Summary
Dit artikel beschrijft hoe je fototunable hydrogels in 3D bioprint om extracellulaire matrixverstijving en fibroblastactivering te bestuderen.
Abstract
Fototeerbare hydrogels kunnen ruimtelijk en tijdelijk transformeren als reactie op blootstelling aan licht. Door dit soort biomaterialen op te nemen in celkweekplatforms en dynamisch veranderingen teweeg te brengen, zoals toenemende stijfheid van het micro-milieu, kunnen onderzoekers veranderingen in de extracellulaire matrix (ECM) modelleren die optreden tijdens fibrotische ziekteprogressie. Hierin wordt een methode gepresenteerd voor het 3D-bioprinten van een fototunable hydrogel-biomateriaal dat in staat is tot twee opeenvolgende polymerisatiereacties in een gelatine-ondersteuningsbad. De techniek van Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting werd aangepast door de pH van het steunbad aan te passen om een Michael-additiereactie te vergemakkelijken. Eerst werd de bioink met poly(ethyleenglycol)-alfamethacrylaat (PEGαMA) off-stoichiometrie gereageerd met een celafbreekbare crosslinker om zachte hydrogels te vormen. Deze zachte hydrogels werden later blootgesteld aan foto-initator en licht om de homopolymerisatie van niet-gereageerde groepen te induceren en de hydrogel te verstijven. Dit protocol omvat hydrogelsynthese, 3D-bioprinten, fotoverstijving en eindpuntkarakteriseringen om de activering van fibroblasten binnen 3D-structuren te beoordelen. De hier gepresenteerde methode stelt onderzoekers in staat om een verscheidenheid aan materialen te 3D-bioprinten die pH-gekatalyseerde polymerisatiereacties ondergaan en kunnen worden geïmplementeerd om verschillende modellen van weefselhomeostase, ziekte en herstel te ontwikkelen.
Introduction
3D-bioprinten is een transformatieve technologie die onderzoekers in staat stelt om cellen en biomaterialen nauwkeurig in 3D-volumes te deponeren en de complexe hiërarchische structuur van biologische weefsels na te bootsen. In het afgelopen decennium heeft de vooruitgang op het gebied van 3D-bioprinten geleid tot kloppend menselijk hartweefsel1, functionele modellen van nierweefsel2, modellen van gasuitwisseling in de long3 en tumormodellen voor kankeronderzoek4. De uitvinding van ingebedde 3D-bioprinttechnieken, zoals Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH) bioprinting, heeft het mogelijk gemaakt om complexe structuren van zacht weefsel, zoals longbloedvaten5 en zelfs het menselijk hart6 , in 3D te reproduceren. FRESH 3D-bioprinten vergemakkelijkt het laag-voor-laag printen van zachte bio-inkten met een lage viscositeit door extrusie in een afschuifverdunnend ondersteunend bad. Het steunbad bestaat uit een materiaal zoals dicht opeengepakte gelatine-microdeeltjes die fungeren als een Bingham-plastic en na het printen de beoogde vorm en structuur van de bio-inkt behouden. Zodra de geprinte constructie is gestold, kan het steunbad worden opgelost door de temperatuur te verhogen tot 37 °C7.
Een recent overzichtsartikel gaf een overzicht van de materialen die in verschillende publicaties zijn 3D-bioprint met behulp van de FRESH-techniek. Deze natuurlijk afgeleide materialen variëren van collageen type I tot methacrylerend hyaluronzuur en vertegenwoordigen verschillende geleringsmechanismen7. De meeste onderzoeken die met deze 3D-bioprinttechniek worden uitgevoerd, maken gebruik van statische biomaterialen die niet veranderen als reactie op externe stimuli. Dynamische fototeerbare hydrogel-biomaterialen zijn door ons laboratoriumen anderen 8,9,10,11,12 gebruikt om een verscheidenheid aan fibrotische ziekten te modelleren. In tegenstelling tot statische biomaterialen, maken fototunable bioinks het mogelijk om een verzacht model met een lagere elasticiteitsmoduluswaarde te creëren en later te verstevigen om cellulaire reacties op toename van micro-omgevingsverstijving te onderzoeken.
Fibrotische ziekten worden gekenmerkt door een toename van de productie van extracellulaire matrix die littekens en verstijving kan veroorzaken13. Weefselverstijving kan leiden tot verder letsel en vernietiging van het aangetaste weefsel, met permanente orgaanschade en zelfs de dood tot gevolg; Fibrotische aandoeningen zijn verantwoordelijk voor een derde van de sterfte wereldwijd. Fibroblasten produceren overtollige en afwijkende extracellulaire matrix in deze ziektetoestand14,15. Verhoogde proliferatie van fibroblasten en afzetting van extracellulaire matrix verstijven het weefsel verder en activeren een profibrotische positieve feedbacklus16,17,18,19. Het bestuderen van fibroblastactivering is van vitaal belang voor het begrijpen van fibrotische ziekten. Hier presenteren we menselijke pulmonale arteriële hypertensie (PAH) als een voorbeeld van een fibrotische aandoening waarbij het belangrijk is om de 3D-geometrie van het bloedvat na te bootsen met behulp van 3D-bioprinten en de dynamische verstijvingsmogelijkheden van fototeerbare hydrogels te introduceren. PAH is een aandoening waarbij de druk in de hoofdlongslagaders het normale niveau overschrijdt en het hart belast, waardoor de activering van de adventitiële fibroblast van de menselijke longslagader (HPAAF) toeneemt en de bloedvatweefsels verstijft16,17,18,19. Een fototunable poly(ethyleenglycol)-alfamethacrylaat (PEGαMA) bio-inktformulering zorgt voor temporele verstijving van constructen en helpt bij het modelleren van zowel gezond weefsel als ziekteprogressie 5,8,9,10. Door gebruik te maken van deze unieke eigenschap kan de activering en proliferatie van HPAAF worden gekwantificeerd als reactie op verstijving van micro-omgevingen in 3D en kan waardevol inzicht worden verkregen in de cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij deze ziekte. Het hier beschreven protocol stelt onderzoekers in staat om 3D-modellen te maken die veranderingen in de extracellulaire micro-omgeving tijdens ziekteprogressie of weefselherstel samenvatten en de activering van fibroblasten bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PEGαMA synthese en karakterisering
OPMERKING: De synthese van poly(ethyleenglycol)-alfamethacrylaat (PEGαMA) is aangepast aan Hewawasam et al . en uitgevoerd onder vochtvrije omstandigheden9.
