Summary
Bu makale, hücre dışı matris sertleşmesini ve fibroblast aktivasyonunu incelemek için fototize edilebilir hidrojellerin 3D biyo-baskısının nasıl yapılacağını açıklamaktadır.
Abstract
Fototize olabilen hidrojeller, ışığa maruz kalmaya yanıt olarak uzamsal ve zamansal olarak dönüşebilir. Bu tür biyomalzemelerin hücre kültürü platformlarına dahil edilmesi ve mikroçevresel sertliğin arttırılması gibi değişikliklerin dinamik olarak tetiklenmesi, araştırmacıların fibrotik hastalığın ilerlemesi sırasında meydana gelen hücre dışı matristeki (ECM) değişiklikleri modellemelerini sağlar. Burada, bir jelatin destek banyosu içinde iki ardışık polimerizasyon reaksiyonu gerçekleştirebilen, fototize edilebilir bir hidrojel biyomalzemenin 3D biyo-baskısı için bir yöntem sunulmaktadır. Askıda Hidrojellerin Serbest Biçimli Tersinir Gömülmesi (FRESH) biyo-baskı tekniği, bir Michael ekleme reaksiyonunu kolaylaştırmak için destek banyosunun pH'ı ayarlanarak uyarlandı. İlk olarak, poli(etilen glikol)-alfa metakrilat (PEGαMA) içeren biyomürekkep, yumuşak hidrojeller oluşturmak için hücrede parçalanabilen bir çapraz bağlayıcı ile stokiyometri dışı reaksiyona sokuldu. Bu yumuşak hidrojeller daha sonra reaksiyona girmemiş grupların homopolimerizasyonunu indüklemek ve hidrojeli sertleştirmek için fotoinitatör ve ışığa maruz bırakıldı. Bu protokol, 3D yapılar içinde fibroblast aktivasyonunu değerlendirmek için hidrojel sentezi, 3D biyo-baskı, fotosertleştirme ve son nokta karakterizasyonlarını kapsar. Burada sunulan yöntem, araştırmacıların pH katalizli polimerizasyon reaksiyonlarına giren çeşitli malzemeleri 3D biyo-baskı yapmalarını sağlar ve çeşitli doku homeostazı, hastalık ve onarım modellerini tasarlamak için uygulanabilir.
Introduction
3D biyobaskı, araştırmacıların hücreleri ve biyomalzemeleri 3D hacimler içinde hassas bir şekilde biriktirmelerini ve biyolojik dokuların karmaşık hiyerarşik yapısını yeniden oluşturmalarını sağlayan dönüştürücü bir teknolojidir. Son on yılda, 3D biyo-baskıdaki gelişmeler, atan insan kalp dokuları 1, böbrek dokularınınfonksiyonel modelleri2, akciğer içindeki gaz değişimi modelleri3 ve kanser araştırmaları için tümör modelleri4 yarattı. Askıda Hidrojelin Serbest Biçimli Tersinir Gömülmesi (FRESH) biyo-baskı gibi gömülü 3D biyo-baskı tekniklerinin icadı, pulmoner kan damarları5 ve hatta insan kalbi6 gibi karmaşık yumuşak doku yapılarının 3D olarak yeniden üretilmesini mümkün kılmıştır. FRESH 3D biyobaskı, yumuşak ve düşük viskoziteli biyomürekkeplerin bir kesme inceltme destek banyosuna ekstrüzyon yoluyla katman katman basılmasını kolaylaştırır. Destek banyosu, bir Bingham plastiği görevi gören ve baskıdan sonra biyomürekkebin amaçlanan şeklini ve yapısını koruyan, sıkıca paketlenmiş jelatin mikropartiküller gibi bir malzemeden oluşur. Basılı yapı katılaştıktan sonra, destek banyosu sıcaklık 37 °C'ye yükseltilerek çözülebilir7.
Yakın tarihli bir inceleme makalesi, FRESH tekniği kullanılarak çeşitli yayınlarda 3D biyo-basılmış materyalleri özetledi. Bu doğal olarak elde edilen malzemeler, kollajen tip I'den metakrillenmiş hyaluronik aside kadar çeşitlilik gösterir ve birkaç farklı jelleşme mekanizmasını temsil eder7. Bu 3D biyo-baskı tekniği kullanılarak gerçekleştirilen çoğu araştırma çalışması, dış uyaranlara yanıt olarak değişmeyen statik biyomalzemeler kullanır. Dinamik fototable hidrojel biyomalzemeler, laboratuvarımız ve diğerleri 8,9,10,11,12 tarafından çeşitli fibrotik hastalıkları modellemek için kullanılmıştır. Statik biyomalzemelerin aksine, fototize edilebilen biyomürekkepler, daha düşük elastik modül değerine sahip yumuşatılmış bir modelin oluşturulmasına ve daha sonra mikroçevresel sertleşmedeki artışlara hücresel tepkileri keşfetmek için sertleştirilmesine izin verir.
Fibrotik hastalıklar, yara izi ve sertleşmeye neden olabilen hücre dışı matriks üretiminde bir artış ile karakterizedir13. Doku sertleşmesi, etkilenen dokunun daha fazla yaralanmasını ve tahribatını başlatarak kalıcı organ hasarına ve hatta ölüme neden olabilir; Fibrotik bozukluklar dünya çapında mortalitenin üçte birinden sorumludur. Fibroblastlar bu hastalık durumunda aşırı ve anormal hücre dışı matriks üretir14,15. Artan fibroblast proliferasyonu ve hücre dışı matriks birikimi dokuyu daha da sertleştirir ve profibrotik pozitif geri besleme döngüsünü aktive eder16,17,18,19. Fibroblast aktivasyonunu incelemek, fibrotik hastalıkları anlamak için hayati önem taşır. Burada, insan pulmoner arteriyel hipertansiyonunu (PAH), 3D biyobaskı kullanarak kan damarının 3D geometrisini taklit etmenin ve fototable hidrojellerin dinamik sertleştirme yeteneklerini tanıtmanın önemli olduğu bir fibrotik bozukluğa örnek olarak sunuyoruz. PAH, ana pulmoner arterlerdeki basıncın normal seviyeleri aştığı ve kalbe baskı uyguladığı, insan pulmoner arter adventisyel fibroblast (HPAAF) aktivasyonunu arttırdığı ve kan damarı dokularını sertleştirdiği bir durumdur16,17,18,19. Fototize edilebilir bir poli (etilen glikol) -alfa metakrilat (PEGαMA) biyomürekkep formülasyonu, yapılarda zamansal sertleşmeye izin verir ve hem sağlıklı doku hem de hastalık ilerlemesini modellemeye yardımcı olur 5,8,9,10. Bu benzersiz özellikten yararlanmak, 3D'de mikroçevresel sertleşmeye yanıt olarak HPAAF aktivasyonunun ve proliferasyonunun ölçülmesini sağlar ve bu hastalıkta yer alan hücresel mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Burada açıklanan protokol, araştırmacıların hastalığın ilerlemesi veya doku onarımı sırasında hücre dışı mikro ortamdaki değişiklikleri özetleyen ve fibroblast aktivasyonunu inceleyen 3D modeller oluşturmasına olanak sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PEGαMA sentezi ve karakterizasyonu
NOT: Poli (etilen glikol) -alfa metakrilat (PEGαMA) sentezi Hewawasam ve ark. ve nemsiz koşullar altında gerçekleştirildi9.
