Summary
Tumörorganoider har revolutionerat cancerforskningen och tillvägagångssättet för personlig medicin. De representerar en kliniskt relevant tumörmodell som gör det möjligt för forskare att ligga steget före tumören i kliniken. Detta protokoll fastställer tumörorganoider från färska tumörvävnadsprover från bukspottkörteln och patienthärledda xenografter med ursprung i pankreasadenokarcinom.
Abstract
Tumörorganoider är tredimensionella (3D) ex vivo-tumörmodeller som rekapitulerar de biologiska nyckelegenskaperna hos de ursprungliga primära tumörvävnaderna. Tumörorganoider från patienter har använts i translationell cancerforskning och kan användas för att bedöma behandlingskänslighet och resistens, cell-cellinteraktioner och tumörcellsinteraktioner med tumörmikromiljön. Tumörorganoider är komplexa odlingssystem som kräver avancerade cellodlingstekniker och odlingsmedier med specifika tillväxtfaktorcocktails och ett biologiskt basalmembran som efterliknar den extracellulära miljön. Förmågan att etablera primära tumörkulturer beror i hög grad på ursprungsvävnaden, cellulariteten och tumörens kliniska egenskaper, såsom tumörgraden. Dessutom är insamling av vävnadsprover, materialkvalitet och kvantitet samt korrekt biobankning och förvaring avgörande delar av denna procedur. Laboratoriets tekniska kapacitet är också avgörande faktorer att ta hänsyn till. Här rapporterar vi ett validerat SOP/protokoll som är tekniskt och ekonomiskt genomförbart för odling av ex vivo tumörorganoider från färska vävnadsprover med ursprung i pankreasadenokarcinom, antingen från färsk primär resekerad patientdonatorvävnad eller patientderiverade xenografter (PDX). Tekniken som beskrivs här kan utföras i laboratorier med grundläggande vävnadsodling och musfaciliteter och är skräddarsydd för bred tillämpning inom det translationella onkologiområdet.
Introduction
Tumörorganoider är ex vivo tredimensionella (3D) organiserade kulturer som härrör från färsk tumörvävnad och ger cancermodeller. Tumörorganoider rekapitulerar de biologiska nyckelegenskaperna hos den ursprungliga primära tumören 1,2,3,4 och kan expanderas i upp till flera månader och kryokonserveras, liknande konventionella odödliga cellinjer. Tumörorganoider tillhandahåller en biobank av patienthärledda tumörmodeller för translationell/personlig medicin5 och representerar ett viktigt framsteg inom cancercellbiologiska system/modeller. Tumörorganoider från patienter kan användas som ex vivo-modeller för att förutsäga effekten av (neo)adjuvanta onkologiska/farmakologiska terapier, för vilka odlingar etableras från färsk tumörvävnad och läkemedelskänslighetsanalyser eller farmakotypning utförs på patientspecifik basis för att identifiera effektiva medel för efterföljande behandlingslinjer 1,4. Dessutom övervinner tumörorganoider begränsningen av tillgängligheten av primär tumörvävnad och, ännu viktigare, erbjuder ett utmärkt alternativ eller komplementärt system till in vivo-musmodeller, såsom patient-deriverade xenografter (PDX)2. Komplexiteten hos tumörorganoider ökar om de primära tumörcellerna kombineras med stromaceller som finns i tumörmikromiljön (TME), såsom cancerassocierade fibroblaster (CAF), endotelceller och immunceller, som efterliknar primärtumörens funktion och komplexa cellularitet. Tumörorganoider har fastställts för många tumörtyper med hjälp av standardiserade protokoll 6,7,8,9,10. Organoidförökning från olika solida tumörer, inklusive kolorektal och bröstcancervävnad, är väletablerad och tekniskt överkomlig 11,12,13,14,15.
Kirurgiska tumörresektioner eller tumörbiopsier ger primära tumörvävnadsprover. Helst bör tumörvävnadsprover komma från mitten av tumörmassan eller den invaderande kanten av tumören, såväl som vävnad som ser normal ut intill tumören. Jämfört med konventionella 2D-kulturer kräver tumörorganoider flera "tillägg", inklusive ett biologiskt basalmembran (t.ex. Matrigel, hydrogel eller en kollagenbaserad struktur), som efterliknar den extracellulära TME, och ett flytande tillväxtmedium som tillför specifika näringsämnen och tillväxtfaktorer och stöder cellproliferation och livskraft i odling16.