- Weeg de reactanten.
OPMERKING: Weeg bijvoorbeeld 5 g 10 kg/mol 8-armig PEG-hydroxyl (PEG-OH) en 0,38 g natriumhydride (NaH) af (zie materiaaltabel). - Voeg een roerstaaf toe aan de Schlenk-kolf van 250 ml en spoel met argon.
- Los de PEG-OH op in het laagste volume watervrij tetrahydrofuraan (THF) dat nodig is voor het oplossen in de Schlenk-kolf.
OPMERKING: Ongeveer 80 ml THF lost 5 g PEG-OH op. Voeg de minimale hoeveelheid THF toe die nodig is om de PEG-OH op te lossen. - Voeg 3 keer molaire overtollige NaH toe aan het reactiemengsel en roer op kamertemperatuur (RT) gedurende 30 minuten.
- Voeg 6 maal het teveel aan ethyl-2-(broommethyl)acrylaat (EBrMA, zie materiaaltabel) druppelsgewijs toe aan de Schlenk-kolf en dek het reactievat af met aluminiumfolie om het tegen licht te beschermen. Roer de reactie ongeveer 48 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Gebruik voor 5 g PEG-OH en 0,38 g NaH 3,68 ml EBrMA voor deze reactie. - Voeg een paar druppels 1 N-azijnzuur toe om de reactie te doven. Vacuüm filteren van de oplossing door middel van een filterhulpmiddel.
OPMERKING: Door azijnzuur toe te voegen, ontstaan gasbellen. Stop met het toevoegen van azijnzuurdruppels wanneer er geen belletjes meer worden gevormd, omdat dit aangeeft dat het mengsel met succes is geblust. - Concentreer het filtraat op een roterende verdamper en sla neer in 4 °C diethylether. Laat neerslag 12-18 uur beschermd tegen licht bij 4 °C.
- Voeg een Whatman-filterpapier toe aan een Buchner-trechter. Giet het reactiemengsel langzaam over het filtreerpapier en gebruik vacuümzuiging om het neerslag van de diethylether te scheiden. Vang het neerslag op in een droge en schone filterkolf.
- Droog het product minimaal 5 uur of een nacht vacuüm bij kamertemperatuur en los het op in het minimale volume gedeïoniseerd water dat nodig is. Breng het opgeloste product over in een dialyseslang (zie Materiaaltabel) en dialyseer gedurende ten minste vier dagen tegen 3,5 L gedeïoniseerd water. Ververs het dialysewater om de 12 uur.
NOTITIE: Het product ziet er na vacuümdrogen uit als volledig droog puur wit vast poeder. - Vries het product snel in en vries het ongeveer 72 uur of totdat het volledig droog is.
- Los het product op in chloroform D (CDCl3). Voer het monster uit met behulp van 1uur NMR met een protocol dat 248 scans uitvoert met een ontspanningstijd van 2,5 s.
- Controleer de functionalisatie en zuiverheid van het product door de CDCl3-oplosmiddelpiek te kalibreren op 7.26 PPM. Integreer de piek voor PEG-backbone-protonen (d3.71) en kalibreer de integratie op 114.
- Integreer de resterende pieken: PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3): d (ppm) 1.36(t, 3H, CH 3-),3.71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4.29 (t, s, 4H, -CH 2-C(O)-O-O, -O-CH 2-C(=CH 2)-), 5.93 (q, 1H, -C=CH2), 6.34 (q, 1H, -C=CH 2) en vergelijk de integratie voor de αMA-alkeen-eindgroeppieken met de verwachte waarde (1H) op basis van de PEG-backbone-kalibratie (Figuur 1).
OPMERKING: Bereken het gemiddelde van de twee pieken met het label "a" (Figuur 1) en vermenigvuldig dit met 100 om het gemiddelde PEGαMA-functionalisatiepercentage te verkrijgen.
Figuur 1: Proton NMR bevestigde succesvolle PEGαMA-functionalisatie. NMR-analyse werd uitgevoerd in chloroform-D (CDCl3) en toonde de functionalisatie van 96,5%. PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): d (ppm) 1.36(t, 3H, CH 3-),3.71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4.29 (t, s, 4H, -CH 2-C(O)-O-O, -O-CH2-C(=CH 2)-), 5.93 (q, 1H, -C=CH 2), 6.34 (q, 1H, -C=CH 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Modelontwerp en 3D-bioprinterconfiguratie
OPMERKING: Een in de handel verkrijgbare 3D-printer (zie Tabel met materialen) werd aangepast door de thermoplastische extruder te vervangen door een op maat gemaakte spuitpompextruder en aangepast van Hinton et al.20. Open-source ontwerpen zijn online beschikbaar: https://3d.nih.gov/users/awfeinberg.
- Open de Fusion 360-software (zie Tabel met materialen) en maak een 3D-computerondersteund holle cilinderontwerp.
OPMERKING: Een downloadbaar bestand dat voor deze stap kan worden gebruikt en de geometrie van bloedvaten nabootst, is te vinden in Aanvullend bestand 1. - Sla het bestand op en open het in de Slic3r-software (zie Materiaaltabel). Controleer nogmaals of alle parameters naar wens zijn en druk vervolgens op de export-G-code-knop. Sla de G-code op de computer op.
- Open de Pronterface-software (zie Materiaaltabel) en upload het G-codebestand.
OPMERKING: De Pronterface-software werkt samen met de bioprinter en biedt voldoende controle over de hardware-invoer. Een bruikbaar G-codebestand is te vinden in Aanvullend bestand 2. - Breng de bioprinter en alle bijbehorende onderdelen over in een bioveiligheidskast (BSC) met behulp van aseptische technieken.
- Monteer een stompe naaldpunt van 30 G 0.5" lengte (zie Materiaaltabel) op de glazen drukspuit en leg opzij.