- Reaktanları tartın.
NOT: Örneğin, 5 g 10 kg/mol 8 kollu PEG-hidroksil (PEG-OH) ve 0,38 g sodyum hidrit (NaH) tartın (Malzeme Tablosuna bakın). - 250 mL Schlenk şişesine bir karıştırma çubuğu ekleyin ve argon ile temizleyin.
- PEG-OH'yi Schlenk şişesi içinde çözünme için gereken en düşük susuz tetrahidrofuran (THF) hacminde çözün.
NOT: Yaklaşık 80 mL THF, 5 g PEG-OH'yi çözecektir. PEG-OH'yi çözmek için gereken minimum THF miktarını ekleyin. - Reaksiyon karışımına 3 kat molar fazla NaH ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakika karıştırın.
- Schlenk şişesine damla damla 6 kat fazla Etil 2- (bromometil) akrilat (EBrMA, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve reaksiyon kabını ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün. Reaksiyonu oda sıcaklığında yaklaşık 48 saat karıştırın.
NOT: 5 g PEG-OH ve 0.38 g NaH için, bu reaksiyon için 3.68 mL EBrMA kullanın. - Reaksiyonu söndürmek için birkaç damla 1 N asetik asit ekleyin. Çözeltiyi bir filtrasyon yardımcısı aracılığıyla vakumla filtreleyin.
NOT: Asetik asit eklemek gaz kabarcıkları oluşturacaktır. Kabarcıklar oluşmayı bıraktığında asetik asit damlaları eklemeyi bırakın, çünkü bu, karışımın başarıyla söndürüldüğünü gösterir. - Süzüntüyü bir döner buharlaştırıcı üzerinde yoğunlaştırın ve 4 °C dietil eter içinde çökeltin. Çökeltiyi 4 °C'de 12-18 saat ışıktan koruyarak bırakın.
- Bir Buchner hunisine bir Whatman filtre kağıdı ekleyin. Reaksiyon karışımını filtre kağıdının üzerine yavaşça dökün ve çökeltiyi dietil eterden ayırmak için vakum emiş kullanın. Çökeltiyi kuru ve temiz bir filtrasyon şişesinde toplayın.
- Ürünü en az 5 saat veya gece boyunca oda sıcaklığında vakumla kurutun ve gereken minimum deiyonize su hacminde çözün. Çözünmüş ürünü diyaliz tüpüne aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve en az dört gün boyunca 3,5 L deiyonize suya karşı diyalize edin. Diyaliz suyunu her 12 saatte bir değiştirin.
NOT: Ürün, vakumla kurutmadan sonra tamamen kuru saf beyaz katı toz olarak görünecektir. - Ürünü hızlı dondurun ve yaklaşık 72 saat veya tamamen kuruyana kadar liyofilize edin.
- Ürünü kloroform D (CDCl3) içinde çözün. Örneği, 2,5 sn gevşeme süresiyle 248 tarama gerçekleştiren bir protokolle 1H NMR kullanarak çalıştırın.
- CDCl3 çözücü tepe noktasını 7.26 PPM'ye kalibre ederek ürünün işlevselleşmesini ve saflığını doğrulayın. PEG omurga protonları (d3.71) için tepe noktasını entegre edin ve entegrasyonu 114'e kalibre edin.
- Kalan tepe noktalarını entegre edin: PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl 3): d (ppm) 1.36(t, 3H, CH 3-),3.71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4.29 (t, s, 4H, -CH 2-C(O)-O-O, -O-CH 2-C(=CH 2)-), 5.93 (q, 1H, -C=CH 2), 6.34 (q, 1H, -C=CH2) ve αMA alken uç grubu pikleri için integrasyonu PEG omurga kalibrasyonuna dayalı olarak beklenen değerle (1H) karşılaştırın (Şekil 1).
NOT: "a" olarak etiketlenmiş iki tepe noktasının ortalamasını alın (Şekil 1) ve ortalama PEGαMA işlevselleştirme yüzdesini elde etmek için 100 ile çarpın.
Şekil 1: Proton NMR, PEGαMA işlevselleştirmesinin başarılı olduğunu doğruladı. NMR analizi kloroform-D (CDCl3)'de yapıldı ve %96.5 oranında fonksiyonelleşme gösterdi. PEGαMA 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): d (ppm) 1.36(t, 3H, CH 3-),3.71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4.29 (t, s, 4H, -CH 2-C(O)-O-O, -O-CH 2-C(=CH 2)-), 5.93 (q, 1H, -C=CH 2), 6.34 (q, 1H, -C=CH2). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Model tasarımı ve 3D biyoyazıcı kurulumu
NOT: Ticari olarak temin edilebilen bir 3D yazıcı (Malzeme Tablosuna bakınız), termoplastik ekstrüderin özel yapım bir şırınga pompası ekstrüderi ile değiştirilmesiyle modifiye edilmiş ve Hinton ve ark.20'den uyarlanmıştır. Açık kaynaklı tasarımlar çevrimiçi olarak mevcuttur: https://3d.nih.gov/users/awfeinberg.
- Fusion 360 yazılımını açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 3B bilgisayar destekli içi boş silindir tasarımı yapın.
NOT: Bu adım için kullanılabilecek ve kan damarı geometrisini taklit eden indirilebilir bir dosya Ek Dosya 1'de bulunabilir. - Dosyayı kaydedin ve Slic3r yazılımında açın (bkz. Tüm parametrelerin istediğiniz gibi olduğunu iki kez kontrol edin ve ardından dışa aktarma G kodu düğmesine basın. G kodunu bilgisayara kaydedin.
- Pronterface yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve G kodu dosyasını yükleyin.
NOT: Pronterface yazılımı, biyoyazıcı ile arayüz oluşturur ve yeterli donanım girişi kontrolü sağlar. Kullanılabilir bir G kodu dosyası Ek Dosya 2'de bulunabilir. - Biyoyazıcıyı ve ilgili tüm parçaları aseptik teknikler kullanarak bir biyogüvenlik kabinine (BSC) aktarın.
- 30 G 0.5" uzunluğunda kör bir iğne ucunu ( Malzeme Tablosuna bakın) baskı camı şırıngasına monte edin ve bir kenara koyun.
