importantes utilizados en este protocolo validado para optimizar el establecimiento de organoides tumorales incluyen Accutase y DNasa. Accutase es un reactivo de digestión suave recomendado para segregar células madre individuales o separarlas de las superficies de cultivo, y ayuda a mantener la viabilidad celular mejor que el uso de otros reactivos diseñados para este fin, como la tripsina31. Sin embargo, las colagenasas también se pueden usar para atacar específicamente el tipo de colágeno incorporado en la membrana basal biológica. La DNasa se ha utilizado en métodos de aislamiento celular durante muchos años32 para eliminar los restos de ADN de células muertas y necróticas durante el protocolo de extracción y, por lo tanto, evitar la aglomeración/agregación de células debido al aumento de la viscosidad de la preparación de la muestra. Los gránulos celulares a menudo se tratan con tampón de lisis, pero este paso se puede excluir cuando no hay evidencia visible de contaminación de glóbulos rojos de la muestra de tejido8 (Archivo suplementario 1).
El establecimiento exitoso de organoides tumorales no está exento de complicaciones biológicas inherentes. Idealmente, los tejidos para cultivos de organoides tumorales deben procesarse el mismo día de la recolección para optimizar la viabilidad celular. No siempre se recomienda la congelación de tejidos, ya que puede reducir significativamente la viabilidad celular. Sin embargo, los organoides tumorales pueden establecerse utilizando muestras que han sido ultracongeladas o criopreservadas lentamente en un medio de congelación que contiene DMSO33,34, lo que permite el envío de muestras y el biobanco. En algunos casos, es posible obtener cultivos 2D a partir de cultivos de organoides tumorales que han sido pasados varias veces por la recuperación de las células tumorales adheridas a las placas después de retirar las cúpulas de la matriz de la membrana basal. En nuestra experiencia, la tasa de éxito del establecimiento de organoides tumorales es mucho mayor con el tejido PDX PDAC que con el tejido PDAC fresco derivado de una muestra resecada4. Esto se debe al hecho de que generalmente se dispone de piezas más grandes de tejido PDX PDAC fresco, y este tejido tiene una mayor celularidad, probablemente debido al entorno in vivo más hospitalario proporcionado por el modelo PDX en comparación con los enfoques basados ex vivo. Se pueden agregar agentes no tóxicos al medio de cultivo para monitorear la viabilidad celular y la proliferación del cultivo. Además, se debe evitar el crecimiento excesivo de organoides no neoplásicos utilizando condiciones selectivas35,36. El tejido del páncreas puede contener enzimas digestivas que podrían afectar la viabilidad de las células tumorales aisladas; Por lo tanto, se puede agregar tripsina al paso de la digestión para superar este problema4. Muchos otros factores, como el estado del paciente/tejido (es decir, tratado o no con terapia oncológica), el tipo de tumor, la contaminación de la muestra del quirófano y el grado original del tumor, también pueden influir significativamente en la capacidad de establecer un organoide tumoral. Del mismo modo, no todos los tejidos tienen suficientes células tumorales viables para establecer cultivos primarios. Esto es particularmente cierto en el caso de los tumores PDAC, que son notoriamente ricos en estroma (aproximadamente 90-95%) y contienen un pequeño porcentaje de células tumorales epiteliales. Además, los tejidos con un alto contenido de estroma pueden ser difíciles de cortar y disociar para obtener células tumorales individuales para cultivo. Se pueden agregar medios de digestión especializados y disponibles comercialmente, o también se puede usar un equipo de disociación mecánica si el tejido no se digiere por completo. Alternativamente, se puede lograr una disociación completa del tejido mediante un corte continuo con dos hojas de bisturí hasta que el tejido tenga una apariencia semilíquida (ver demostración en video).
Hay muchos escollos técnicos durante el procedimiento que también deben destacarse. Por ejemplo, los restos de tejido pueden bloquear el filtro, y luego se debe cambiar el filtro, ya que los restos impiden el paso del sobrenadante líquido. El paso de filtración se puede repetir varias veces para recuperar la máxima cantidad de células tumorales disociadas. Además, es importante comprobar el gránulo de células después de cada paso de centrifugación, ya que a veces es difícil ver cuando hay un número de células bajo. El pipeteo de los gránulos celulares debe realizarse de forma suave y lenta, ya que un pipeteo agresivo puede provocar una pérdida de células o una reducción de la viabilidad celular. Además, al preparar la mezcla de matriz y celda, se deben utilizar medios preenfriados a 4 °C y puntas refrigeradas almacenadas a -20 °C, ya que la matriz se solidifica rápidamente. Por último, y como se ha mencionado anteriormente, la DNasa ayuda a prevenir la aglomeración de células durante la preparación de la muestra. También se recomienda alícuota de los reactivos utilizados en el protocolo y preparación de mezclas de factores de crecimiento para evitar la congelación-descongelación repetitiva de los reactivos.