- Steek de stekker van de bioprinter in een stopcontact. Druk op de rode aan/uit-knop aan de voorkant van de bioprinter om hem in te schakelen. Sluit de USB-kabel (Universal Serial Bus) aan tussen de computer en de bioprinter en zorg ervoor dat alle draadverbindingen tot stand zijn gebracht en aangesloten.
3. Bereiding van het steunbad en de reagentia
NOTITIE: Voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast met behulp van aseptische technieken.
- Bereid celkweekmedium bestaande uit SmBM Basal Medium (CC-3181) en SmGM-2 SingleQuots-supplementen (CC-4149), met uitzondering van foetaal runderserum (FBS), volgens de instructies van de fabrikant. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
- Aliquot 50 ml van het celkweekmedium en voeg 1% v/v FBS (CC-4149) toe (zie materiaaltabel) om een medium met een laag serumgehalte te maken. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
- Resuspendeer het gelatinesuspensie volgens de instructies van de fabrikant met behulp van steriele celkweekmedia zonder FBS als oplosmiddel (zie Materiaaltabel). Stel vlak voor gebruik de uiteindelijke pH van de gelatinesuspensie in op pH 9 met behulp van 2 M kaliumhydroxide (KOH) en/of 2 M zoutzuur (HCl) om de pH van de oplossing naar behoefte aan te passen met behulp van een pH-meter.
- Vul het gewenste aantal putjes van een bord met 24 putjes, elk ongeveer halfvol, met 1 ml gelatinesuspensie per putje met behulp van een spuit zonder naald.
NOTITIE: Vul het midden van de putjes gelijkmatig en controleer of er geen luchtbellen zijn. Tik op de plaat om de microdeeltjessuspensie gelijkmatig te verdelen. Pas de hoogte en het volume van de drijfmest per put naar behoefte aan elke bioprintgrootte en -vorm aan. Gebruikers kunnen een zelfgemaakte spuit maken om de gelatinebrij in elk putje over te brengen. Dit kan worden gedaan door een spuitzuiger van de juiste grootte toe te voegen aan een reageerbuis van 50 ml die al op de bodem de samengeperste gelatinesuspensie bevat. Steek tijdens het inbrengen van de zuiger een kleine voerdraad langs de reageerbuis om de lucht te laten ontsnappen en verwijder deze wanneer de zuiger in contact komt met de gelatinesuspensie. Snijd vlak voor gebruik de punt van de reageerbuis af met een scheermesje om een gat te maken waar de gelatinesuspensie uit kan komen en druk op de zuiger. - Plaats de gevulde plaat met 24 putjes op het midden van de bioprintertafel en bevestig deze aan de tafel.
OPMERKING: Afbeelding 2 toont een generieke bioprinteropstelling. Plaats een elastiekje rond de printtafel om een plaat met 24 putjes aan het platform te bevestigen en beweging te voorkomen.
Figuur 2: Basisopstelling voor 3D-bioprinten. De bioprinter werd opgesteld in een steriele omgeving, zoals een bioveiligheidskast, en de printkop werd zo geassembleerd dat de glazen spuit en naald verticaal werden neergelaten in het afdrukgebied van het steunbad eronder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Celkweek
NOTITIE: Voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast met behulp van aseptische technieken.
- Ontdooi HPAAF-cellen (commercieel verkregen, zie Materiaaltabel) en spreid ze uit in met T-75 weefselkweek behandelde plastic kolven die SmBM Basal Medium (CC-3181) en alle SmGM-2 SingleQuots-supplementen (CC-4149) bevatten volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Standaard celkweekprotocollen voor aanhangende cellen moeten worden gebruikt, waarbij de cellen op 37 °C en 5% CO2 worden gehouden en de media om de paar dagen worden aangevuld. - Zodra de HPAAF's ~80-90% confluentie hebben bereikt, zuigt u de media op en spoelt u de cellen één keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg ongeveer 4 ml voorverwarmde 0,05% trypsine-EDTA toe aan elke T-75-kolf. Kantel de kolf om ervoor te zorgen dat het gehele celkweekoppervlak bedekt is met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing. Incubeer de kolven gedurende 3-5 minuten bij 37 °C en controleer of de cellen loskomen.
- Zodra de cellen drijven, voegt u ten minste 6 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) toe aan elke kolf en brengt u de cellen over in een conische buis van 50 ml.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren. Zuig het supernatans uit de celpellet en resuspendeer de cellen in media van 1-3 ml met FBS met behulp van een pipet van 1000 μl, zodat een eencellige suspensie ontstaat.
- Breng 10 μL van de celsuspensie over in een microcentrifugebuis. Voeg 10 μL Trypan Blue-oplossing toe en meng goed. Gebruik 10 μL van dit mengsel om cellen in een hemocytometer te tellen met behulp van een omgekeerd lichtmicroscoop.
OPMERKING: Om een uiteindelijke bioinktconcentratie van 4 x 106 cellen/ml te bereiken, werden 800.000 fibroblasten gereserveerd voor elke 200 μL bioinkt.
5. Bereiding van hydrogel bioinkt
OPMERKING: De Bioink-bereiding is aangepast van Davis-Hall et al.5. Stappen 5.1-5.2 kunnen parallel met de stappen 4.1-4.3 worden uitgevoerd om de tijd tussen celverzameling en resuspensie in de bioink te minimaliseren. Voer stappen uit in een bioveiligheidskast met behulp van een aseptische techniek.
- Bereid een 20 mM tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP, zie materiaaltabel) pH 7-oplossing en steriel filter met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm. Voeg vlak voor gebruik 2 M KOH en/of 2 M HCl toe om de pH van de oplossing naar behoefte aan te passen. Meet met pH-meter en pas dienovereenkomstig aan.
OPMERKING: TCEP vermindert disulfidebindingen. - Bereid een 0,25 mg/ml stockoplossing van PEGαMA geresuspendeerd in steriele celkweekmedia zonder FBS, 250 mM stockoplossingen van 1,4-dithiothreitol (DTT), MMP2-afbreekbare crosslinker en CGRGDS (RGD)-peptide (zie materiaaltabel), resuspendeer alles in 20 mM steriele TCEP, en een 15 gew.% stockoplossing van poly(ethyleenoxide) (PEO) in gedestilleerd (DI) water met behulp van pipetten indien nodig.