- Biyoyazıcının güç kablosunu bir prize takın. Açmak için biyoyazıcının önündeki kırmızı güç düğmesine basın. Evrensel seri veri yolu (USB) kablosunu bilgisayar ve biyoyazıcı arasına bağlayın ve tüm kablo bağlantılarının kurulduğundan ve takılı olduğundan emin olun.
3. Destek banyosu ve reaktiflerin hazırlanması
NOT: Tüm adımları aseptik teknikler kullanarak bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
- Üreticinin talimatlarına göre fetal sığır serumu (FBS) hariç SmBM Bazal Ortam (CC-3181) ve SmGM-2 SingleQuots takviyelerinden (CC-4149) oluşan hücre kültürü ortamını hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- Düşük serumlu bir ortam yapmak için 50 mL hücre kültürü ortamını ayırın ve% 1 v / v FBS (CC-4149) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- Jelatin bulamaç tozunu, çözücü olarak FBS içermeyen steril hücre kültürü ortamı kullanarak üreticinin talimatlarına göre yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu). Kullanmadan hemen önce, bir pH metre kullanarak çözelti pH'ını gerektiği gibi ayarlamak için 2 M potasyum hidroksit (KOH) ve/veya 2 M hidroklorik asit (HCl) kullanarak jelatin bulamacının son pH'ını pH 9'a ayarlayın.
- İğnesiz bir şırınga kullanarak kuyu başına 1 mL jelatin bulamacı kullanarak, her biri yaklaşık yarısı dolu olan 24 oyuklu bir plakanın istenen sayıda oyuğunu doldurun.
NOT: Kuyucukların ortasını eşit şekilde doldurun ve hava ceplerinin bulunmadığını onaylayın. Mikropartikül bulamacının eşit şekilde dağılmasına yardımcı olmak için plakaya dokunun. Her bir biyo-baskı boyutuna ve şekline uyum sağlamak için bulamacın yüksekliğini ve hacmini gerektiği gibi ayarlayın. Kullanıcılar, jelatin bulamacını her bir kuyucuğa aktarmak için ev yapımı bir şırınga oluşturabilir. Bu, altta sıkıştırılmış jelatin bulamacı içeren 50 mL'lik bir test tüpüne doğru boyutta bir şırınga pistonu eklenerek yapılabilir. Pistonu takarken, havanın kaçmasına yardımcı olmak için test tüpünün yanına küçük bir kılavuz tel yerleştirin ve ardından piston jelatin bulamacı ile temas ettiğinde çıkarın. Kullanmadan hemen önce, jelatin bulamacının dışarı çıkması için bir delik oluşturmak ve pistona bastırmak için test tüpünün ucunu bir tıraş bıçağıyla kesin. - Doldurulmuş 24 oyuklu plakayı biyoyazıcı tablasının ortasına yerleştirin ve tablaya sabitleyin.
NOT: Şekil 2'de genel bir biyoyazıcı kurulumu gösterilmektedir. 24 oyuklu bir plakayı platforma sabitlemek ve hareketi önlemek için baskı aşamasının etrafına bir lastik bant yerleştirin.
Şekil 2: Temel 3D biyo-baskı kurulumu. Biyoyazıcı, biyogüvenlik kabini gibi steril bir ortama kuruldu ve baskı kafası, cam şırınga ve iğne aşağıdaki destek banyosu baskı alanına dikey olarak indirilecek şekilde monte edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Hücre kültürü
NOT: Tüm adımları aseptik teknikler kullanarak bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
- HPAAF hücrelerini çözün (ticari olarak elde edilir, Malzeme Tablosuna bakın) ve bunları SmBM Bazal Ortam (CC-3181) ve tüm SmGM-2 SingleQuots takviyelerini (CC-4149) içeren T-75 doku kültürü ile muamele edilmiş plastik şişelerde genişletin üreticinin talimatlarına göre (bkz.
NOT: Yapışık hücreler için standart hücre kültürü protokolleri kullanılmalı, hücreler 37 °C ve %5CO2'de tutulmalı ve ortam birkaç günde bir yenilenmelidir. - HPAAF'ler ~% 80-90 birleşmeye ulaştığında, ortamı aspire edin ve hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.
- Her bir T-75 şişesine yaklaşık 4 mL önceden ısıtılmış %0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Tüm hücre kültürü yüzeyinin% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi ile kaplandığından emin olmak için şişeyi eğin. Şişeleri 37 °C'de 3-5 dakika inkübe edin ve hücre ayrılmasını kontrol edin.
- Hücreler yüzdükten sonra, her şişeye en az 6 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ekleyin ve hücreleri 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
- Hücreleri peletlemek için hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı hücre peletinden aspire edin ve hücreleri 1000 μL'lik bir pipet kullanarak FBS ile 1-3 mL ortamda yeniden süspanse ederek tek hücreli bir süspansiyon sağlayın.
- Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 10 μL Tripan Blue solüsyonu ekleyin ve iyice karıştırın. Ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak bir hemositometre içindeki hücreleri saymak için bu karışımın 10 μL'sini kullanın.
NOT: 4 x 106 hücre / mL nihai biyomürekkep konsantrasyonu elde etmek için, her 200 μL biyomürekkep için 800.000 fibroblast ayrıldı.
5. Hidrojel biyomürekkebin hazırlanması
NOT: Bioink preparatı Davis-Hall ve ark.5'ten uyarlanmıştır. 5.1-5.2 adımları, biyomürekkepte hücre toplama ve yeniden süspansiyon arasındaki süreyi en aza indirmek için 4.1-4.3 adımlarına paralel olarak tamamlanabilir. Adımları aseptik bir teknik kullanarak bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
- 0.2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak 20 mM tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP, Malzeme Tablosuna bakınız) pH 7 çözeltisi ve steril filtre hazırlayın. Kullanmadan hemen önce, çözelti pH'ını gerektiği gibi ayarlamak için 2 M KOH ve/veya 2 M HCl ekleyin. pH metre ile ölçün ve buna göre ayarlayın.
NOT: TCEP, disülfür bağlarını azaltır. - FBS'siz steril hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edilmiş 0.25 mg/mL'lik bir PEGαMA stok çözeltisi, 250-ditiyotreitol (DTT), MMP2-bozunur çapraz bağlayıcı ve CGRGDS (RGD) peptidinden oluşan 250 mM stok çözeltileri hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız), tümü 20 mM steril TCEP'de yeniden süspanse edin ve gerektiğinde pipetler kullanarak damıtılmış (DI) su içinde ağırlıkça %15 stok poli(etilen oksit) (PEO) çözeltisi hazırlayın.
- Kılavuz olarak Tablo 1'i takiben, PEGαMA, DTT, MMP2 ile parçalanabilen çapraz bağlayıcı, PEO, CGRGDS ve düşük serumlu hücre kültürü ortamının ihtiyaç duyduğu miktarları 50 mL'lik bir konik tüpte fibroblastlarla birleştirin.