De mest grundläggande stegen i primär cellodling är att tvätta vävnaden i saltlösning för att förhindra kontaminering, mekaniskt skära/smälta tumören i små bitar på 1-3 mm3 och behandla med kollagenas för enzymatisk nedbrytning av vävnaden. Den smälta blandningen filtreras sedan för att avlägsna stora vävnadsfragment, återsuspenderas i ett biologiskt basalmembran såsom Matrigel och pläteras som kupoler i odlingsplattor med låg fästförmåga för att förbättra tillväxten av icke-fäst. Basalmembranmatriskupolerna är täckta med flytande odlingsmedium och kompletteras med glutamin och antibiotika för att undvika kontaminering, samt med specifika tillväxtfaktorer beroende på vävnadstyp 7,8,9,16,17. Andra relevanta celler som finns i bulktumören och TME kan också isoleras, t.ex. cancerassocierade fibroblaster (CAF) och immunceller. Denna teknik, som nyligen har granskats18, gör det möjligt att etablera samkulturer med olika celltyper för att studera svaret på terapi i en mer "realistisk" tumörmiljö. Vidare kan cell-cellinteraktioner och interaktionen mellan tumörceller och komponenter i den omgivande biologiska matrisen studeras.
Den rapporterade framgångsfrekvensen för tumörorganoidetablering med hjälp av färsk vävnad från biopsier eller resekerad gastrointestinal tumörvävnad är cirka 50 %11, och framgångsfrekvensen från den senare är till stor del beroende av vävnadstyp och ursprung4, särskilt tumörgraden och den övergripande tumörcellulariteten. Tredimensionella tumörmodeller har varierande komplexitet, från enkla encelliga aggregat till mycket komplexa konstruerade modeller bestående av olika celltyper. Terminologin som används för att beskriva 3D-kulturer i litteraturen är mycket inkonsekvent 19,20,21, eftersom olika termer som sfäroider, tumörsfärer och organoider används, även om skillnaden mellan dem är oklar. Eftersom en tydlig konsensus om definitionen ännu inte har nåtts, beskrivs i denna artikel en tumörorganoid som en organiserad tumörcellkultur inbäddad i ett biologiskt basalmembran.
Häri rapporteras ett validerat protokoll för etablering av tumörorganoider från färska vävnadsprover som härrör från färskt primärt resekerat eller PDX-härlett pankreasduktalt adenokarcinom (PDAC), och detta protokoll kan utföras i de flesta laboratorier med grundläggande vävnadsodlingsanläggningar. Detta protokoll har anpassats från flera state-of-the-art rapporterade protokoll som för närvarande används för att etablera tumörorganoider eller tumöroider från matsmältningstumörvävnad från grupperna David Tuveson9, Hans Clevers8 och Aurel Perren7.
Detta protokoll diskuterar inte hur den färska vävnaden skördas. För att få färsk mänsklig tumörvävnad av hög kvalitet är det viktigt att ha en effektiv samordning mellan kirurgerna som skördar vävnaden och patologiavdelningen som extraherar vävnadsprovet för organoidodling. På samma sätt, när man använder PDX som en färsk vävnadskälla, är effektiv samordning med den person som skördar vävnadsprovet också viktigt. Det är viktigt att få vävnadsprovet så snabbt som möjligt (inom 30-60 minuter från skördetillfället) för att bibehålla en hög kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utfördes i enlighet med de institutionella riktlinjerna för försöksdjurs välbefinnande som godkänts av Universidad Autónoma de Madrids etiska kommitté (CEI 103-1958-A337) och La Comunidad de Madrid (PROEX 294/19) och i enlighet med riktlinjerna för etiskt uppförande vid vård och användning av djur som anges i The International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals, utvecklats av Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS). Protokollet följde de etiska principerna för biomedicinsk forskning med skriftligt informerat samtycke. Etiskt förhandsgodkännande erhölls för användning av färsk vävnad för etablering av tumörorganoidkulturer. Proverna tillhandahölls av BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (National Registry of Biobanks B.0000678), integrerades i ISCIII:s plattform för biobanker och biomodeller (PT20/00045) och behandlades enligt standardrutiner med lämpligt etiskt godkännande. Tumörerna implanterades subkutant, som tidigare beskrivits22, i immunsupprimerade 6 veckor gamla honmöss av typen NU-Foxn1nu (se Materialtabell) och passerades in vivo för att etablera PDAC PDX.
1. Experimentell förberedelse
- Hantera humana prover i ett biosäkerhetsskåp av klass II.
- Bär en labbrock, skyddshandskar och glasögon under hela proceduren för att undvika infektion av vävnadsburna patogener.
OBS: Minst 3 timmar krävs för att bearbeta det färska vävnadsprovet och plätera organoiderna och fibroblasterna. - Bearbeta de färska vävnadsproverna22 inom högst 24 timmar från skörden och förvara vid 4 °C i vävnadsodlingsmedium (DMEM kompletterat med 10 % FBS och 1 % penicillin-streptomycin) fram till bearbetningen.