- Aan de hand van tabel 1 als richtlijn, combineert u de respectieve benodigde hoeveelheden PEGαMA, DTT, MMP2-afbreekbare crosslinker, PEO, CGRGDS en celkweekmedia met een laag serumgehalte samen met de fibroblasten in een conische buis van 50 ml.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de pH te controleren met pH-strips na het toevoegen van alle behalve de celkweekmedia, aangezien deze combinatie zou moeten resulteren in een pH die zeer dicht bij 6,2 ligt. Als er verdere pH-aanpassingen nodig zijn, houd dan bij hoeveel extra volume nodig is om de pH van de precursoroplossing aan te passen. Breng het totale volume op 200 μL door het resterende volume van het celkweekmedium toe te voegen minus het volume dat tijdens de laatste pH-aanpassing is toegevoegd. - Meng de bioinkt met behulp van een verdringingspipet om ervoor te zorgen dat de cellen afzonderlijke cellen zijn en bevestig dat de uiteindelijke precursoroplossing pH 6,2 is om base-gekatalyseerde polymerisatie tijdens 3D-bioprinten te voorkomen.
- Laad de bioinkt in de glazen spuit door de zuiger te verwijderen en een aparte spuit te gebruiken met een stompe naaldpunt van 15 gauge en een lengte van 1,5 inch (zie Materiaaltabel) bevestigd om de bioinkt van de centrifugebuis naar de spuit over te brengen, waarbij u ervoor moet zorgen dat er geen luchtbellen in de oplossing ontstaan.
- Plaats de glazen spuit in de printkop en bevestig de componenten van de printkop zodat alles stevig in elkaar zit en klaar is om te printen.
NOTITIE: Op dit punt moet de glazen spuit in de printkop een stompe naaldpunt van 30 gauge 0.5" lengte hebben om af te drukken.
| Bestanddeel | Concentratie van voorraadoplossing | Toe te voegen bedrag |
| PEGαMA | 0,25 mg/ml | 140 μL |
| DTT | 250 mM | 12,24 μL |
| MMP2 Afbreekbare Crosslinker | 250 mM | 5,25 μL |
| RGD | 250 mM | 1,6 μL |
| PEO | 15 gew.% | 33,33 μL |
| Activeringsmedia en/of reagentia voor pH-aanpassing | - | 7,58 μL |
| Fibroblasten | - | 800000 cellen |
Tabel 1: Voorbeeldvolumes die nodig zijn voor de bereiding van 200 μl bioinkt (hydrogelprecursoroplossing en fibroblastcellen).
6.3D bioprinten
NOTITIE: Voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast met behulp van aseptische technieken.
- Gebruik de richtingspijlen in de Pronterface-software om de positie van de extrusienaald in het midden van een put en in de steunbadslurry handmatig aan te passen. Laat ten minste 1 mm steunbadslurry onder de punt van de naald liggen.
NOTITIE: De software kan niet zien waar de naald zich in de ruimte bevindt. Het is volledig aan de gebruiker om de naald te verplaatsen door handmatig op de pijlen in de software te klikken (bijv. als u op de pijl omhoog klikt, wordt de naald omhoog of weg van het afdrukplatform verplaatst, enz.). Manoeuvreer de naald voorzichtig om ervoor te zorgen dat deze geen grenzen van de put raakt. - Zodra de punt van de naald zich in het midden van de slurry in de put bevindt, drukt u op de startknop in het Pronterface en wacht u tot de afdruk is voltooid om constructies te bereiken, zoals weergegeven in figuur 3A.
OPMERKING: Om één constructie te bioprinten met behulp van het meegeleverde bestand (aanvullend bestand 1), duurt het ongeveer 3 minuten. Het duurt ongeveer 5 minuten om de naald te oriënteren en te verplaatsen en vervolgens een constructie volledig van begin tot eind af te drukken. - Herhaal stap 6.1-6.2 totdat het gewenste aantal biogeprinte constructies is bereikt.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om meer constructies te maken dan nodig is om rekening te houden met mislukte afdrukken. Als er een storing optreedt, ga dan naar de volgende put, reset alles en herhaal stap 6.1-6.2 opnieuw. - Laat de putplaat op kamertemperatuur staan en dek deze af in de BSC gedurende 1 uur nadat het printen is voltooid, zodat de fototafbare hydrogel kan worden gekatalyseerd met basis.
- Plaats de putplaat met 3D-biogeprinte constructies in een steriele incubator van 37 °C en laat ze 12-18 uur staan om de ondersteuningsbadslurry weg te smelten.
Figuur 3: Experimenteel schema. Dit protocol werd beschreven in drie grote stappen: (A) 3D-bioprinten van PEGαMA holle buizen met ingebedde cellen om pulmonale vasculatuur na te bootsen. (B) Foto-initiatie van homopolymerisatiereactie om de cellulaire micro-omgeving te verstijven. (C) Beoordeling van cellulaire markers voor proliferatie en activering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7.3D Bioprinted constructcultuur en fotoverstijving
NOTITIE: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast met behulp van aseptische technieken.
- Bereid 2,2 mM lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) (zie Materiaaltabel) in PBS en steriel filter met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm. Houd de LAP-oplossing beschermd tegen licht.
- Vervang na 12-18 uur de media rond de biogeprinte constructies. Verwijder handmatig de media en het gesmolten gelatine-ondersteuningsbad in de putjes en pas op dat u de biogeprinte constructies niet verstoort.
NOTITIE: Het is handig om de media langzaam te verwijderen terwijl u de plaat in een hoek van 45° houdt, zodat de constructies in de put tevoorschijn komen en zichtbaar zijn. In elk putje met een geslaagde afdruk moet een doorzichtige hydrogelcilinder herkenbaar zijn (Figuur 4A). - Voeg een geschikte hoeveelheid laag-serummedia toe aan elk putje.
OPMERKING: Voor een plaat met 24 putjes moeten media van 700 μL per putje de biogeprinte constructies volledig bedekken. Pas indien nodig aan. - Plaats de plaat terug in de incubator en vervang de media op de monsters om de 3 dagen of in overeenstemming met het experimentele ontwerp.