NOT: Bu kombinasyon pH'ın 6.2'ye çok yakın olmasına neden olması gerektiğinden, hücre kültürü ortamı hariç hepsini ekledikten sonra pH'ın pH şeritleriyle kontrol edilmesi önerilir. Daha fazla pH ayarlaması gerekiyorsa, öncü çözeltinin pH'ını ayarlamak için ne kadar ek hacim gerektiğini takip edin. Kalan hücre kültürü ortamı hacmini eksi son pH ayarlaması sırasında eklenen herhangi bir hacmi ekleyerek toplam hacmi 200 μL'ye getirin. - Hücrelerin tek hücreli olduğundan emin olmak için pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanarak biyomürekkebi karıştırın ve 3D biyo-baskı sırasında baz katalizli polimerizasyonu önlemek için nihai öncü çözeltinin pH 6.2 olduğunu doğrulayın.
- Biyomürekkebi santrifüj tüpünden şırıngaya aktarmak için pistonu çıkararak ve 15 gauge 1.5" uzunluğunda kör iğne ucu ( Malzeme Tablosuna bakın) takılı ayrı bir şırınga kullanarak biyomürekkebi cam şırıngaya yükleyin, çözelti içinde hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin.
- Cam şırıngayı yazıcı kafasının içine yerleştirin ve her şey sıkıca monte edilecek ve baskıya hazır olacak şekilde yazıcı kafası bileşenlerini takın.
NOT: Bu noktada, yazıcı kafası içindeki cam şırınga, yazdırma için 30 gauge 0.5" uzunluğunda kör bir iğne ucuna sahip olmalıdır.
| Parça | Stok Çözelti Konsantrasyonu | Eklenecek Tutar |
| PEGαMA | 0.25 mg / ml | 140 μL |
| DTT (DTT) | 250 milyon | 12,24 μL |
| MMP2 Parçalanabilir Çapraz Bağlayıcı | 250 milyon | 5,25 μL |
| RGD (İngilizce) | 250 milyon | 1,6 μL |
| PEO (Halk Sağlığı T | ağırlıkça %15 | 33,33 μL |
| Aktivasyon Ortamı ve/veya pH Ayarlama Reaktifleri | - | 7,58 μL |
| Fibroblastlar | - | 800000 hücre |
Tablo 1: 200 μL biyomürekkep (hidrojel öncü çözeltisi ve fibroblast hücreleri) hazırlamak için gereken örnek hacimler.
6.3D Biyo-baskı
NOT: Tüm adımları aseptik teknikler kullanarak bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
- Pronterface yazılımındaki yön oklarını kullanarak, ekstrüzyon iğnesinin konumunu bir kuyunun ortasına ve destek banyosu bulamacı içinde manuel olarak ayarlayın. İğnenin ucunun altında en az 1 mm destek banyosu bulamacı bırakın.
NOT: Yazılım, iğnenin uzayda nerede olduğunu söyleme yeteneğine sahip değildir. Yazılım içindeki oklara manuel olarak tıklayarak iğneyi hareket ettirmek tamamen kullanıcıya kalmıştır (örneğin, yukarı oka tıklamak iğneyi baskı platformundan yukarı veya uzağa hareket ettirecektir, vb.). Kuyunun herhangi bir sınırına çarpmayacağından emin olmak için iğneyi dikkatlice hareket ettirin. - İğne ucu kuyu içindeki bulamacın ortasına yerleştirildikten sonra, Yüzey içindeki başlat düğmesine basın ve Şekil 3A'da gösterildiği gibi yapılara ulaşmak için baskının tamamlanmasını bekleyin.
NOT: Sağlanan dosyayı (Ek Dosya 1) kullanarak bir yapıyı biyolojik olarak yazdırmak yaklaşık 3 dakika sürecektir. İğneyi yönlendirmek ve hareket ettirmek ve ardından baştan sona bir yapıyı tamamen yazdırmak yaklaşık 5 dakika sürer. - İstenen biyolojik olarak basılmış yapıların sayısı karşılanana kadar 6.1-6.2 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Başarısız baskıları hesaba katmak için gerekenden daha fazla yapı yapılması önerilir. Arıza meydana gelirse, bir sonraki kuyuya geçin, her şeyi sıfırlayın ve 6.1-6.2 adımlarını tekrarlayın. - Kuyu plakasını oda sıcaklığında bırakın ve fototize edilebilir hidrojelin baz katalizli polimerizasyonuna izin vermek için baskı bittikten sonra 1 saat BSC'de örtün.
- 3D biyobaskılı yapılar içeren kuyu plakasını 37 ° C'lik steril bir inkübatöre yerleştirin ve destek banyosu bulamacını eritmek için 12-18 saat bekletin.
Şekil 3: Deneysel şematik. Bu protokol üç ana adımda tanımlanmıştır: (A) pulmoner vaskülatürü taklit etmek için gömülü hücrelere sahip 3D biyo-baskı PEGαMA içi boş tüpler. (B) Hücresel mikroçevreyi sertleştirmek için homopolimerizasyon reaksiyonunun foto başlatılması. (C) Proliferasyon ve aktivasyon için hücresel belirteçlerin değerlendirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
7.3D Biyobaskılı yapı kültürü ve fotoğraf sertleştirme
NOT: Tüm adımlar aseptik teknikler kullanılarak bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.
- 0,2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak PBS ve steril filtrede 2,2 mM lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP) (Malzeme Tablosuna bakınız) stok çözeltisi hazırlayın. LAP solüsyonunu ışıktan koruyun.
- 12-18 saat sonra, biyo-baskılı yapıları çevreleyen ortamı değiştirin. Ortamı ve erimiş jelatin destek banyosunu kuyucukların içinde manuel olarak çıkarın ve biyolojik olarak basılmış yapıları bozmamaya dikkat edin.
NOT: Plakayı 45°'lik bir açıyla tutarken ortamın yavaşça çıkarılması yararlıdır, böylece yapılar kuyu içinde ortaya çıkar ve görülebilir. Başarılı baskı ile her kuyucukta şeffaf bir hidrojel silindiri tanımlanmalıdır (Şekil 4A). - Her oyuğa uygun hacimde düşük serumlu ortam ekleyin.
NOT: 24 oyuklu bir plaka için, oyuk başına 700 μL ortam, biyo-baskılı yapıları tamamen kapsamalıdır. Gerektiği gibi ayarlayın. - Plakayı inkübatöre geri koyun ve numuneler üzerindeki ortamı her 3 günde bir veya deneysel tasarıma uygun olarak değiştirin.
- İstenen sertleşme zaman noktasından yirmi dört saat önce, numunelerden besiyerini çıkarın ve bunları 2,2 mM steril LAP ile desteklenmiş düşük serumlu besiyeri ile değiştirin.