- Förvara alla prover och reagenser på isen under hela proceduren och se till att förinställa en kyld centrifug till 4 °C och använd den på låg hastighet för att undvika att skada cellberedningen.
- Förvara pipettspetsarna P1 000 och P200 i en frys på −20 °C för användning under protokollet.
- Alikvotera basalmembranmatrisen (se materialtabell) före användning. För detta protokoll rekommenderas 250 ml alikvoter.
2. Bearbetning av färsk primär tumörvävnad för att etablera tumörorganoider och primära fibroblaster
OBS: Minst 3 timmar krävs för att bearbeta det färska vävnadsprovet (antingen primära humana resekterbara tumörer eller PDX) och för att plätera tumörorganoiderna och fibroblasterna. En översikt över organoidberedningsprocessen visas i figur 1, från vävnadsnedbrytning till plätering av tumörorganoiderna. Innan protokollet påbörjas, ta ut en alikvot av basalmembranmatrisen från frysen −20 °C och låt den ligga på is i cirka 30-60 minuter före användning.
- Placera en odlingsplatta med 6 brunnar i en 37 °C cellodlingsinkubator 3 timmar innan organoiderna pläteras.
- Mät, fotografera och tvätta vävnaden (steg 1.3) med 3 ml Advanced DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F-12 Ham (F12), kompletterat med 5 % fetalt bovint serum (FBS), 15 mM Hepes, 1 % L-glutamin, 1 % penicillin-streptomycin, 125 ng/ml amfotericin B, 0,1 mg/ml normocin) (se materialförteckning) genom att pipettera upp och ner och tvätta sedan med 3 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) genom att pipettera upp och ner.
- Avlägsna substratet genom aspiration från vävnadsodlingsplattan och skär vävnaden i 1 mm3 bitar i en steril vävnadsodlingsplatta med hjälp av två sterila blad och 2 ml digestion medium (Advanced DMEM-F12 + 10 mg kollagenas IV/ml, 0,000625 % trypsin-EDTA och 10 μg/ml DNas). Samla vävnaden i ett 50 ml rör med totalt 5 ml uppslutningssubstrat och inkubera i 1 timme vid 37 °C med mekanisk uppslutning med kommersiellt tillgänglig utrustning (se materialförteckning) eller med periodisk blandning av provet, genom att pipettera provet upp och ner.
- Tillsätt 5 ml Advanced DMEM-F12 för att inaktivera trypsinet och filtrera provet genom en 70 μm porsil för att avlägsna stora skräp.
- Tillsätt 2 ml DMEM med 10 % FBS till toppen av filtret och samla upp skräp och vävnadsrester för att etablera kulturer av fibroblaster (se steg 5).
- Centrifugera filtratet vid 200-300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och aspirera supernatanten så att endast cellpelleten blir kvar. Tillsätt 5 ml Advanced DMEM-F12 och centrifugera i 5 minuter vid 300 x g.
- Återsuspendera pelleten i 4 ml ammoniumkloridkalium (ACK, se materialtabell) lyseringsbuffert. Passera blandningen till ett 15 ml rör och inkubera i rumstemperatur i 2 minuter för att lysera de röda blodkropparna.
OBS: Detta lyssteg för röda blodkroppar kan tas bort när det inte finns några synliga tecken på kontaminering. - Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och aspirera supernatanten. Tillsätt 5 ml Advanced DMEM-F12 och centrifugera i 5 minuter vid 300 x g.
- Tillsätt 1 ml kommersiellt tillgängligt celldissociationsreagens (se materialtabell) kompletterat med DNas (1 μg/ml) till cellpelleten och inkubera i 2-3 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter och aspirera supernatanten. Tillsätt 5 ml Advanced DMEM-F12 och återsuspendera cellpelleten.
- Pipettera upp och ner 30 gånger med en P1 000-pipett för att dissociera cellerna, centrifugera i 5 minuter vid 300 x g och ta bort supernatanten.
- Ta pipettspetsarna P1 000 och P200 från frysen på −20 °C och återsuspendera cellpelleten i membranmatrisen med hjälp av en P1 000-pipett och kalla spetsar (50 μL per droppe, med hänsyn tagen till pelletsvolymen, sex till sju kupoler per brunn). Ta ut den tidigare uppvärmda plattan från inkubatorn. Ställ in en P200-pipett på 48 μL och använd kalla spetsar för att skapa kupoler av basalmembranmatrisen i den förvärmda 6-hålsplattan.
- Placera plattan med basalmembranets matriscellkupoler i 37 °C 5 % CO2 -inkubatorn i 15 minuter för att stelna basalmembranmatrisen.