- Verwijder vierentwintig uur voor het gewenste verstijvingstijdstip media uit de monsters en vervang ze door media met een laag serumgehalte, aangevuld met 2,2 mM steriel LAP.
OPMERKING: Om de structuur fluorescerend te labelen, zwelt u 3D-biogeprinte constructies in PBS aangevuld met 10 μM methacryloxyethylthiocarbamoylrhodamine B (zieT van Materialen) gedurende een nacht op en verstijft u vervolgens zoals beschreven in stap 7.6 om de structuur fluorescerend te labelen. Breng gedurende 2 dagen bij 4 °C over in PBS om overtollig rhodamine te verwijderen en beeld af met een TRITC-filter (Figuur 4B,C). - Verwijder op het gewenste verstijvingstijdstip de helft van het medium uit de te verstijven putjes en plaats de plaat met het deksel eraf onder UV-licht. Schakel het UV-licht in en versterk deze constructies door gedurende 5 minuten 10 mW/cm2 365 nm licht aan te brengen met behulp van Omnicure (zie Materiaaltabel) en een 365 nm banddoorlaatfilter (Figuur 3B).
NOTITIE: Gebruik de radiometer/fotometer om te controleren of de lichtintensiteit correct is voordat u cellen blootstelt aan UV-licht. - Verwijder de resterende media uit deze putjes en voeg verse media met een laag serumgehalte toe aan elk putje. Plaats het bord terug in de couveuse.
- Haal de plaat uit de couveuse en voer het fibroblastactiveringsonderzoek uit op het gewenste tijdstip volgens stap 9.
Figuur 4: 3D-gebioprinte hydrogelstructuren ondersteunden de levensvatbaarheid van de cel in de loop van de tijd. (A) Foto van de 3D-geprinte hydrogelstructuur in een plaat met 24 putjes. (B) Projectie van maximale intensiteit van fluorescerend gelabelde PEGαMA 3D-geprinte hydrogel. Schaalbalk = 1 mm. Microscopie met een hogere vergroting toonde poriën in de hydrogelstructuur die werden geïnduceerd door gelatinemicrodeeltjes in het FRESH bioprinting-ondersteuningsbad. (C) 3D-geprinte PEGαMA-buis met fluorescerend gelabelde verstijfde gebieden afgebeeld op een confocale microscoop (100 μm z-stack weergegeven als een projectie met maximale intensiteit) toonde ruimtelijke controle over verstijving in 3D. Schaalbalk = 500 μm. (D) HPAAF-levensvatbaarheid in 3D-biogeprinte constructen gemeten met Live/Dead-assays. Constructen met een dikte van 300 μm en 4 × 106 cellen/ml presteerden op elk tijdstip beter dan alle andere omstandigheden. De levensvatbaarheid piekte op dag 7. Deze toestand en het tijdstip werden geselecteerd voor toekomstige experimenten. Kolommen tonen de gemiddelde ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, ANOVA, Tukey HSD. (E) Representatieve confocale beelden van cellen in 3D-constructies gekleurd met levend/dood reagens op dag 7, het tijdstip met de grootste algehele levensvatbaarheid. Calceïne AM markeerde levende cellen in groen en propidiumjodide markeerde dode cellen in rood. De meest rechtse kolom laat zien dat de best presterende conditie een uniforme celverdeling en een hoog percentage levende cellen had. Schaalbalk = 500 μm. Gereproduceerd met toestemming van Davis-Hall et al.5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
8. De beoordeling van de levensvatbaarheid van fibroblasten
- Kleuring op de gewenste levensvatbaarheidstijdstippen met calceïne AM en propidiumjodide (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Samenvattend moeten media uit elk putje worden verwijderd en moeten de constructies worden gespoeld met steriel PBS. Incubeer de constructies in een levende/dode kleuringsoplossing gedurende 40 minuten bij 37°C op een wipstoel. De kleuringsoplossing moet calceïne AM (1:1000 verdunning) en propidiumjodide (1:1000 verdunning) bevatten om levende of dode cellen te identificeren bij beeldvorming. - Breng de constructies over in steriele PBS en breng ze onmiddellijk in beeld met een confocale fluorescentiemicroscoop. Verkrijg drie verschillende 100 μm z-stack-beelden per monster per tijdstip en druk de levensvatbaarheid uit als het gemiddelde percentage levende cellen (Figuur 4D,E).
9. De beoordeling van fibroblastactivering
- Bereid 3% w/v runderserumalbumine (BSA) en 0,1% v/v Tween 20 in PBS. Deze oplossing wordt de immunofluorescentie (IF)-oplossing genoemd.
- Verwijder op de gewenste tijdstippen media uit de monsterputjes en spoel de constructies met PBS. Vervang de PBS door 4% paraformaldehyde (PFA) en bewaar deze monsters 30 minuten op 37 °C op een wipstoel. Vervang vervolgens de 4% PFA door 100 mM glycine in PBS en laat deze monsters nog 15 minuten op een tuimelaar bij kamertemperatuur (RT) staan.
- Breng deze monsters vervolgens over in Tissue-Tek Cryomalls, bedek het monster volledig met een oplossing voor optimale snijtemperatuur (OCT) (zie Materiaaltabel) en laat de OCT gedurende 12-18 uur bij 4 °C in de monsters diffunderen.
- Vries de in OCT gedrenkte monsters snel in 2-methylbutaan in met behulp van vloeibare stikstof. Vul een piepschuimdoos of een andere geschikte container met vloeibare stikstof en plaats vervolgens een tweede container gevuld met 2-methylbutaan in de vloeibare stikstof zodat deze ten minste voor de helft ondergedompeld is. Gebruik een pincet om elke cryomal met een met OCT bedekt monster in vloeibare stikstof gekoeld 2-methylbutaan vast te houden totdat het zichtbaar bevroren is. Deze monsters kunnen bij -80 °C worden bewaard totdat ze klaar zijn voor cryosectie.
LET OP: Persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) zoals koude beschermende handschoenen, een koudebeschermingsschort en gelaatsscherm in de cryogene veiligheidskit (zie tabel met materialen) moeten worden gebruikt bij het hanteren van vloeibare stikstof. - Cryosectie van de ingevroren OCT-monsters bij -22 °C en bevestig plakjes van 10 μm dik aan positief geladen glazen microscoopglaasjes. Maak drie microscoopglaasjes met ten minste 3-5 cryosecties per objectglaasje voor elk 3D-hydrogelmonster.