NOT: Yapıyı floresan olarak etiketlemek için, PBS'de 10 μM metakriloksietil tiyokarbamoil rodamin B (bkz. Bir TRITC filtresi kullanarak fazla rodamin ve görüntüyü çıkarmak için 4 ° C'de 2 gün boyunca PBS'ye aktarın (Şekil 4B, C). - İstenilen sertleşme zaman noktasında, ortamın yarısını sertleştirilecek kuyucuklardan çıkarın ve plakayı kapağı kapalı olarak UV ışığı altına yerleştirin. UV ışığını açın ve Omnicure (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 365 nm bant geçiren filtre (Şekil 3B) kullanarak 5 dakika boyunca 10 mW/cm2 365 nm ışık uygulayarak bu yapıları sertleştirin.
NOT: Hücreleri UV ışığına maruz bırakmadan önce ışık yoğunluğunun doğru olduğunu doğrulamak için radyometreyi/fotometreyi kullanın. - Kalan ortamı bu oyuklardan çıkarın ve her oyuğa taze düşük serumlu ortam ekleyin. Plakayı inkübatöre geri koyun.
- Plakayı inkübatörden çıkarın ve 9. adımı takip ederek istenen zaman noktasında fibroblast aktivasyon çalışmasını gerçekleştirin.
Şekil 4: 3D biyo-baskılı hidrojel yapıları, zaman içinde hücre canlılığını destekledi. (A) 24 oyuklu bir plakada 3D baskılı hidrojel yapısının fotoğrafı. (B) Floresan etiketli PEGαMA 3D baskılı hidrojelin maksimum yoğunluk projeksiyonu. Ölçek çubuğu = 1 mm. Daha yüksek büyütme mikroskobu, FRESH biyo-baskı destek banyosunda jelatin mikropartiküller tarafından indüklenen hidrojel yapısındaki gözenekleri gösterdi. (C) Konfokal mikroskopta (maksimum yoğunluk projeksiyonu olarak görüntülenen 100 μm z-yığını) görüntülenen floresan etiketli sertleştirilmiş bölgelere sahip 3D baskılı PEGαMA tüpü, 3D'de sertleşme üzerinde uzamsal kontrol gösterdi. Ölçek çubuğu = 500 μm. (D) Canlı / Ölü tahlillerle ölçülen 3D biyobaskılı yapılarda HPAAF canlılığı. 300 μm kalınlığa ve 4 × 106 hücre/mL'ye sahip yapılar, her zaman noktasında diğer tüm koşullardan daha iyi performans gösterdi. Canlılık 7. günde zirveye ulaştı. Bu koşul ve zaman noktası gelecekteki deneyler için seçildi. Sütunlar ortalama ± SEM, n = 3'ü gösterir. *, p < 0.05, ANOVA, Tukey HSD. (E) 3D yapılardaki hücrelerin temsili konfokal görüntüleri, en yüksek genel canlılığa sahip zaman noktası olan 7. günde canlı/ölü reaktifle boyanmıştır. Calcein yeşil renkte canlı hücreler ve kırmızı renkte işaretlenmiş propidyum iyodür ölü hücreler olarak işaretlenmiştir. En sağdaki sütun, en iyi performans gösteren koşulun tek tip bir hücre dağılımına ve yüksek bir canlı hücre yüzdesine sahip olduğunu gösterir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Davis-Hall ve ark.5'in izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
8. Fibroblast canlılığının değerlendirilmesi
- İstenilen canlılık zaman noktalarında, kalsein ve propidyum iyodür kullanarak boyayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Özetlemek gerekirse, her kuyucuktan ortam çıkarılmalı ve yapılar steril PBS ile durulanmalıdır. Yapıları bir külbütör üzerinde 37°C'de 40 dakika boyunca canlı/ölü boyama solüsyonunda inkübe edin. Boyama çözeltisi, görüntüleme sırasında canlı veya ölü hücreleri tanımlamak için kalsein (1:1000 seyreltme) ve propidyum iyodür (1:1000 seyreltme) içermelidir. - Yapıları steril PBS'ye aktarın ve hemen bir konfokal floresan mikroskobunda görüntüleyin. Zaman noktası başına numune başına üç farklı 100 μm z-yığını görüntüsü elde edin ve canlılığı canlı hücrelerin ortalama yüzdesi olarak ifade edin (Şekil 4D,E).
9. Fibroblast aktivasyonunun değerlendirilmesi
- PBS'de% 3 w / v sığır serum albümini (BSA) ve% 0.1 v / v Tween 20 hazırlayın. Bu çözelti, immünofloresan (IF) çözeltisi olarak adlandırılacaktır.
- İstenilen zaman noktalarında, ortamı numune kuyucuklarından çıkarın ve yapıları PBS ile durulayın. PBS'yi %4 paraformaldehit (PFA) ile değiştirin ve bu numuneleri 37 °C'de 30 dakika külbütörde tutun. Ardından, PBS'de %4 PFA'yı 100 mM glisin ile değiştirin ve bu numuneleri 15 dakika daha oda sıcaklığında (RT) bir külbütörde bırakın.
- Daha sonra, bu numuneleri Tissue-Tek Kriyokalıplarına aktarın, numuneyi tamamen optimum kesme sıcaklığı (OCT) çözeltisi ile kaplayın (Malzeme Tablosuna bakın) ve OCT'nin 4 °C'de 12-18 saat boyunca numunelere yayılmasına izin verin.
- OCT ile ıslatılmış numuneleri sıvı nitrojen kullanarak 2-metilbütan içinde hızlı dondurun. Bir strafor kutuyu veya başka bir uygun kabı sıvı nitrojenle doldurun ve ardından sıvı nitrojenin içine 2-metilbütan ile dolu ikinci bir kap yerleştirin, böylece en az yarısına kadar suya batırılır. OCT kaplı bir numune içeren her bir kriyokalıbı, gözle görülür şekilde donana kadar sıvı nitrojen soğutmalı 2-metilbütan içinde tutmak için forseps kullanın. Bu numuneler, kriyoseksiyon için hazır olana kadar -80 °C'de saklanabilir.
DİKKAT: Sıvı nitrojenle çalışırken soğuk koruyucu eldivenler, soğuk koruyucu önlük ve Kriyojenik Güvenlik Kitinde (Malzeme Tablosuna bakın) sağlanan yüz siperi gibi kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanılmalıdır. - Donmuş OCT numunelerini -22 °C'de kriyoseksiyon yapın ve 10 μm kalınlığında dilimleri pozitif yüklü cam mikroskop slaytlarına ekleyin. Her 3D hidrojel numunesi için slayt başına en az 5-3 kriyoseksiyon içeren üç mikroskop lamı hazırlayın.