- Tillsätt 2-2,5 ml avancerad DMEM-F12, kompletterad med 20 ng/ml rekombinant human epidermal tillväxtfaktor (EGF), 100 ng/ml human placenta tillväxtfaktor (PlGF), 10 ng/ml rekombinant human basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), 769 ng/ml insulinliknande tillväxtfaktor-1 (IGF-1) och 10,5 μM ROCK-hämmare (avancerad DMEM-F12 + tillväxtfaktorer) (se materialförteckning).
3. Övervakning av organoiderna
- Övervaka tumörorganoidkulturen visuellt under de första 7 dagarna och därefter tre gånger i veckan.
- Byt medium två gånger i veckan med Advanced DMEM-F12 innehållande 20 ng/ml rekombinant human epidermal tillväxtfaktor (EGF), 100 ng/ml human placenta growth factor (PlGF), 10 ng/ml rekombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF), 769 ng/ml insulinliknande tillväxtfaktor-1 (IGF-1) och 10,5 μM ROCK-hämmare (Advanced DMEM-F12 + tillväxtfaktorer).
- Ta bilder av tumörorganoidkulturen med jämna mellanrum på dag 1, dag 3, dag 7, dag 10 och dag 15 efter bearbetning av provet och plätering av kulturen i matrisen för att observera tillväxten och livskraften.
4. Passage och kryolagring av organoiderna
- Ta bort odlingsmediet från 6-hålsplattan.
- Tillsätt 1 ml av ett lämpligt cellåtervinningsreagens (se materialtabell) för att dispara basalmembranmatrisen och erhålla en cellsuspension, och återvinn supernatanten i ett 15 ml rör. Om matrisen inte dissocierar omedelbart, inkubera provet vid 4 °C i 15-20 minuter tills det är helt upplöst.
- Tillsätt 1 ml av samma cellåtervinningsreagens som användes i steg 4.2 till plattans brunn för att återvinna ytterligare dissocierade celler, och tillsätt supernatanten till samma 15 ml-rör som i steg 4.2.
- Tillsätt 5 ml kall Advanced DMEM-F12 och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och torka pelleten försiktigt genom att ta bort eventuell kvarvarande vätska med en 5 ml pipett; Undvik att flytta röret så mycket som möjligt. Återsuspendera cellpelleten i dubbelt så mycket som den ursprungliga volymen av basalmembranmatrisen för att erhålla en passage på 1:2.
- För kryolagring av organoidkulturerna, återsuspendera pelleten som erhölls i steg 4.5 i 1 ml frysmedium (10 % DMSO, 20 % FBS, 50 % DMEM-F12, 10.5 μM ROCK-hämmare) och förvara vid −80 °C.
OBS: Volymen av basalmembranmatrisen kan justeras för att utföra olika passager, såsom 1:1 (med samma volym basalmembranmatris som originalet) eller 1:3 (med tillägg av tre gånger den ursprungliga volymen av basalmembranmatrisen).
5. Etablering av fibroblaster
- Efter att ha återvunnit skräp och vävnadsrester i 2 ml DMEM med 10 % FBS, tillsätt detta till en 6-hålsplatta och inkubera vid 37 °C med 5 % CO2.
- Ta bort vävnadsresterna från fibroblastkulturerna från steg 2.5 genom aspiration av mediet 2 dagar eller 3 dagar efter plätering och ersätt med färskt DMEM med 10 % FBS.
- Övervaka fibroblastkulturen visuellt tre gånger i veckan och byt odlingsmedium minst två gånger i veckan med hjälp av DMEM kompletterat med 10 % FBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det är viktigt att dokumentera hur tumörorganoidkulturen fortskrider över tid, särskilt under de första veckorna, för att kunna uppskatta hur odlingen kommer att bete sig i nedströmsanalyser. Figur 2 visar ett exempel på optimal isolering av tumörceller och etablering av tumörorganoider från färsk vävnad under en 15-dagarsperiod. Ibland finns det en stor volym cellskräp i provet, och det är svårt att se de tumörorganoider som håller på att utvecklas, som visas i figur 3. Dessutom kan fenotypen hos de utvecklande organoiderna variera från isolerade, rundade organoider (Figur 4A) till sfäroida/aggregatliknande kulturer (Figur 4B-D), och detta beror på tumörens ursprung. Fibroblaster är en vanlig biprodukt av primär tumörcellodling från solida tumörer, särskilt de med högt stromainnehåll, och kan ofta kontaminera organoidkulturen. Figur 5 visar hur dessa celler migrerade från basalmembranmatriskupolerna och fäste vid odlingsplattorna efter cirka 7 dagar. Dessa celler konsumerar näringsämnena från odlingsmediet, vilket äventyrar den optimala tillväxten av organoider.