OPMERKING: De objectglaasjes kunnen op dit punt bij -80 °C worden bewaard als dat nodig is als stoppunt. - Fixeer de cryosecties gedurende 15 minuten in ijskoude aceton om de cryosecties aan de objectglaasjes te laten hechten. Spoel de cryosecties voorzichtig af met RT-water om eventuele resterende OCT te verwijderen. Laat deze monsters drogen en schets de cryosecties met een hydrofobe pen (zie Materiaaltabel).
- Permeabiliseer de monsters bij kamertemperatuur met 0,2% v/v Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten en blokkeer vervolgens de secties met 5% BSA w/v in PBS gedurende 1 uur bij RT.
- Voeg het primaire anti-humane alfa-gladde spieractine (αSMA)-antilichaam van de muis (verdunning 1:250) (zie materiaaltabel) toe aan de IF-oplossing. Bewaar deze in secties verdeelde monsters met het primaire antilichaam erop een nacht bij 4 °C. Spoel de monsters 3x met IF-oplossing.
- Incubeer de secties in IF-oplossing met het secundaire geitenanti-muis Alexa Fluor 555-antilichaam (1:250 verdunning) en twee druppels ActinGreen 488 ReadyProbe (zie materiaaltabel) per milliliter IF-oplossing. Bedek de monsters voor alle volgende stappen met aluminiumfolie om ze tegen licht te beschermen en laat de secundaire antilichaamoplossing gedurende 1 uur bij RT op de monsters blijven.
- Spoel de secties 3x met IF-oplossing. Incubeer ze in 300 nM 4',6-diamidino-2-phylindole (DAPI) in DI-water gedurende 15 minuten bij RT. Voer een laatste spoeling van de secties 3x uit met DI-water.
- Gebruik 10 μl van een in de handel verkrijgbaar antifade-reagens (zie Materiaaltabel) en dek de secties af met behulp van standaardmethoden.
NOTITIE: De gemonteerde objectglaasjes kunnen beschermd tegen licht worden bewaard in een vriezer van -80 °C totdat ze nodig zijn voor beeldvorming. - Breng de cryosecties in beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Figuur 3C en Figuur 5B). Stel je drie willekeurige secties per dia voor met een 10x objectief.
OPMERKING: Beelden moeten worden gemaakt in de DAPI-, FITC- en TRITC-kanalen. - Upload de afbeeldingen naar ImageJ (NIH). Kwantificeer het percentage αSMA-positieve cellen als een maat voor de activering van fibroblasten (figuur 5A) door het totale aantal αSMA-positieve cellen te delen door het totale aantal celkernen voor elk gezichtsveld.
Figuur 5: Fibroblast activatie in 3D-biogeprinte modellen van pulmonale arteriële adventitie. (A) Fibrotische activatie in zachte en verstijfde 3D-hydrogels gemeten aan de hand van αSMA-expressie. HPAAF's in verstijfde constructen waren significant positiever voor αSMA dan cellen in zachte constructen. Kolommen vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, Mann-Whitney U-test. (B) Representatieve confocale beelden van immunokleuring voor αSMA, actine en DAPI in zachte en verstijfde 3D-hydrogels. HPAAF's in verstijfde constructen vertoonden meer voorkomende αSMA-immunofluorescentie dan cellen in zachte constructen. Schaalbalk = 250 μm. (C) Proliferatie van fibroblasten in zachte en verstijfde 3D-biogeprinte constructies gemeten door EdU-positiviteit. HPAAF's in verstijfde constructen waren significant positiever voor EdU dan cellen in zachte constructen. Kolommen vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, Mann-Whitney U-test. (D) Representatieve confocale beelden van immunokleuring voor EdU- en Hoechst-kleurstof in zachte en verstevigde 3D-hydrogels. HPAAF's in verstijfde constructen vertoonden meer voorkomende EdU-immunofluorescentie dan cellen in zachte constructen. Schaalbalk = 300 μm. Gereproduceerd met toestemming van Davis-Hall et al.5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
10. De beoordeling van de proliferatie van fibroblasten
- Verwijder vierentwintig uur voor een gewenst proliferatietijdstip de celkweekmedia uit elk putje en vervang deze door media met een laag serumgehalte, aangevuld met 10 μM EdU-oplossing uit de in de handel verkrijgbare celproliferatiekit (zie materiaaltabel). Breng de monsters terug naar de incubator voor een nacht incubatie.
- Fixeer de met EdU geïncubeerde monsters met 4% PFA bij 37 °C gedurende 30 minuten op een wip op het gewenste proliferatietijdstip. Vervang de 4% PFA-oplossing door 100 mM glycine in PBS en incubeer monsters bij 37 °C gedurende ten minste 15 minuten. Voeg de Hoechst in een geschikte concentratie gedurende 30 minuten toe en spoel de constructen vervolgens 2x met PBS.
NOTITIE: De monsters kunnen beschermd tegen licht bij 4 °C worden bewaard tot beeldvorming. - Breng alle vaste en opgeslagen EdU-monsters in beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop en voorgestelde instellingen en filters van de fabrikant van de celproliferatiekit (Figuur 3C en Figuur 5D). Verkrijg drie verschillende 100 μm z-stack-beelden per sample en creëer maximale projecties van elk van deze z-stacks. Meet de HPAAF-proliferatie door het aantal EdU-positieve cellen te tellen en te delen door het totale aantal cellen dat door Hoechst is geïdentificeerd in de maximale projectiebeelden (Figuur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft hoe fotoafstembare hydrogels in een steunbad in 3D bioprint om constructies te creëren die in staat zijn tot dynamische en temporele verstijving voor het bestuderen van fibroblastactivering in geometrieën die menselijke weefsels nabootsen. Ten eerste legde het protocol uit hoe PEGαMA, de ruggengraat van dit fototafbare polymeersysteem, kon worden gesynthetiseerd. Metingen van nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie toonden een succesvolle PEGαMA-functionalisatie bij 96,5% (Figuur 1). Functionalisatiewaarden van 90% of hoger zijn acceptabel voor deze procedure. Vervolgens worden details gepresenteerd over het maken van een 3D CAD-model van een holle cilinder om pulmonale vasculatuur na te bootsen. Een downloadbaar 3D CAD-model is beschikbaar in aanvullend bestand 1, terwijl de bijbehorende G-code voor dit ontwerp beschikbaar is in aanvullend bestand 2. Dit CAD-model produceerde constructies met de volgende afmetingen: 4 mm hoogte, 4 mm binnendiameter en 300 μm wanddikte.