NOT: Mikroskop lamları, gerekirse durma noktası olarak bu noktada -80 °C'de saklanabilir. - Kriyoseksiyonların slaytlara yapışmasına yardımcı olmak için kriyoseksiyonları buz gibi soğuk asetonda 15 dakika sabitleyin. Kalan OCT'yi çıkarmak için kriyoseksiyonları RT suyuyla nazikçe durulayın. Bu numunelerin kurumasını bekleyin ve kriyoseksiyonları hidrofobik bir kalemle çizin (bkz.
- Numuneleri oda sıcaklığında PBS'de %0,2 v/v Triton X-100 ile 10 dakika geçirgen hale getirin ve ardından RT'de 1 saat boyunca PBS'de %5 BSA w/v içeren bölümleri bloke edin.
- Birincil fare anti-insan alfa düz kas aktin (αSMA) antikorunu (1:250 seyreltme) (Malzeme Tablosuna bakınız) IF çözeltisine ekleyin. Bu kesitli numuneleri üzerlerinde primer antikor ile gece boyunca 4 °C'de saklayın. Numuneleri 3x IF solüsyonu ile durulayın.
- İkincil keçi anti-fare Alexa Fluor 555 antikoru (1:250 seyreltme) ve mililitre IF çözeltisi başına iki damla ActinGreen 488 ReadyProbe (Malzeme Tablosuna bakınız) içeren IF çözeltisindeki bölümleri inkübe edin. Sonraki tüm adımlar için numuneleri ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün ve ikincil antikor solüsyonunun RT'de 1 saat boyunca numuneler üzerinde kalmasına izin verin.
- Bölümleri 3x IF solüsyonu ile durulayın. RT'de 300 dakika boyunca DI suyunda 300 nM 4',6-diamidino-2-filindol (DAPI) içinde 15 dakika inkübe edin.
- 10 μL'lik ticari olarak temin edilebilen bir antifade reaktifi kullanarak (bkz . Malzeme Tablosu), standart yöntemler kullanarak bölümleri kaplayın.
NOT: Monte edilen slaytlar, görüntüleme için gerekli olana kadar -80 °C'lik bir dondurucuda ışıktan korunarak saklanabilir. - Bir floresan mikroskobu kullanarak kriyoseksiyonları görüntüleyin (Şekil 3C ve Şekil 5B). 10x hedef kullanarak slayt başına rastgele üç bölüm görüntüleyin.
NOT: Görüntüler DAPI, FITC ve TRITC kanallarında çekilmelidir. - Görüntüleri ImageJ'ye (NIH) yükleyin. Fibroblast aktivasyonunun bir ölçümü olarak αSMA pozitif hücrelerin yüzdesini ölçün (Şekil 5A), toplam αSMA pozitif hücre sayısını her görüş alanı için toplam hücre çekirdeği sayısına bölerek.
Şekil 5: Pulmoner arteriyel adventitinin 3D biyobaskılı modellerinde fibroblast aktivasyonu . (A) αSMA ekspresyonu ile ölçülen yumuşak ve sertleştirilmiş 3D hidrojellerde fibrotik aktivasyon. Sertleştirilmiş yapılardaki HPAAF'ler, αSMA için yumuşak yapılardaki hücrelere göre önemli ölçüde daha pozitifti. Sütunlar ortalama ± SEM'i temsil eder, n = 3. *, p < 0.05, Mann-Whitney U testi. (B) Yumuşak ve sertleştirilmiş 3D hidrojellerde αSMA, aktin ve DAPI için immün boyamanın temsili konfokal görüntüleri. Sertleştirilmiş yapılardaki HPAAF'ler, yumuşak yapılardaki hücrelerden daha yaygın αSMA immünofloresan gösterdi. Ölçek çubuğu = 250 μm. (C) EdU pozitifliği ile ölçülen yumuşak ve sertleştirilmiş 3D biyobaskılı yapılarda fibroblast proliferasyonu. Sertleştirilmiş yapılardaki HPAAF'ler, EdU için yumuşak yapılardaki hücrelerden önemli ölçüde daha pozitifti. Sütunlar ortalama ± SEM'i temsil eder, n = 3. *, p < 0.05, Mann-Whitney U testi. (D) Yumuşak ve sertleştirilmiş 3D hidrojellerde EdU ve Hoechst boyası için immün boyamanın temsili konfokal görüntüleri. Sertleştirilmiş yapılardaki HPAAF'ler, yumuşak yapılardaki hücrelerden daha yaygın EdU immünofloresan gösterdi. Ölçek çubuğu = 300 μm. Davis-Hall ve ark.5'in izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
10. Fibroblast proliferasyonunun değerlendirilmesi
- İstenen bir proliferasyon zaman noktasından yirmi dört saat önce, her bir oyuktan hücre kültürü ortamını çıkarın ve ticari olarak temin edilebilen hücre proliferasyon kitinden 10 μM EdU çözeltisi ile desteklenmiş düşük serum ortamı ile değiştirin (bkz. Gece boyunca inkübasyon için numuneleri inkübatöre geri koyun.
- İstenilen proliferasyon zaman noktasında, EdU ile inkübe edilen numuneleri %4 PFA kullanarak 37 °C'de 30 dakika boyunca bir külbütör üzerinde sabitleyin. PBS'de %4 PFA çözeltisini 100 mM glisin ile değiştirin ve numuneleri 37 °C'de en az 15 dakika inkübe edin. Hoechst'i 30 dakika boyunca uygun bir konsantrasyonda ekleyin ve ardından yapıları 2x PBS ile durulayın.
NOT: Numuneler, görüntülemeye kadar 4 °C'de ışıktan korunarak saklanabilir. - Bir floresan mikroskobu ve önerilen hücre proliferasyon kiti üretici ayarları ve filtreleri kullanarak tüm sabit ve depolanmış EdU örneklerini görüntüleyin (Şekil 3C ve Şekil 5D). Örnek başına üç farklı 100 μm z-yığını görüntüsü elde edin ve bu z-yığınlarının her birinden maksimum projeksiyonlar oluşturun. EdU-pozitif hücrelerin sayısını sayarak ve maksimum projeksiyon görüntülerinde Hoechst karşı lekesi ile tanımlanan toplam hücre sayısına bölerek HPAAF proliferasyonunu ölçün (Şekil 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, insan dokularını taklit eden geometrilerde fibroblast aktivasyonunu incelemek için dinamik ve zamansal sertleştirme yeteneğine sahip yapılar oluşturmak için bir destek banyosu içinde fototize edilebilir hidrojellerin 3D biyo-baskısının nasıl yapılacağını açıklar. İlk olarak, protokol, bu fototable polimer sisteminin omurgası olan PEGαMA'nın nasıl sentezleneceğini açıkladı. Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ölçümleri, %96.5'te başarılı PEGαMA işlevselleştirmesi gösterdi (Şekil 1). Bu yordam için %90 veya daha yüksek işlevselleştirme değerleri kabul edilebilir. Daha sonra, pulmoner vaskülatürü taklit etmek için içi boş bir silindirin 3D CAD modelinin nasıl oluşturulacağına ilişkin ayrıntılar sunulmaktadır. İndirilebilir bir 3D CAD modeli Ek Dosya 1'de sağlanırken, bu tasarım için ilgili G kodu Ek Dosya 2'de mevcuttur. Bu CAD modeli, aşağıdaki boyutlara sahip yapılar üretti: 4 mm yükseklik, 4 mm iç çap ve 300 μm et kalınlığı.