Primära fibroblaster kan erhållas som en isolerad kultur när de migrerar ut ur vävnadssnitten, fäster vid odlingsplattorna och växer som en monoskiktskultur, som visas i figur 6. Detta protokoll rekommenderar att man använder standard DMEM-medium med 10 % FBS för odling av fibroblasterna. Ett specialiserat medium för fibroblaster kan dock också användas. Vidhäftande fibroblaster är synliga cirka 7 dagar efter plätering (Figur 6).
Figur 1: Bearbetning av färska vävnadsprover för att fastställa tumörorganoider. En översikt över tumörorganoidberedningsprocessen visas, från vävnadssmältning till plätering av organoiderna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: En tumörorganoidkultur etablerad från en PDX som härstammar från en färsk PDAC-tumör. Progressionen av tumörorganoidkulturen under flera dagar visas, med bilder av organoiderna i ett mikroskopiskt plan på dag 1, dag 3, dag 7, dag 10 och dag 15. Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på en icke-optimal tumörorganoidodling på dag 2 med överskott av cellrester. Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Etablerade tumörorganoider från olika PDAC PDX-vävnader som visar skillnader i storlek och morfologi. Tumörorganoider kan ha en (A) klassisk rundad fenotyp eller (B-D) ett mer sfäroidt/aggregerat utseende. Den genomsnittliga storleken på organoiderna varierar från 80 uM till 100 uM, även om vissa organoider kan vara så stora som 200 uM. Skalstreck: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Exempel på en icke-optimal tumörorganoidkultur (AC) kontaminerad med CAF/fibroblaster efter 30 dagar i odling. Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Exempel på primära fibroblastkulturer som etablerats från resterna av den nedbrutna primära tumörvävnaden . (A) Confluent kultur. (B) Icke-sammanflytande kultur. Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Felsökning av etablering av tumörorganoidkultur. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stora framsteg inom farmakologiska cancerbehandlingar är utmanande, eftersom sannolikheten för godkännande av läkemedel i kliniska fas I-prövningar inom onkologi är 5,1 %, vilket är den lägsta av alla sjukdomstyper23. Den främsta orsaken är att cancer är mycket heterogent, och därför svarar patientkohorterna inte enhetligt som förväntat på den givna behandlingen, vilket belyser att ett mer personligt tillvägagångssätt behövs. Tvådimensionella (2D) kulturer har använts inom translationell cancerforskning i många år men saknar den strukturella 3D-organisation som finns i primära tumörer. Således återspeglar de inte patienternas behandlingssvar och tumörcellernas kommunikation med varandra eller med deras mikromiljö 3,23. Den underliggande kärnprincipen för alla 3D-odlingssystem är att främja cellulär interaktion med omgivningen och att organisera celler på ett rumsligt relevant sätt, liknande det i primärtumören (in situ). Morfologin hos tumörorganoider varierar från rund, massa och druvliknande till stellat beroende på den inneboende naturen hos odlade celler och de odlingsförhållanden som används, som visas i figur 4. Etablerade tumörorganoidkulturer från patienter kan behandlas med samma förstahandsbehandling som används på patienten för att bekräfta att tumörorganoiden rekapitulerar den kliniska situationen (dvs. det kliniska behandlingssvaret)1,13,24,25.
Tumörorganoiderna kan också behandlas med nya farmakologiska medel, vilket ger ett explorativt tillvägagångssätt för att identifiera nya terapier som kan användas i efterföljande behandlingslinjer i kliniken när standardbehandlingsalternativen har uttömts. Odlingen övervakas kontinuerligt för att bedöma tumörorganoidkulturernas respons på medlet i realtid. En genomförbarhetsstudie av den molekylära och immunhistokemiska karakteriseringen av patient-deriverad xenografttumör (PDX) och PDX-deriverade organoider visade att morfologi, proteinuttryck och genomiska förändringar var jämförbara mellan de två modellerna. Dessutom visade en proof-of-concept-studie för farmakotypning att prediktionerna in vivo och ex vivo också var jämförbara och drog därmed slutsatsen att användning av tumörorganoider som en cancer-/sjukdomsmodell är ett genomförbart och robust tillvägagångssätt som kan tillämpas i den kliniska miljön2.