El aislamiento de fibroblastos primarios es de interés, ya que son un tipo de célula importante en el PDAC y se pueden utilizar para experimentos posteriores de cocultivo para determinar los efectos de la TME en el crecimiento de las células tumorales. Después de aproximadamente 1 semana, los fibroblastos han migrado fuera de las secciones de tejido y, por lo general, se pueden ver adheridos a las placas de cultivo y creciendo como un cultivo de monocapa. Sin embargo, la presencia de fibroblastos en el cultivo también tiene desventajas, ya que consumen los nutrientes del medio de cultivo y, por lo tanto, comprometen el crecimiento óptimo de los organoides tumorales. A menudo se recomiendan placas de fijación ultrabaja (ULA, por sus siglas en inglés) para cultivar organoides tumorales con el fin de limitar el crecimiento de fibroblastos, ya que se adhieren fácilmente a placas estándar tratadas con cultivos celulares. Este protocolo validado recomienda el uso de medios DMEM estándar con 10% de FBS para el cultivo de fibroblastos primarios, aunque también se pueden utilizar medios especializados para fibroblastos.
Es importante documentar el estado del cultivo de organoides tumorales a lo largo del tiempo, especialmente durante la primera semana, ya que el cultivo se comporta de manera diferente según la calidad, la cantidad y la fuente del tejido (tumores humanos primarios resecables versus PDX). Se pueden agregar agentes no tóxicos al medio de cultivo para monitorear la viabilidad celular y la proliferación del cultivo. Los cultivos deben ser monitoreados visualmente diariamente durante los primeros 7 días y luego dos o tres veces por semana. Además, el medio debe cambiarse cada 4-5 días o cuando parezca ácido (aparece amarillo), teniendo cuidado de no dañar las cúpulas de la matriz de la membrana basal. Al principio, pueden aparecer grandes grupos marrones debido a una alta densidad celular. Sin embargo, esto debería desaparecer después del primer paso, lo que permitiría obtener organoides tumorales claramente definidos sobre un fondo claro de la matriz de la membrana basal. Se recomienda tomar fotografías de los organoides tumorales, especialmente durante las primeras 3 semanas, con el fin de determinar el fenotipo visual y la tasa de crecimiento de los organoides tumorales. El paso del cultivo de organoides tumorales también es un reto técnico. Generalmente, se retira el medio de cultivo y los domos de la matriz se disocian con reactivos especializados o a base de tripsina a 4 °C hasta que la matriz de la membrana basal se disuelve por completo. A continuación, el gránulo de la célula se resuspende en una nueva matriz y el volumen se ajusta para realizar el paso deseado, como 1:1 (utilizando el mismo volumen de matriz que el original) o 1:3 (añadiendo tres veces el volumen original del enfoque). El grupo de David Tuveson, compuesto por expertos en organoides pancreáticos, proporciona recursos en línea con protocolos para establecer, mantener y teñir organoides pancreáticos37.
Los organoides tumorales ex vivo derivados del paciente proporcionan un valioso modelo preclínico para evaluar la sensibilidad del tratamiento específico del paciente para su aplicación en medicina personalizada. Además, estos modelos son modelos tumorales fisiológicamente más relevantes en comparación con las monocapas celulares adherentes 2D tradicionales. Se necesita una nomenclatura clara y coherente de los modelos tumorales 3D con un seguimiento fotográfico y descriptivo periódico del cultivo en el campo de los modelos tumorales. Además, trabajar con protocolos estandarizados es de suma importancia para el éxito de esta tecnología en la clínica en la determinación de la sensibilidad a los medicamentos en función de cada paciente. Los investigadores que utilizan esta tecnología deben ser conscientes de los obstáculos y las trampas de estos modelos sensibles y complejos. Sin embargo, trabajar con un protocolo validado y condiciones y opciones de solución de problemas claramente definidas ayudará a evitar problemas técnicos y optimizará el establecimiento y mantenimiento de la cultura. Aquí, se proporciona un protocolo validado para establecer organoides tumorales y aislar fibroblastos que se puede implementar fácilmente en muchos laboratorios de oncología traslacional con equipos estándar y experiencia en cultivo de tejidos.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Este estudio ha contado con el apoyo de la Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo a la I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), el Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención n.º 857381, el proyecto VISION (Estrategias para fortalecer la excelencia científica y la capacidad de innovación para el diagnóstico precoz de cánceres gastrointestinales), Convocatoria intramuros de nuevos proyectos de investigación para investigadores clínicos y grupos de investigación emergentes IRYCIS (2021/0446), Proyecto Organoides Derivados del Paciente 2.0 (CIBERONC) y el proyecto TRANSCAN II Convocatoria JTC 2017 "Establecimiento de un algoritmo para el diagnóstico precoz y seguimiento de pacientes con tumores neuroendocrinos pancreáticos (NExT)", subvención número 1.1.1.5/ERANET/20/03. Las muestras biológicas utilizadas en este protocolo fueron proporcionadas por el Biobanco Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) e integradas en la Plataforma de Biobancos y Biomodelos del ISCIII (PT20/00045). También nos gustaría agradecer a Yvonne Kohl, Agapi Kataki, Vita Rovita y Thorsten Knoll por su inestimable apoyo para desarrollar este protocolo como parte de los proyectos NExT y VISION.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
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