Biyoyazıcıyı kurma talimatları sunulmuştur (Şekil 2). Baskı kafasının güvenli bir şekilde monte edilmesi ve cam şırınga ve iğnenin biyomürekkebi doğrudan aşağıdaki destek banyosunu içeren bir kuyuya akıtması için sabitlemek kritik bir adımdır (Şekil 2 ve Şekil 3A). Tablo 1, biyomürekkep bileşenleri için stok konsantrasyonlarını hazırlamak için gereken bilgileri ve bu çalışmalar boyunca kullanılan biyomürekkep bileşimini temsili sonuçlar olarak elde etmek için birleştirilecek doğru hacimleri sağlar. Nihai biyomürekkep formülasyonu, 70:30 DTT:MMP2-bozunur çapraz bağlayıcılar, 2 mM CGRGDS ve ağırlıkça %2,5 PEO'nun 0,375 molar oranı (αMA:tiyol) ile ağırlıkça %17,5 PEGαMA idi. Bu reaksiyon, sistin üzerindeki serbest bir tiyol ile bir αMA parçası arasındaki bir reaksiyon yoluyla hidrojel ağı içindeki CGRGDS peptidini kovalent olarak bağlar. Biyomürekkep ve destek banyosu bulamaç çözeltilerinin pH'ı sırasıyla 6.2 ve 9 değerlerine ayarlandı. Asidik bir biyomürekkep ve bazik destek banyosu bulamacının bu kombinasyonu, 3D biyo-baskılı yapıların polimerizasyonunu kolaylaştırdı ve silindirik yapıları korudu (Şekil 4A-C). 7. günde hücrelerin %91 ± %2'si canlı olarak boyandı ve 14. günde %85 ± %3'ü hala canlıydı (ortalama ± SEM, ANOVA, Tukey HSD) ve p < 0.05 ile istatistiksel olarak anlamlıydı (Şekil 4D,E).
Son olarak, bu protokol, reaksiyona girmemiş αMA kısımları ile ikincil polimerizasyon reaksiyonunun foto başlatılması (Şekil 3B) yoluyla 3D biyobaskılı yapıların nasıl sertleştirileceğini detaylandırdı. Davis-Hall ve ark. paralel plaka reolojisi yoluyla, 3D biyo-baskılı yapıların 4.7 ± 0.09 kPa'lık bir başlangıç elastik modülüne sahip olduğunu ve foto-başlatılan sertleşmeden sonra 12.8 ± 0.47 kPa'ya yükseldiğini gösterdi5. Fibroblast aktivasyonu, alfa düz kas aktinini (αSMA) eksprese eden fibroblastların sayısı ölçülerek 7. günde değerlendirildi. Sertleştirilmiş hidrojel yapılar içindeki fibroblastların daha büyük bir yüzdesi (% 88 ± 2), yumuşak örneklere (% 65 ± 4) kıyasla (ortalama ± SEM, Mann-Whitney U testi) p < 0.05 istatistiksel anlamlılık ile aktive edildi (Şekil 5A, B). Benzer şekilde, sertleşmiş yapılardaki fibroblastların %66 ± 6'sı, yumuşak durumdaki fibroblastların %39 ± %6'sına kıyasla bir proliferasyon belirteci olan EdU için pozitifti (ortalama ± SEM, Mann-Whitney U testi) istatistiksel anlamlılığı p < 0.05 idi (Şekil 5C,D). Birlikte, bu sonuçlar, sertleştirilmiş bir mikro çevrenin, 3D biyo-baskılı modellerde fibrotik aktivasyon belirteçlerini önemli ölçüde arttırdığını desteklemektedir.
Ek Dosya 1: Bilgisayar destekli tasarım (CAD) dosyası. Dosya, 4 mm yüksekliğinde, 4 mm iç çapı ve 300 μm kalınlığında bir silindir geometrisi içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: G kodu dosyası. Eğe, 4 mm yüksekliğinde, 4 mm iç çapı ve 300 μm kalınlığında silindir geometrisi ile ilişkilidir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kontrollü ışığa maruz kalmaya yanıt olarak çift aşamalı polimerizasyon reaksiyonları, biyomalzemeleri uzamsal ve zamansal kontrol ile sertleştirebilir. Çeşitli platformlarda hücre-matris etkileşimlerini değerlendirmek için bu tekniği kullananbirkaç çalışma vardır 5,8,9,10,11,21,22,23. Daha spesifik olarak, fotomaskeler veya iki foton uyarma yöntemleri, 3D biyo-baskılı bir yapının ayrık bölümlerini sertleştirmek ve hücrelerin önceki yayınlarımızda açıklandığı gibi sınırlı alanlarda veya arayüzlerde dinamik sertleşmeye nasıl tepki verdiğini araştırmak için kullanılabilir 5,8. Hücre tepkilerini değerlendirmek için anlamlı zaman noktaları seçmek çok önemlidir. Burada, aktivasyon çalışmalarını mümkün kılmak için fibroblastların MMP ile parçalanabilen fototable hidrojel içinde yayılmasına izin verildikten sonra yapılar sertleştirildi8. Bu protokol, fototize edilebilir bir hidrojel biyomürekkebinin nasıl geliştirileceğini ve pH katalizli bir polimerizasyon reaksiyonu başlatan biyomürekkep ve destek banyosu kombinasyonunu kullanarak 3D biyobaskılı yapıların nasıl oluşturulacağını detaylandırır. Pulmoner vaskülatürü taklit etmek için tasarlanmış farklı geometrilere sahip 3D biyobaskılı yapıların polimerizasyonu, asidik biyomürekkebin bazik destek banyosu bulamacına ekstrüde edilmesiyle kolaylaştırıldı. İn vivo doku sertleştirmesi, fibrozisin ayırt edici bir özelliğidir ve hücresel mikro çevredeki mekanik değişikliklerin hastalığın ilerlemesinin güçlü itici güçleri olduğu yaygın olarak bilinmektedir 10,23,24,25. Bu nedenle, bu protokol ve platform, fibrotik patogenezde yer alan mekanosensitif hücresel mekanizmalar hakkında önemli ayrıntılar sağlamada muazzam bir potansiyele sahiptir. Yapı geometrisini ve özelliklerini değiştirme, sertleşmeyi başlatmak için belirli zaman noktalarını belirleme ve biyomürekkebe hangi tip hücrelerin dahil edileceğine karar verme yeteneği bu yöntemin yadsınamaz faydalarıdır. Bu değişkenler, diğer pH katalizli biyomalzemeleri ve diğer biyolojik uygulamalarla ilgili mikroçevresel sertleşmenin etkilerini incelemek için uyarlanabilir.