En rad utmaningar relaterade till etableringen av tumörorganoidkulturer som härrör från olika tumörtyper har belysts här och nyligen granskats26,27,28. Nyckelfrågor inkluderar "kontaminering/överväxt" av friska celler, som bildar organoider med högre tillväxthastighet än cancerceller, den höga kostnaden för kulturunderhåll jämfört med 2D-kulturer, den låga etableringshastigheten, inkonsekvenser i den somatiska mutationsprofilen och histologin mellan ex vivo-kulturen och ursprungstumören, primär tumörheterogenitet, användning av en murinbaserad extracellulär matris, som kanske inte är optimal för mänskliga celler och som kan hindra läkemedelstillförseln, frånvaron av TME och associerade celler, interferens av tillväxtfaktorer eller molekylära hämmare med läkemedelssvaret och bristen på standardiserade och validerade protokoll för etablering och underhåll av tumörorganoider. Under årens lopp har dock användningen av primära tumörmodeller inom cancerforskning ökat, och tekniker för att odla och underhålla primära kulturer har förbättrats. Dessa känsliga ex vivo-kulturer etableras och upprätthålls genom att tillsätta kosttillskott för att främja celltillväxt och stabilitet. Rho-kinashämmaren (ROCK) tillsätts nu rutinmässigt till primära kulturer för att undvika apoptos och förbättra cell-celladhesionen, vilket främjar den långsiktiga expansionen av stabila primära in vitro-kulturer 29. Dessutom ökar det också överlevnaden av tinade kryokonserverade stamceller, vilket är viktigt vid generering av frysta lager av organoidkulturer29. Tillskott av heparin kan också användas för att öka expansionen av stamceller genom att öka WNT- och FGF-signalering och därmed cellproliferation30. Andra viktiga reagenser som används i detta validerade protokoll för att optimera etableringen av tumörorganoider inkluderar Accutase och DNase. Accutase är ett skonsamt matsmältningsreagens som rekommenderas för att separera enskilda stamceller eller lossa dem från odlingsytorna, och det hjälper till att upprätthålla cellviabiliteten bättre än att använda andra reagenser som är utformade för detta ändamål, såsom trypsin31. Kollagenaser kan dock också användas för att specifikt rikta in sig på den kollagentyp som ingår i det biologiska basalmembranet. DNase har använts i cellisoleringsmetoder i många år32 för att eliminera DNA-rester från döda och nekrotiska celler under extraktionsprotokollet och därmed förhindra klumpning/aggregering av celler på grund av den ökade viskositeten hos provberedningen. Cellpellets behandlas ofta med lysbuffert, men detta steg kan uteslutas när det inte finns några synliga tecken på kontamination av röda blodkroppar i vävnadsprovet8 (tilläggsfil 1).
Den framgångsrika etableringen av tumörorganoider kommer inte utan inneboende biologiska komplikationer. Helst bör vävnader för tumörorganoidkulturer bearbetas samma dag som skörden för att optimera cellviabiliteten. Frysning av vävnader rekommenderas inte alltid eftersom det kan minska cellviabiliteten avsevärt. Tumörorganoider kan dock etableras med hjälp av prover som har snabbfrysts eller långsamt kryokonserverats i DMSO-innehållande frysmedium33,34, vilket möjliggör provtransport och biobankning. I vissa fall är det möjligt att erhålla 2D-kulturer från tumörorganoidkulturer som har passerat flera gånger genom återhämtning av tumörcellerna som är fästa vid plattorna efter att basalmembranmatriskupolerna avlägsnats. Enligt vår erfarenhet är framgångsgraden för etablering av tumörorganoider mycket högre med PDX PDAC-vävnad än med färsk PDAC-vävnad som härrör från ett resekerat prov4. Detta beror på det faktum att större bitar av färsk PDX PDAC-vävnad vanligtvis finns tillgängliga, och denna vävnad har högre cellularitet, sannolikt på grund av den mer gästvänliga in vivo-miljön som PDX-modellen tillhandahåller jämfört med ex vivo-baserade metoder. Icke-toxiska ämnen kan tillsättas till odlingsmediet för att övervaka cellviabiliteten och spridningen av kulturen. Dessutom måste överväxt av icke-neoplastiska organoider undvikas med hjälp av selektiva förhållanden35,36. Bukspottkörtelvävnad kan innehålla matsmältningsenzymer som kan påverka livskraften hos de isolerade tumörcellerna. Således kan trypsin läggas till i matsmältningssteget för att övervinna detta problem4. Många andra faktorer, såsom patientens/vävnadens status (dvs. behandlad eller obehandlad med onkologisk behandling), typen av tumör, kontamineringen av provet från operationssalen och tumörens ursprungliga grad, kan också avsevärt påverka förmågan att etablera en tumörorganoid. På samma sätt har inte varje vävnad tillräckligt med livskraftiga tumörceller för att etablera primära kulturer. Detta gäller särskilt för PDAC-tumörer, som är notoriskt stromarika (cirka 90%-95%) och innehåller en liten andel epiteltumörceller. Dessutom kan vävnader med hög stromahalt vara svåra att klippa och dissociera för att få fram enstaka tumörceller för odling. Specialiserade och kommersiellt tillgängliga rötningsmedier kan tillsättas, eller så kan mekanisk dissociationsutrustning också användas om vävnaden inte är helt smält. Alternativt kan en grundlig vävnadsdissociation uppnås genom kontinuerlig skärning med två skalpellblad tills vävnaden har ett halvflytande utseende (se videodemonstration).