Instructies voor het instellen van de bioprinter worden weergegeven (Afbeelding 2). Het stevig monteren van de printkop en het vastmaken ervan zodat de glazen spuit en naald bio-inkt rechtstreeks in een putje met het onderliggende steunbad extruderen, is een cruciale stap (Afbeelding 2 en Afbeelding 3A). Tabel 1 bevat de informatie die nodig is voor het opstellen van de voorraadconcentraties voor de bio-inktcomponenten en de juiste volumes die moeten worden gecombineerd om de bio-inktsamenstelling te bereiken die in deze onderzoeken als representatieve resultaten wordt gebruikt. De uiteindelijke bioink-formulering was 17,5 gew.% PEGαMA met 0.375 molaire verhouding (αMA:thiol) van 70:30 DTT:MMP2-afbreekbare crosslinkers, 2 mM CGRGDS en 2.5 gew.% PEO. Deze reactie bindt covalent het CGRGDS-peptide in het hydrogelnetwerk door een reactie tussen een vrij thiol op de cystine en een αMA-deel. De pH van bioink en steunbadslurry-oplossingen werd aangepast naar waarden van respectievelijk 6,2 en 9. Deze combinatie van een zure bioink en basische ondersteuningsbadsuspensie vergemakkelijkte de polymerisatie van de 3D-biogeprinte constructies en handhaafde de cilindrische structuren (Figuur 4A-C). Op dag 7 waren 91 ± 2% van de cellen levend gekleurd en op dag 14 waren 85 ± 3% nog steeds levensvatbaar (gemiddelde ± SEM, ANOVA, Tukey HSD) en statistisch significant met p < 0,05 (Figuur 4D,E).
Ten slotte werd in dit protocol gedetailleerd beschreven hoe de 3D-biogeprinte constructen kunnen worden verstijven door middel van foto-initiatie (Figuur 3B) van secundaire polymerisatiereactie met niet-gereageerde αMA-groepen. Het originele manuscript van Davis-Hall et al. toonde door middel van parallelle plaatreologie aan dat de 3D-biogeprinte constructies een initiële elastische modulus hadden van 4,7 ± 0,09 kPa en na foto-geïnitieerde verstijving toenamen tot 12,8 ± 0,47 kPa5. De activering van fibroblasten werd op dag 7 beoordeeld door het aantal fibroblasten te kwantificeren dat alfa-gladde spieractine (αSMA) tot expressie brengt. Een groter percentage van de fibroblasten in verstijfde hydrogelconstructen werd geactiveerd (88 ± 2%) in vergelijking met zachte monsters (65 ± 4%) (gemiddelde ± SEM, Mann-Whitney U-test) met statistische significantie van p < 0,05 (Figuur 5A,B). Evenzo waren 66 ± 6% van de fibroblasten in de verstijfde constructen positief voor EdU, een proliferatiemarker, vergeleken met 39 ± 6% van de fibroblasten in de zachte toestand (gemiddelde ± SEM, Mann-Whitney U-test) met een statistische significantie van p < 0,05 (Figuur 5C,D). Samen ondersteunen deze resultaten dat een verstijfde micro-omgeving de fibrotische activeringsmarkers in 3D-biogeprinte modellen aanzienlijk verhoogde.
Aanvullend bestand 1: CAD-bestand (Computer-aided design). De vijl bevat een cilindergeometrie van 4 mm hoog, 4 mm binnendiameter en 300 μm dikte. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: G-code bestand. De vijl wordt geassocieerd met een cilindergeometrie van 4 mm hoog, 4 mm binnendiameter en 300 μm dikte. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tweetraps polymerisatiereacties als reactie op gecontroleerde blootstelling aan licht kunnen biomaterialen verstijven met ruimtelijke en temporele controle. Verschillende studies hebben deze techniek gebruikt om cel-matrixinteracties in verschillende platforms te evalueren 5,8,9,10,11,21,22,23. Meer specifiek kunnen fotomaskers of excitatiemethoden met twee fotonen worden gebruikt om discrete secties van een 3D-gebioprint construct te verstijven en te onderzoeken hoe cellen reageren op dynamische verstijving in besloten gebieden of interfaces, zoals beschreven in onze eerdere publicaties 5,8. Het kiezen van zinvolle tijdstippen om celreacties te beoordelen is cruciaal. Hier werden constructen verstijfd nadat fibroblasten zich hadden kunnen verspreiden in de MMP-afbreekbare fototeerbare hydrogel om activeringsstudies mogelijk te maken8. Dit protocol beschrijft hoe een fototunable hydrogel-bioink kan worden ontwikkeld en 3D-biogeprinte constructies kunnen worden gemaakt met behulp van bio-inkt en een ondersteuningsbadcombinatie die een pH-gekatalyseerde polymerisatiereactie op gang bracht. De polymerisatie van 3D-biogeprinte constructies met verschillende geometrieën die zijn ontworpen om pulmonale vasculatuur na te bootsen, werd vergemakkelijkt door zure bio-inkt te extruderen in basische ondersteuningsbadsuspensie. In vivo weefselverstijving is een kenmerkend kenmerk van fibrose en het is algemeen bekend dat mechanische veranderingen in de cellulaire micro-omgeving krachtige aanjagers zijn van ziekteprogressie 10,23,24,25. Daarom hebben dit protocol en platform een enorm potentieel om belangrijke details te verstrekken over de mechanosensitieve cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij fibrotische pathogenese. De mogelijkheid om de geometrie en eigenschappen van het construct te wijzigen, specifieke tijdstippen te bepalen om verstijving te initiëren en te beslissen welk type cellen in de bioink moet worden opgenomen, zijn onmiskenbare voordelen van deze methode. Deze variabelen kunnen worden aangepast om andere pH-gekatalyseerde biomaterialen en de effecten van verstijving van micro-omgevingsfactoren te bestuderen die relevant zijn voor andere biologische toepassingen.