PEGαMA, poli(etilen glikol) metakrilat (PEGMA)5,8,9 gibi yaygın olarak kullanılan diğer çift aşamalı polimerizasyon sistemlerinden hidrolitik olarak kararlı ve daha reaktif olduğu için biyomürekkep omurgası olarak seçilmiştir. Adventisyel fibroblastların hücre dışı mikroçevreyi yeniden şekillendirmek için MMP2 endopeptidazları üretmesine izin vermek için bir çapraz bağlayıcı olarak bir MMP2 bozunur peptit dizisidahil edildi 26. Grubumuz ve diğerleri, hücrede parçalanabilen çapraz bağlayıcının varlığının fibroblast yayılımını iyileştirdiğini ve aktivasyon için gerekli bir özellik olduğunu göstermiştir 5,27. Yüksek PEGαMA işlevselleştirmesi, özellikle reaksiyona girmemiş αMA grupları tıklama kimyası özelliğini etkinleştirdiğinden, bu protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. %95'in üzerinde işlevselleştirmeye sahip PEGαMA en iyisidir, ancak %90 işlevselleştirilmiş PEGαMA bu protokolle çalışmıştır. PEGαMA'nın işlevselleşmesi istenenden düşükse, özellikle yüksek hücre yoğunluğu olduğunda tutarsız polimerizasyona neden olabilir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, hücre peletinin hacminin hesaba katılması ve bu hacmin Tablo 1'de eklenen hücre kültürü ortamının ve pH ayarlama reaktiflerinin hacminden çıkarılması önerilir. Destek banyosundaki hava cepleri, şırıngadaki erken polimerizasyon veya yukarıda açıklanan çeşitli çözeltilerin yanlış pH değerleri, bu protokolde gözlemlenen diğer yaygın arıza mekanizmalarıdır.
Biyomürekkep ve destek banyosu pH'larında ayarlamalar, partiden partiye varyasyonu veya zaman içinde pH'daki değişiklikleri hesaba katmak için her deney için ayrı ayrı yapılmalıdır. Örneğin, bu biyomürekkep bileşenlerini belirli PEGαMA partileriyle yeniden süspanse etmek için pH 7 TCEP kullanıldığında, genel biyomürekkep pH'ının 6,2 yerine 7-7,5'e yakın ayarlanması gerekiyordu. Önceki çalışmalar, 6.2-9 arasında değişen pH ayarlı ortama maruz kalan fibroblastların bu pH değişikliklerine dayanabileceğini ve canlılığı koruyabileceğini göstermektedir5. Ek olarak, önceki çalışmalar, hidrojelleri içine gömülü hücrelerle polimerize etmek için kullanılan kontrollü UV ışığına maruz kalmanın hücre canlılığı üzerinde minimum etkiye sahip olduğunu ve fibroblast transkriptomunudeğiştirmediğini göstermiştir 8,9,10,28. Bununla birlikte, düşük hücre canlılığı ölçülürse, pH ayarlaması bu sorunu çözmek için atılan ilk adım olmalıdır. pH'ın hücre canlılığı 5,9,29 üzerinde önemli bir etkisi olduğu iyi bilinmektedir, bu nedenle kullanıcılar, pH ayarlamalarına daha duyarlı olabilecek belirli hücre dizileriyle benzer canlılık testleri yapmalıdır. Ek olarak, büyük ölçekli deneylere başlamadan önce, bu protokoldeki herhangi bir sapmanın küçük parti boyutlarıyla test edilmesi önerilir.
Şu anda, şirket içi biyo-yazıcı yalnızca bir ekstrüzyon baskı kafasına sahiptir ve iğneyi manuel olarak yönlendirmek ve her numune için yazdırma komutları vermek için önemli ölçüde zaman alan kullanıcı girişi gerektirir. Ticari olarak temin edilebilen biyoyazıcılar30,31,32 bu sınırlamaları ele alır, ancak önemli ölçüde daha pahalıdır. Gelecekteki çalışmalar, üç farklı pulmoner damar katmanını (tunica intima, tunica media ve tunica adventitia) yeniden oluşturmak için farklı bir hücre tipi içeren çok katmanlı yapılar basmayı amaçlamaktadır. Başkaları tarafından yapılan çalışmalar, fototize edilemeyen malzemelerle yapılan bu biyo-baskı tekniğinin, kan damarı yapılarını ve tüm insan kalbini bölmek de dahil olmak üzere gelişmiş ve geometrik olarak karmaşık modeller üretebileceğini kanıtlıyor 6,7,20,33. Bu protokolde sağlanan yöntemler çeşitli biyoyazıcılar ile çoğaltılabilir. Bu, araştırmacıların pH katalizli polimerizasyon reaksiyonlarına maruz kalan çeşitli malzemeleri 3D biyo-baskı yapmalarını ve herhangi bir sayıda doku homeostazı, hastalık ve onarım modelini tasarlamalarını sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur. Bu makalenin bazı bölümleri GİB Yayıncılık https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf'nin izniyle © çoğaltılmıştır. 5 Tüm hakları saklıdır.
Acknowledgments
Yazarlar, Dr. Adam Feinberg'e (Carnegie Mellon Üniversitesi) ve 3D Biyobaskı Açık Kaynak Çalıştayı'na ev sahipliği yapanlara teşekkür eder. Bu kişiler, FRESH biyobaskı tekniklerini öğrenmeyi ve bu çalışmalar için kullanılan 3D biyoyazıcıyı oluşturmayı mümkün kıldı. Ek olarak, yazarlar bu yazıda figürler üretmek için kullanılan Biorender.com teşekkür etmek isterler. Bu çalışma, Rose Community Foundation (DDH ve CMM), Colorado Pulmoner Vasküler Hastalık Araştırma Ödülü (DDH ve CMM), Ödül 1941401 kapsamındaki Ulusal Bilim Vakfı (CMM), W81XWH-20-1-0037 (CMM) Ödülü altındaki Ordu Departmanı, R21 CA252172 Ödülü (CMM) kapsamında NIH Ulusal Kanser Enstitüsü, Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp Kampüsü'ndeki (DDH ve CMM) Ludeman Aile Kadın Sağlığı Araştırmaları Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) ve T32 HL072738 (DDH ve AT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
References
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
- Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
- Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
- Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
- Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
- Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
- Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904 (2021).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
- Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792 (2012).
- Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2 (2014).
- Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
- Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
- Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
- Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387 (2016).
- Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
- Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H.
- Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
- Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
- Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
- Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
- Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758 (2023).
- Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871 (2023).
- Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550 (2023).
- Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047 (2022).