Det finns många tekniska fallgropar under förfarandet som också måste belysas. Till exempel kan vävnadsrester blockera filtret, och filtret måste då bytas, eftersom resterna hindrar passagen av den flytande supernatanten. Filtreringssteget kan upprepas flera gånger för att återställa den maximala mängden dissocierade tumörceller. Vidare är det viktigt att kontrollera cellpelleten efter varje centrifugeringssteg då det ibland är svårt att se när det är lågt cellantal. Pipetteringen av cellpelletsen bör utföras försiktigt och långsamt, eftersom aggressiv pipettering kan leda till förlust av celler eller en minskning av cellviabiliteten. Vid beredning av matris-cellblandningen bör dessutom medier som förkyls till 4 °C och kylda spetsar som förvaras vid −20 °C användas, eftersom matrisen stelnar snabbt. Slutligen, och som nämnts ovan, hjälper DNase till att förhindra klumpning av celler under provberedning. Alikvotering av de reagenser som används i protokollet och beredning av blandningar av tillväxtfaktorer rekommenderas också för att undvika upprepad frys- och upptining av reagenserna.
Isolering av primära fibroblaster är av intresse, eftersom de är en viktig celltyp i PDAC och kan användas för efterföljande samodlingsexperiment för att bestämma effekterna av TME på tumörcelltillväxt. Efter ca 1 vecka har fibroblasterna vandrat ut ur vävnadssnitten och kan vanligtvis ses fästa på odlingsplattorna och växa som en monolagerkultur. Närvaron av fibroblaster i kulturen har dock också nackdelar, eftersom de konsumerar näringsämnena från odlingsmediet och därmed äventyrar den optimala tillväxten av tumörorganoiderna. Ultra-low attachment (ULA) plattor rekommenderas ofta för odling av tumörorganoider för att begränsa fibroblasttillväxten, eftersom de lätt fäster på vanliga cellodlingsbehandlade plattor. Detta validerade protokoll rekommenderar användning av standard DMEM-media med 10 % FBS för odling av primära fibroblaster, även om specialiserade medier för fibroblaster också kan användas.
Det är viktigt att dokumentera tillståndet för tumörorganoidkulturen över tid, särskilt under den första veckan, eftersom kulturen beter sig olika beroende på vävnadskvalitet, kvantitet och källa (primära humana resekterbara tumörer kontra PDX). Icke-toxiska ämnen kan tillsättas till odlingsmediet för att övervaka cellviabiliteten och spridningen av kulturen. Kulturerna måste övervakas visuellt dagligen under de första 7 dagarna och därefter två till tre gånger i veckan. Dessutom måste mediet bytas var 4-5:e dag eller när det verkar surt (ser gult ut), var noga med att inte skada basalmembranets matriskupoler. Till en början kan stora bruna klumpar uppstå på grund av en hög celltäthet. Detta bör dock försvinna efter den första passagen, vilket gör det möjligt att erhålla tydligt definierade tumörorganoider på en tydlig bakgrund av basalmembranmatrisen. Att ta fotografier av tumörorganoiderna rekommenderas, särskilt under de första 3 veckorna, för att bestämma tumörorganoidernas visuella fenotyp och tillväxthastighet. Passagen av tumörorganoidkulturen är också en teknisk utmaning. I allmänhet avlägsnas odlingsmediet och matriskupolerna kopplas bort från trypsinbaserade eller specialiserade reagenser vid 4 °C tills basalmembranmatrisen är helt upplöst. Cellpelleten återsuspenderas sedan i färsk matris och volymen justeras för att utföra önskad passage, såsom 1:1 (med samma matrisvolym som originalet) eller 1:3 (med tre gånger den ursprungliga volymen av tillvägagångssättet). David Tuvesons grupp, som består av experter på bukspottkörtelorganoider, tillhandahåller online-resurser med protokoll för att etablera, underhålla och färga bukspottkörtelorganoider37.