PEGαMA werd geselecteerd als de bioink-ruggengraat omdat het hydrolytisch stabiel en reactiever is dan andere veelgebruikte tweetrapspolymerisatiesystemen zoals poly(ethyleenglycol) methacrylaat (PEGMA)5,8,9. Een MMP2-afbreekbare peptidesequentie werd opgenomen als een crosslinker om adventitiële fibroblasten in staat te stellen MMP2-endopeptidasen te produceren om de extracellulaire micro-omgeving te hermodelleren26. Onze groep en anderen hebben aangetoond dat de aanwezigheid van celafbreekbare crosslinker de verspreiding van fibroblasten verbetert en een kenmerk is dat nodig is voor activering 5,27. Hoge PEGαMA-functionalisatie is van cruciaal belang voor het succes van dit protocol, vooral omdat de niet-gereageerde αMA-groepen de klikchemiefunctie mogelijk maken. PEGαMA met functionalisatie boven de 95% is het beste, maar 90% gefunctionaliseerde PEGαMA heeft met dit protocol gewerkt. Als de functionalisatie van de PEGαMA lager is dan gewenst, kan dit leiden tot inconsistente polymerisatie, vooral wanneer er sprake is van een hoge celdichtheid. Om deze uitdaging het hoofd te bieden, wordt aanbevolen rekening te houden met het volume van de celpellet en dit volume af te trekken van het volume van de celkweekmedia en pH-aanpassingsreagentia die in tabel 1 zijn toegevoegd. Luchtbellen in het steunbad, voortijdige polymerisatie in de spuit of onjuiste pH-waarden van de verschillende hierboven beschreven oplossingen zijn andere veel voorkomende faalmechanismen die met dit protocol zijn waargenomen.
Aanpassingen aan de pH van de bioink en het ondersteuningsbad moeten voor elk experiment afzonderlijk worden uitgevoerd om rekening te houden met variatie van batch tot batch of veranderingen in pH in de loop van de tijd. Toen bijvoorbeeld pH 7 TCEP werd gebruikt om deze bioink-componenten te resuspenderen met bepaalde PEGαMA-batches, moest de totale bioink-pH dichter bij 7-7,5 worden aangepast in plaats van 6,2. Eerder werk toont aan dat fibroblasten die worden blootgesteld aan pH-aangepaste media variërend van 6,2-9 deze pH-veranderingen kunnen weerstaan en hunlevensvatbaarheid kunnen behouden. Bovendien heeft eerder werk aangetoond dat gecontroleerde blootstelling aan UV-licht die wordt gebruikt om hydrogels te polymeriseren met cellen die erin zijn ingebed, minimale effecten heeft op de levensvatbaarheid van de cel en het fibroblasttranscriptoom 8,9,10,28 niet verandert. Als echter een lage levensvatbaarheid van cellen wordt gemeten, moet pH-aanpassing de eerste stap zijn die wordt genomen om dit probleem aan te pakken. Het is algemeen bekend dat pH een significante invloed heeft op de levensvatbaarheid van cellen 5,9,29, dus gebruikers moeten vergelijkbare levensvatbaarheidstests uitvoeren met specifieke cellijnen die mogelijk gevoeliger zijn voor pH-aanpassingen. Bovendien wordt aangeraden om, voordat u grootschalige experimenten probeert, eventuele afwijkingen van dit protocol te testen met kleine batchgroottes.
Momenteel heeft de in-house bioprinter slechts één extrusieprintkop en vereist hij aanzienlijke tijdrovende gebruikersinput om de naald handmatig te oriënteren en printopdrachten te geven voor elk monster. In de handel verkrijgbare bioprinters30,31,32 pakken deze beperkingen wel aan, maar zijn aanzienlijk duurder. Toekomstig werk is gericht op het printen van constructies met meerdere lagen die een ander celtype bevatten om alle drie de verschillende longvatlagen (tunica intima, tunica media en tunica adventitia) na te bootsen. Werk van anderen bewijst al dat deze bioprinttechniek met niet-fototeerbare materialen geavanceerde en geometrisch complexe modellen kan produceren, waaronder het splitsen van bloedvatstructuren en het hele menselijk hart 6,7,20,33. De methoden in dit protocol kunnen worden gereproduceerd met verschillende bioprinters. Dit zal onderzoekers in staat stellen om een verscheidenheid aan materialen te 3D-bioprinten die pH-gekatalyseerde polymerisatiereacties ondergaan en een willekeurig aantal modellen van weefselhomeostase, ziekte en herstel te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken. Delen van dit manuscript zijn gereproduceerd met toestemming van © IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf. 5 Alle rechten voorbehouden.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) en degenen die de 3D Bioprinting Open-Source Workshop organiseerden, erkennen. Deze personen maakten het mogelijk om de technieken van FRESH bioprinting te leren en de 3D-bioprinter te bouwen die voor deze studies werd gebruikt. Daarnaast willen de auteurs Biorender.com erkennen, die in dit manuscript is gebruikt om cijfers te produceren. Dit werk werd ondersteund door meerdere groepen of financieringsbronnen, waaronder de Rose Community Foundation (DDH en CMM), een Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH en CMM), de National Science Foundation onder Award 1941401 (CMM), het Department of the Army onder Award W81XWH-20-1-0037 (CMM), het National Cancer Institute van de NIH onder Award R21 CA252172 (CMM), het Ludeman Family Center for Women's Health Research aan de Anschutz Medical Campus van de Universiteit van Colorado (DDH en CMM), het National Heart, Lung and Blood Institute van de National Institutes of Health onder Awards R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) en T32 HL072738 (DDH en AT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
References
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
- Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
- Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
- Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
- Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
- Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
- Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904 (2021).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
- Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792 (2012).
- Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2 (2014).
- Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
- Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
- Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
- Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387 (2016).
- Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
- Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H.
- Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
- Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
- Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
- Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
- Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758 (2023).
- Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871 (2023).
- Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550 (2023).
- Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047 (2022).