Patient-deriverade ex vivo tumörorganoider ger en värdefull preklinisk modell för att bedöma patientspecifik behandlingskänslighet för tillämpning inom individanpassad medicin. Dessutom är dessa modeller mer fysiologiskt relevanta tumörmodeller jämfört med traditionella 2D-vidhäftande cellmonolager. En tydlig och konsekvent nomenklatur för 3D-tumörmodeller med periodisk fotografisk och deskriptiv uppföljning av kulturen behövs inom tumörmodellområdet. Dessutom är det av yttersta vikt att arbeta med standardiserade protokoll för att denna teknik ska lyckas i kliniken när det gäller att bestämma läkemedelskänslighet på patientspecifik basis. Forskare som använder denna teknik bör vara medvetna om de hinder och fallgropar som finns i dessa känsliga och komplexa modeller. Att arbeta med ett validerat protokoll och tydligt definierade villkor och felsökningsalternativ hjälper dock till att undvika tekniska problem och optimera etableringen och underhållet av kulturen. Här tillhandahålls ett validerat protokoll för att etablera tumörorganoider och isolera fibroblaster som enkelt kan implementeras i många translationella onkologilaboratorier med standardutrustning och erfarenhet av vävnadsodling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av finansiering från Plataforma biobancos y biomodelos - Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 inom ramen för bidragsavtal nr 857381, projektet VISION (Strategier för att stärka vetenskaplig excellens och innovationskapacitet för tidig diagnos av gastrointestinal cancer), Intramural utlysning för nya forskningsprojekt för kliniska forskare och framväxande forskargrupper IRYCIS (2021/0446), Patient Derived Organoids 2.0 Project (CIBERONC) och TRANSCAN II-projektet JTC 2017 utlysning "Establishing an algorithm for the early diagnosis and follow-up of patients with pancreatic neuroendocrine tumours (NExT)", anslagsnummer 1.1.1.5/ERANET/20/03. De biologiska proverna som används i detta protokoll tillhandahölls av BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS (B.0000678) och integrerades i ISCIII:s biobanks- och biomodellplattform (PT20/00045). Vi vill också tacka Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Rovita och Thorsten Knoll för deras ovärderliga stöd för att utveckla detta protokoll som en del av NExT- och VISION-projekten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
| 70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
| Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
| Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
| DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
| Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
| HEPES | Gibco | 15630056 | |
| Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
| Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
| Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
| L-Glutamine | Corning | 354235 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
| ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
| Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
| Trypsin | Gibco | 25300054 |
References
- April-Monn, S. L., et al. Patient-derived tumoroids of advanced high-grade neuroendocrine neoplasms mimic patient chemotherapy responses and guide the design of personalized combination therapies. bioRxiv. , (2022).
- Frappart, P. O., et al. Pancreatic cancer-derived organoids - A disease modeling tool to predict drug response. United European Gastroenterology Journal. 8 (5), 594-606 (2020).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Aberle, M. R., et al. Patient-derived organoid models help define personalized management of gastrointestinal cancer. The British Journal of Surgery. 105 (2), e48-e60 (2018).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Hong, H. K., et al. Efficient primary culture model of patient-derived tumor cells from colorectal cancer using a Rho-associated protein kinase inhibitor and feeder cells. Oncology Reports. 42 (5), 2029-2038 (2019).
- April-Monn, S. L., et al. 3D primary cell culture: A novel preclinical model for pancreatic neuroendocrine tumors (PanNETs). Neuroendocrinology. 111 (3), 273-287 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), e106 (2020).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 5739 (2020).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295 (2020).
- Barbáchano, A., et al.
- Michels, B. E., et al. Human colon organoids reveal distinct physiologic and oncogenic Wnt responses. Journal of Experimental Medicine. 216 (3), 704-720 (2019).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Porter, R. J., Murray, G. I., McLean, M. H.
- Wang, Q., Guo, F., Jin, Y., Ma, Y. Applications of human organoids in the personalized treatment for digestive diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 336 (2022).
- Wang, J., et al. Patient-derived tumor organoids: New progress and opportunities to facilitate precision cancer immunotherapy. Frontiers in Oncology. 12, 1382 (2022).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Chen, P., et al. Patient-derived organoids can guide personalized-therapies for patients with advanced breast cancer. Advanced Science. 8 (22), 2101176 (2021).
- Furbo, S., et al. Use of patient-derived organoids as a treatment selection model for colorectal cancer: A narrative review. Cancers. 14 (4), 1069 (2022).
- Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. Journal of Hematology & Oncology. 15 (1), 58 (2022).
- Xu, H., et al. Organoid technology in disease modelling, drug development, personalized treatment and regeneration medicine. Experimental Hematology & Oncology. 7 (1), 30 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ling, L., et al. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 576, 292-303 (2016).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 818-827 (2008).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Walsh, A. J., et al. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
- Bui, B. N., et al. Organoids can be established reliably from cryopreserved biopsy catheter-derived endometrial tissue of infertile women. Reproductive BioMedicine Online. 41 (3), 465-473 (2020).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. eLife. 5, e18489 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Protocols for Generating, Manipulating, and Analyzing Pancreatic Organoid Cultures. Cold Spring Harbor Laboratory. Tuveson Lab. , Available from: https://tuvesonlab.labsites.cshl.edu/protocolsreagents/ (2023).
